Summary
Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.
Abstract
De signalering en functie van een cel worden bepaald door de dynamische structuren en interacties van de oppervlaktereceptoren. Om de structuur-functie relatie van deze receptoren in situ echt te begrijpen, moeten we ze visualiseren en volgen op het levende celoppervlak met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier laten we zien hoe we recent ontwikkelde Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) kunnen gebruiken om T-celreceptoren (CDR's) vierdimensionaal (4D, ruimte en tijd) te beelden in het levende celmembraan. T-cellen zijn een van de belangrijkste effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem, en hier gebruikten we T-cellen als voorbeeld om aan te tonen dat de signalering en functie van deze cellen worden aangedreven door de dynamiek en interacties van de CVR's. LLSM zorgt voor 4D-beeldvorming met een ongekende spatiotemporale resolutie. Deze microscopietechniek kan daarom over het algemeen worden toegepast op een breed scala aan oppervlakte- of intracellulaire moleculen van verschillende cellen in de biologie.
Introduction
De precieze dynamiek van moleculen die in realtime op het driedimensionale celoppervlak worden verhandeld en verspreiden, is een raadsel om op te lossen. Microscopie is altijd een evenwicht geweest tussen snelheid, gevoeligheid en resolutie; als een of twee worden gemaximaliseerd, wordt de derde geminimaliseerd. Daarom, als gevolg van de kleine omvang en immense snelheid waarmee oppervlaktereceptoren bewegen, is het volgen van hun dynamiek een grote technologische uitdaging gebleven op het gebied van celbiologie. Bijvoorbeeld, veel studies zijn uitgevoerd met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie1,2,3, die een hoge temporele resolutie heeft, maar kan alleen beeld een zeer dun deel van de T-cel membraan (~ 100 nm), en mist daarom gebeurtenissen gebeurt verder weg in de cel. Deze TIRF-beelden tonen ook alleen een tweedimensionaal gedeelte van de cel. Super-resolutie technieken, zoals stochastische optische reconstructie microscopie (STORM)4, fotoactivated lokalisatie microscopie (PALM)5, en gestimuleerd emissie-uitputting microscopie (STED)6, kan overwinnen van de Abbe diffractie limiet van het licht. Deze technieken hebben een hoge ruimtelijke resolutie (~ 20 nm resolutie)4,5,6,7, maar ze nemen vaak vele minuten om een volledige twee-dimensionale (2D) of driedimensionaal (3D) beeld te verwerven, en dus de temporele resolutie verloren gaat. Bovendien kunnen technieken zoals STORM en PALM die afhankelijk zijn van knipperende signalen onnauwkeurigheden hebben bij het tellen van8,9. Elektronenmicroscopie heeft veruit de hoogste resolutie (tot 50 uur resolutie)10; het kan zelfs driedimensionaal worden uitgevoerd met gerichte ionenbundelscanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM), wat resulteert in maximaal 3 nm XY en 500 nm Z resolutie11. Echter, elke vorm van elektronenmicroscopie vereist harde monstervoorbereiding en kan alleen worden uitgevoerd met vaste cellen of weefsels, waardoor de mogelijkheid van beeldvorming van levende monsters na verloop van tijd.
Technieken om de hoge spatiotemporale resolutie te verkrijgen die nodig zijn om de dynamiek van oppervlakte- en intracellulaire moleculen in levende cellen in hun ware fysiologische 3D-natuur te identificeren, worden pas onlangs ontwikkeld. Een van deze technieken is Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, die gebruik maakt van een gestructureerd lichtvel om het bleken van foto's drastisch te verlagen. Ontwikkeld in 2014 door Nobelprijswinnaar Eric Betzig, de hoge axiale resolutie, lage fotobleken en achtergrondgeluid, en het vermogen om tegelijkertijd beeld honderden vliegtuigen per gezichtsveld maken LLS microscopen superieur aan widefield, TIRF en confocale microscopen12,13,14,15,16,17,18,19. Deze vierdimensionale (x, y, z en tijd) imaging techniek, terwijl nog steeds diffractie beperkt (~ 200 nm XYZ resolutie), heeft een ongelooflijke temporele resolutie (we hebben een framerate van ongeveer 100 fps bereikt, wat resulteert in een 3D gereconstrueerdcelbeeld met 0,85 seconden per frame) voor 3D ruimtelijke acquisitie.
LLSM kan over het algemeen worden gebruikt om real-time dynamiek van elke moleculen in een cel op het eenmolecuul en eencellige niveau te volgen, met name die in zeer motile cellen zoals immuuncellen. We laten hier bijvoorbeeld zien hoe we LLSM kunnen gebruiken om t-cell receptor (TCR) dynamica te visualiseren. T-cellen zijn de effectorcellen van het adaptieve immuunsysteem. CDR's zijn verantwoordelijk voor de erkenning van peptide-MHC (pMHC) liganden weergegeven op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen (APC), die de selectie, ontwikkeling, differentiatie, lot en functie van een T-cel bepaalt. Deze herkenning vindt plaats op de interface tussen T-cellen en APC's, wat resulteert in gelokaliseerde receptorclustering om de zogenaamde immunologische synaps te vormen. Hoewel het bekend is dat CVR's bij de immunologische synaps noodzakelijk zijn voor t-cel effector functie, nog onbekend zijn de onderliggende mechanismen van real-time TCR-handel naar de synaps. LLSM heeft ons in staat gesteld om in real time de dynamiek van CVR's voor en na de handel naar de synaps te visualiseren met de resulterende pMHC-TCR-interactie(figuur 1). LLSM kan daarom worden gebruikt om actuele vragen van de vormende dynamiek van CVR's op te lossen en inzichten te verschaffen om te begrijpen hoe een cel onderscheid maakt tussen zelf- en vreemde antigenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5C. C7 TCR-transgene RAG2 knock-out muizen in B10. Een achtergrond werden gebruikt in deze studie volgens een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Chicago.
1. T-cellen oogsten en activeren
OPMERKING: Dit deel van het protocol is gebaseerd op eerdere protocollen. Zie citaten voor meer details20,21.
- Euthanaseren een 10-12 week oude 5C. C7 transgene muis van beide geslachten (~20-25 g) volgens het goedgekeurde IACUC-protocol (d.w.z. CO2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie).
- Spray muis karkas grondig met 70% ethanol te weken vaststelling van de vacht en te brengen in een BSL-2 veiligheidskast.
- Draai de muis aan de rechterkant en maak een kleine incisie in de lichaamsholte met een chirurgische schaar. Verwijder de milt met behulp van chirurgische tangen. Snijd bindweefsel weg als dat nodig is met een chirurgische schaar.
- Plaats de milt in een 70 μm-porie mesh cel zeef en pureer met de achterkant van een 1 mL spuitzuiger. Was door de zeef grondig met volledige RPMI (RPMI met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine, 50 μM 2-mercaptoethanol).
- Centrifugeer de eencellige suspensie van splenocyten op 300 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg.
LET OP: De pellet op dit punt zal rood zijn. - Resuspend de splenocyten in 5 mL RBC lysis buffer. Incubeer gedurende 5 min en blus vervolgens met 5 mL complete RPMI.
- Centrifugeer de eencellige suspensie van splenocyten op 300 x g gedurende 5 min. Gooi de supernatant weg.
LET OP: De pellet op dit punt moet wit zijn, niet rood. - Resuspend de pellet in 5 mL van volledige RPMI.
- Breng over op een T-25-kolf en voeg 10 μM mottencytochroom-C (MCC, sequentie ANERADLIAYLKQATK) toe. Zet de cellen in een celkweekincubator op 37 °C, 5% CO2 's nachts.
- Voeg de volgende dag de recombinant muis IL-2 toe aan een uiteindelijke concentratie van 100 U/mL.
- Let op de volgende dagen, het toevoegen van verse media als de huidige media geel wordt. T-cellen zullen sterven als links in gele media onbeheerd voor meer dan 48 uur. Cellen zijn klaar om te gebruiken 6-10 dagen na de oogst.
2. Cellen voorbereiden
- Incubeer 5 mm ronde coverslips met 0,1% poly-L-lysine gedurende 10 min. Aanzuigen en op natuurlijke wijze laten drogen.
- Gebruik een kleuringsgradiëntreagenagen (zie de tabel met materialen)om dode cellen te scheiden en om 1 x 106 T-cellen en 1 x 106 APC's (CH27-cellen21,22 transduced met cytosolic mCherry) afzonderlijk te verkrijgen.
OPMERKING: Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer.- Voeg 3 mL gradiëntrea toe aan een conische buis van 15 mL en voeg cellen dropwise aan de rand van de buis voorzichtig toe. Niet mengen. Centrifugebij 930 x g gedurende 10 min bij 4 °C; versnelling/vertraging gebruiken: LANGZAAM/LANGZAAM. Verwijder de dunne middelste laag cellen tussen de volledige media en de dichtheid gradiënt reagens zorgvuldig, waardoor elk celtype in afzonderlijke conische buizen.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om meer cellen voor te bereiden dan nodig is voor beeldvorming, omdat we merken dat 50% gemiddeld verloren gaat tijdens het proces. Hoe meer cellen worden gebruikt voor het proces, hoe makkelijker het is om ze te oogsten uit de dichtheid gradiënt. We gebruiken 4-8 mL van beide celtypen om overtollige cellen te garanderen. Indien gewenst kunnen cellen vóór deze stap worden geteld om ervoor te zorgen dat het benodigde volume nodig is. Eventuele extra cellen worden terug gezet in hun respectieve kolven. - Was beide buizen van T-cellen en CH27 cellen drie keer met 5 mL complete RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi de supernatant elke keer tijdens de was. Bredig elke buis in 1 mL complete RPMI en tel cellen door een hemocytometer.
- Voeg 3 mL gradiëntrea toe aan een conische buis van 15 mL en voeg cellen dropwise aan de rand van de buis voorzichtig toe. Niet mengen. Centrifugebij 930 x g gedurende 10 min bij 4 °C; versnelling/vertraging gebruiken: LANGZAAM/LANGZAAM. Verwijder de dunne middelste laag cellen tussen de volledige media en de dichtheid gradiënt reagens zorgvuldig, waardoor elk celtype in afzonderlijke conische buizen.
- Bredig 1 x 106 APC's opnieuw op in 500 μL complete RPMI en voeg 10 μM MCC toe. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C, 5% CO2. Was cellen drie keer met 500 μL complete RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi de supernatants weg.
- Bredig 1 x 106 T cellen opnieuw in 500 μL complete RPMI. Voeg 2 μg anti-TCRβ Alexa488-gelabelde Fab (kloon H57) toe aan 500 μL cellen. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C, 5% CO2. Was cellen drie keer met 500 μL volledige RPMI (300 x g voor 5 min). Gooi supernatant na elke wasbeurt.
OPMERKING: De divalent anti-TCR antilichaam werd gesneden in monovalent Fab met behulp van een Fab voorbereiding kit (zie de Tabel van Materialen)om te voorkomen dat crosslinking van de T-cel receptoren door de divalent antilichaam (deze stap is optioneel). - Schorsbeide celtypen in 500 μL imaging media (fenol roodvrij Leibovitz's L-15 medium met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine).
3. Het uitvoeren van LLSM Dagelijkse Uitlijning
OPMERKING: (Belangrijk) Dit uitlijningsprotocol is gebaseerd op het gebruikte LLSM-instrument (zie de tabel met materialen). Elke LLSM kan anders zijn en vereisen verschillende uitlijning strategieën, vooral die zijn home-built. De juiste routine-uitlijning uitvoeren en doorgaan naar punt 4.
- Voeg 10 mL water plus 30 μL fluoresceine (1 mg/mL voorraad) toe aan het LLSM-bad (~10 mL volume), druk op Image (Home) om het doel naar de beeldpositie te verplaatsen en kijk naar een enkel Bessel-laserstraalpatroon. Lijn de laserstraal uit met behulp van de geleiders en vooraf ingestelde interessegebied (ROI) om de straal in alle richtingen in balans te maken.
- De balk moet ook verschijnen gericht in de finder camera. Gebruik twee spiegel kantelverstellingen, bovenste micrometer, focus, en emissie objectieve kraag aan te passen. Zie figuur 2A,B voor correct uitgelijnde straal.
- Was het bad en de doelstellingen met ten minste 200 mL water om fluoresceine volledig te verwijderen.
- Beeldstandaard fluorescerende kralen in de beeldmedia (bereid door kralen vast te houden aan een 5 mm coverslip met poly-L-lysine, zie de Tabel met materialen; dit kan vooraf worden voorbereid en opnieuw worden gebruikt) voor fysieke point spread functie (PSF) in beeldmedia.
OPMERKING: Er kan slechts één kraal in beeld zijn voor latere verwerking, dus probeer een kraal te vinden die op zichzelf in de kijker staat of gemakkelijk kan worden bijgesneden om een enkele kraal te verkrijgen.- Zet dither aan door in te stellen op 3 in de vak 'X Galvo range'. Druk op Live om het huidige veld te bekijken. Beweeg langs de Z-richting om de cover slip en kralen te vinden. Zoek het midden van een kraal door langs Z te bewegen, druk op Stoppen om de laser te pauzeren. Controleer 3D,druk op Centrum en druk op Uitvoeren. Dit verzamelt de gegevens.
- Pas handmatig de kantelspiegel, objectieve kraag en focusmicrometer aan voor de hoogste grijze waarden en pas deze zo nodig aan om de juiste patronen te verkrijgen voor objectieve scan, z galvo, z+objective (totPSF) en samplescan (samplePSF) capture modes. Zie figuur 2C-F voor goed afgestelde maximale intensiteitsprojecties (MIP's).
OPMERKING: De verschillende vangtmodi (objective scan, z galvo, z+objective en sample scan) veranderen hoe het lichtblad door het monster beweegt. Alle scanmodi moeten worden gebruikt voor uitlijning. - De voorbeeldscan laat zien hoe gegevens tijdens het experiment worden verzameld. Verzamel het voorbeeld PSF door op Uitvoeren in de voorbeeldscanmodus voor deskewing en deconvolutie te drukken (zie punt 5). Wijzig lasers in drie kleurmodus (488, 560, 647) en druk nogmaals op Uitvoeren.
OPMERKING: Aangezien de LLSM-beelden onder een hoek (57,2°) worden gemaakt, worden beelden die zijn vastgelegd in de "sample scan"-modus onder deze hoek verzameld en daarom "scheef". De-skewing is het proces van het corrigeren voor deze hoek en "opnieuw uitlijnen" van de afbeelding naar een echte z-stack. Deze gegevens moeten worden verzameld in beeldmedia en in alle kanalen die tijdens het experiment worden weergegeven. Als dit niet goed wordt verzameld, worden de gegevens niet goed ontsmet. Zorg er ook voor dat de media zijn opgewarmd tot 37 °C (of gewenste experimentele temperatuur).
4. Cellen instellen met LLSM
- Voeg 100.000 APC's (50 μL) toe van stap 2,5 tot een cirkelvormige afdekslip met een diameter van 5 mm uit stap 2.1 en laat ze 10 min nemen.
- Vet de monsterhouder in en voeg de coverslipcel-side-up eraan toe. Voeg een druppel beeldmedia toe aan de achterkant van de coverslip om bellen te voorkomen voordat u in het bad wordt plaatst. Schroef de voorbeeldhouder op de piëzo en druk op Image (Home).
- Zoek een APC naar afbeelding om ervoor te zorgen dat de LLSM- en imagingsoftware (zie Tabel met materialen)naar behoren functioneren.
OPMERKING: We image op 0,4 μm stap grootte met 60 z-stappen en 10 ms blootstelling voor twee kleuren met dither ingesteld op 3, wat resulteert in 1,54 s per frame van 3D-beeld met ~ 200 nm XY en 400 nm Z resolutie. Deze instellingen moeten mogelijk worden aangepast op basis van celgrootte, gewenste z-resolutie en sterkte van het signaal van de gebruikte fluorescerende etiketteringstechniek. Laser stroomverbruik zal ook variëren op basis van fluorescerende etikettering techniek gebruikt.- Druk op Live om de huidige afbeelding weer te geven. Beweeg langs Z om de dekslip en cellen te vinden.
- Zoek het midden van een APC door in de Z-richting te bewegen en druk op Stoppen om de laser te pauzeren. Controleer 3D en voer de gewenste instellingen in (zie stap 4.3.1), druk op Centrum en druk vervolgens op Uitvoeren. Dit verzamelt de gegevens.
- Verlaag het werkstadium om de positie te laden en voeg 50 μL T-cellen toe in beeldmedia (100.000 cellen, vanaf stap 2.5) direct over de coverslip. Het is het beste om een druppelformulier op het einde van de pipettip te laten en vervolgens de punt aan te raken op de badvloeistof. Verhoog het podium terug door op "Afbeelding (Return)te klikken ".
- Begin met beeldvorming. Zorg ervoor dat u de gewenste stackgrootte en tijdsverlooplengte instelt. Afbeelding 60 z-stacks op een stapgrootte van 0,4 μm en invoer 500 termijnen. (Meestal) stoppen met opnemen voordat 500 frames worden bereikt om fotobleken te voorkomen. Gebruik de livemodus om te zoeken naar celparen en druk op Uitvoeren om gegevens te verzamelen wanneer er gereed en gewenste instellingen zijn ingevoerd. Zie voorbeeld Film 1 en figuur 1.
5. Surface Dynamics volgen
- Exporteer de gegevens uit de beeldverwerkingssoftware (zie de tabel met materialen). Dit maakt z-stack TIF-bestanden voor elk tijdpunt in elke kleur.
- Eerst deskew en deconvolve de gegevens.
OPMERKING: We gebruiken de LLSpy-pijplijn onder licentie van HHMI's Janelia Research Campus18,maar deskewing en deconvolution zijn ook beschikbaar binnen meerdere imaging-software (zie Tabel met materialen). - Debleach de gegevens.
OPMERKING: We gebruiken Fiji's debleach functie met histogram matching (Fiji Pathway: Image | Aanpassen | Bleekmiddelcorrectie | Histogram Matching | OK). - Importeren in de trackingsoftware (zie de tabel met materialen). Volg clusters volgens softwarespecificaties. Zie Voorbeeld Film 2.
OPMERKING: Het bijhouden van resultaten zal afhangen van de gebruikte tracking software, gekozen algoritme, gewenste output parameters geselecteerd, enz. Bijvoorbeeld, in de tracking software die we gebruikten (zie de Tabel met materialen), hebben we ervoor gekozen om de software te laten onregelmatige vormen te volgen, in plaats van het toewijzen van elke functie een enkele plek, omdat TCR clusters zijn niet georganiseerd in perfecte bollen. Daarnaast hebben we ervoor gekozen om 35 parameters te verzamelen, waaronder snelheid, richting, volume, intensiteit, gebied, locatie en informatie over de duur van het spoor. Echter, verschillende methoden of parameters zullen gunstig zijn om verschillende vragen te beantwoorden.- Als tracking niet gewenst is, gebruikt u de ClearVolume-plug-in voor Fiji voor het visualiseren en maken van films van hyperstack-gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we de isolatie, voorbereiding en beeldvorming van primaire muis 5C. C7 T cellen met behulp van een rooster lichtplaat microscoop. Tijdens sectie 3 is het noodzakelijk om de microscoop correct uit te lijnen en dagelijks PSF te verzamelen om de gegevens na het verzamelen te deconvolveen. In figuur 2tonen we de juiste uitlijningsbeelden die te zien zijn bij het uitlijnen van de microscoop. Figuur 2A en figuur 2B tonen respectievelijk het juiste bundelpad en de uitlijning van de straal, wanneer ze in fluoresceine worden weergegeven. De doelscan moet een grote X-vorm laten zien in de XZ- en YZ-projecties die zo symmetrisch mogelijk is; dit moet ook worden aangepast om zo klein mogelijk te zijn van een X (figuur 2C). Dit wordt voornamelijk bereikt door de emissiedoelstelling aan te passen. De z galvo-scan moet een ovaal in XZ en XY met een enkele stip aan weerszijden (boven en onder voor XZ en links en rechts voor YZ) (Figuur 2D)tonen. Dit wordt voornamelijk bereikt door het aanpassen van de galvo spiegel kantelen, hetzij handmatig of met de gemotoriseerde aanpassing in de software. Ten slotte moeten zowel de z+objectieve scan als de monsterscan stippen weergeven die er zo rond mogelijk uitzien (figuur2E en figuur 2F, respectievelijk). Deze kunnen een kleine X hebben, maar dit moet zo zwak mogelijk zijn. Deze moeten goed worden uitgelijnd als de doelstelling scan en z galvo goed werden ingesteld, maar als aanpassingen nodig zijn, zullen ze meestal worden uitgevoerd met de galvo spiegel. Het is belangrijk op te merken dat tijdens deze uitlijning, telkens wanneer de kraag en galvo worden aangepast, de focus (micrometer boven de emissiedoelstelling) ook moet worden aangepast.
Met behulp van dit protocol kunnen we de vierdimensionale dynamiek van de CDR's op een T-celoppervlak(figuur 1, film 1) zien. Het belangrijkste voordeel van deze microscoop ligt in de mogelijkheid om de gevisualiseerde oppervlakte-eenheden van de CVR's te volgen en gekwantificeerde gegevens te verkrijgen van hun grootte, beweging, signaalintensiteit, enz. (zie Tabel met materialen). Movie 2 toont een voorbeeld van de verkregen tracks.
Figuur 1: 4-dimensionale beeldvorming van T-cel-APC Synapse. (A) Een representatief voorbeeld 3D time-lapse LLSM-afbeeldingen waarop een T-cel wordt weergegeven die interactie heeft met een APC. Getoond zijn de TCR (groen, gelabeld door anti-TCR-AF488) dynamiek bij het herkennen van antigenen gepresenteerd op het oppervlak van een APC (rood, cytosolic mCherry). Schaalbalk = 5 μm. Zie ook Movie 1. (B) Orthogonale XY-plak van (A). Inset is een referentiekader van een hele cel. Schaalbalk = 5 μm. (C) Orthogonal YZ-segment (A). Inset is een referentiekader van een hele cel. Schaalbalk = 5 μm. (D) Dubbele orthogonale plak van (A). Inset is referentiekader van de hele cel. Schaalbalk = 5 μm. Zie ook Movie 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: LLSM-uitlijning. (A) Gewenst bundelpatroon voor LLSM-beeldvormingsexperiment. (B) Schermafbeelding van het uitlijningsproces van de bundel; aan de linkerkant is het scherpstelvenster met de vernauwde, gerichte balk; rechtsboven is een grafiek die aangeeft dat de balk gecentreerd is in het venster; rechtsonder is de finder camera, die ook een dunne, gerichte balk moet zijn. (C) Maximale intensiteitsprojecties (MIPs) van een kraal door middel van objectieve scan. (D) Maximale intensiteitprojecties (MIPs) van een kraal door z-galvo scan. (E) Maximale intensiteitsprojecties (MIPs) van een kraal door z+objectieve scan. f) Maximale intensiteitsprojecties (MIPs) van een kraal per monsterscan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: T cel synapsvorming. Volumeweergave met twee kleuren van de interactie van een T-cel met αTCR-AF488 (groen) met een doel APC die cytosolic mCherry (rood) uitdrukt over 70 tijdpunten met een interval van 1,54 s. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 2: Het bijhouden van TCR dynamische beweging. Vergelijk met Film 1. Clusters die overeenkomen met zichtbare TCR-structuren werden in de loop van de tijd in 3D bijgehouden met imagingsoftware. Dragon tails met clusterposities ten opzichte van de vorige vier frames zijn kleurgecodeerd door verplaatsingslengte. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Film 3: Orthogonale plakjes T-cel synaps. Vergelijk met Movie 1 en Figuur 1B-D. Dubbele orthogonale slice van Movie 1, waaruit blijkt dat αTCRβ-AF488 Fab inderdaad het etiketvantering van het celoppervlak Televisiecamera's. Inset is een referentieframe van de hele cel. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van CD4+ T-cellen geïsoleerd van 5C. C7 transgene muizen op het gebruikte LLSM-instrument, en daarom moeten andere celsystemen en LLSM's mogelijk anders worden geoptimaliseerd. Dit protocol toont echter de kracht van 4D-beeldvorming, omdat het kan worden gebruikt om de dynamiek van een oppervlaktereceptor op een hele cel te kwantificeren met de minste vervorming in fysiologische omstandigheden. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassingen van deze techniek.
Een kritieke stap is het toestaan van de cellen om zich te vestigen op een geschikte concentratie. Als te veel APC's zich vestigen op de coverslip en te dicht worden, is het moeilijk om een T-cel te vinden die interactie heeft met slechts één APC. Wanneer een T-cel meerdere synapsen heeft, kan het volgen en interpreteren van gegevens erg ingewikkeld worden. Ook als er te weinig APC's aanwezig zijn, is het ook moeilijk om een T-cel te vinden die een synaps vormt. In onze handen, waardoor 50.000 cellen genoegen nemen met 10 min bereikt een optimale dichtheid. Dit probleem kan echter worden vermeden als u een systeem met aanhangende cellen gebruikt. Cellen kunnen worden gekweekt in de couveuse met de coverslips tot een gewenste samenvloeiing.
Evenzo is het aantal T-cellen dat in het systeem is gedropt afhankelijk van de grootte van het bad en de afstand die ze kunnen uiten. In het LLSM-systeem dat hier wordt gebruikt, is er een bad van 12 mL en een bad van 2,5 mL, in tegenstelling tot de vorige versie van het systeem dat slechts een bad van 10 mL beschikbaar had. We gebruiken het 12 mL bad voor de originele fluoresceine beeldvorming en schakelen vervolgens over naar het 2,5 mL bad voor het beeld van de cellen. Dit zorgt voor minder grondig wassen van het bad na de straal visualisatie stap, en verlaagt ook het aantal T-cellen die nodig zijn voor elke imaging sessie. Op zijn beurt zou dit gebruikers in staat stellen om minder cellen te gebruiken.
Het vinden van cellen op het juiste punt van interactie is ook een uitdaging. In onze handen, T-cellen nemen ongeveer 2 min om zich te vestigen op de APC's op de coverslip, dus het is belangrijk om te beginnen zoeken in de coverslip voor dynamische T-cellen in de buurt van APC's. Een belangrijke verbetering hiervan is de recente toevoeging van het LED-licht in de finder camera. Als u een zelfgebouwd systeem gebruikt, raden we u ten zeerste aan deze functie in het ontwerp op te nemen.
Tot slot, fluorescerende etikettering strategieën zijn een andere belangrijke overweging. Elk fluorescerend eiwit of kleurstof heeft een andere kwantumopbrengst en snelheid van fotobleken. Fluorescerende kleurstoffen zijn meestal helderder, maar als de cellen stabiel zijn getrans-iseerd met een fluorescerend eiwit gelabeld molecuul, wordt het label aangevuld als de cel blijft het molecuul te produceren. Daarom is etiketteringsstrategie een belangrijke factor om rekening mee te houden bij het ontwerpen van experimenten.
We willen afsluiten met een discussie over toekomstige richtingen voor de technologie. LLSM is ook in staat om gestructureerde verlichting microscopie (SIM), wat resulteert in 150 nm XY resolutie en 280 nm Z resolutie, en is ten minste 10 keer sneller dan widefield SIM12. Daarom, terwijl LLSM biedt ongekende snelheid van 4D-beeldvorming, kan het niet de ruimtelijke resolutie van de huidige super-resolutie technieken4,5,6. Deze resolutie kan echter worden verbeterd als er een STED LLSM kan worden gemaakt. Lichtblad STED en gestimuleerde emissie-uitputting met selectieve vliegtuigverlichting microscopie (STED-SPIM) zijn gebruikt, maar het ontbreken van de temporele resolutie van LLSM21,22,23,24. Als STED-SPIM werden aangepast om een rooster op te nemen, zouden we mogelijk 50 nm axiale resolutie kunnen verkrijgen met veel minder fotobleken en beeld sneller dan de huidige technieken. Niettemin, met de huidige beschikbare technologieën, LLSM geeft ons de snelste temporele resolutie met hoge axiale resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag het advies en de begeleiding van Dr Vytas Bindokas aan de Universiteit van Chicago erkennen. Wij danken de Integrated Light Microscopy Core Facility van de Universiteit van Chicago voor het ondersteunen en onderhouden van de rooster lichtplaatmicroscoop. Dit werk werd ondersteund door NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 en NSF Career Award 1653782 (Aan J.H.). J.R. wordt ondersteund door het NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
