Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man använder Lattice Light-Sheet Mikroskopi för att fyrdimensionellt visualisera ytreceptordynamik i levande celler. Här visas T-cellreceptorer på CD4+ primära T-celler.
Abstract
Signalering och funktion av en cell dikteras av de dynamiska strukturerna och interaktionerna hos dess ytreceptorer. För att verkligen förstå struktur-funktion förhållandet mellan dessa receptorer på plats, måste vi visualisera och spåra dem på levande cellytan med tillräckligt spatiotemporal upplösning. Här visar vi hur man använder nyligen utvecklade Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) för att avbilda T-cellsreceptorer (TCRs) fyrdimensionellt (4D, utrymme och tid) vid levande cellmembranet. T-celler är en av de viktigaste effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet, och här använde vi T-celler som ett exempel för att visa att signalering och funktion av dessa celler drivs av dynamiken och interaktionerna hosTAT. LLSM möjliggör 4D-avbildning med oöverträffad spatiotemporal upplösning. Denna mikroskopiteknik kan därför i allmänhet appliceras på ett brett spektrum av yt- eller intracellulära molekyler av olika celler i biologin.
Introduction
Den exakta dynamiken i molekyler som handlar och sprider sig på den tredimensionella cellytan i realtid har varit en gåta att lösa. Mikroskopi har alltid varit en balans mellan hastighet, känslighet och upplösning; Om någon eller två maximeras minimeras den tredje. Därför, på grund av den lilla storleken och enorma hastighet med vilken ytan receptorer flytta, spåra deras dynamik har förblivit en stor teknisk utmaning för området cellbiologi. Till exempel har många studier genomförts med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi1,2,3, som har hög tidsmässig upplösning, men kan bara bild en mycket tunn del av T-cell membranet (~ 100 nm), och därför missar händelser som händer längre bort i cellen. Dessa TIRF-bilder visar också bara en tvådimensionell del av cellen. Däremot super-upplösning tekniker, såsom stokastiska optisk akonstruktion mikroskopi (STORM)4, fotoaktiverat lokalisering mikroskopi (PALM)5, och stimuleras utsläpp utarmning mikroskopi (STED)6, kan övervinna Abbe diffraktion gränsen för ljus. Dessa tekniker har hög rumslig upplösning (~ 20 nm upplösning)4,5,6,7, men de tar ofta många minuter att förvärva en fullständig tvådimensionell (2D) eller tredimensionell (3D) bild, och därför den tidsmässiga upplösningen går förlorad. Dessutom kan tekniker som STORM och PALM som är beroende av blinkande signaler ha felaktigheter i att räkna8,9. Elektronmikroskopi har den överlägset högsta upplösningen (upp till 50 upplösning)10; det kan även genomföras tredimensionellt med fokuserad jonstråle scanning elektronmikroskopi (FIB-SEM), vilket resulterar i upp till 3 nm XY och 500 nm Z upplösning11. Emellertid, någon form av elektronmikroskopi kräver hårda provberedning och kan endast utföras med fasta celler eller vävnader, vilket eliminerar möjligheten att avbildning levande prover över tiden.
Tekniker för att få den höga spatiotemporal upplösning som krävs för att identifiera dynamiken i ytan och intracellulära molekyler i levande celler i deras sanna fysiologiska 3D-natur är först nyligen utvecklas. En av dessa tekniker är Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, som använder en strukturerad ljusark för att drastiskt lägre photobleaching. Utvecklad 2014 av Nobelpristagaren Eric Betzig, den höga axiella upplösningen, låg photobleaching och bakgrundsljud, och förmåga att samtidigt bild hundratals plan per synfält gör LLS mikroskop överlägsen widefield, TIRF och konfokala mikroskop12,13,14,15,16,17,18,19. Denna fyrdimensionella (x, y, z och tid) bildteknik, medan fortfarande diffraktion begränsad (~ 200 nm XYZ upplösning), har otrolig tidsupplösning (vi har uppnått en bildhastighet på ca 100 fps, vilket resulterar i en 3D rekonstruerad cellbild med 0,85 sekunder per bild) för 3D spatial förvärv.
LLSM kan i allmänhet användas för att spåra realtidsdynamiken hos alla molekyler inom någon cell på enmolekyl- och encellnivå, särskilt de i mycket rörliga celler som immunceller. Till exempel visar vi här hur du använder LLSM för att visualisera T-cellsreceptordynamik (TCR). T-celler är effektorcellerna i det adaptiva immunsystemet. TCRs ansvarar för att känna igen peptid-MHC (pMHC) ligands visas på ytan av antigen-presenteraceller (APC), som bestämmer urval, utveckling, differentiering, öde och funktion av en T-cell. Detta erkännande sker vid gränssnittet mellan T-celler och APC, vilket resulterar i lokaliserade receptorkludering för att bilda vad som kallas immunologisk synaps. Även om det är känt att TCRs vid immunologiska synaps är absolut nödvändigt för T-cells effector funktion, fortfarande okänd är de underliggande mekanismerna för realtid TCR människohandel till synapsen. LLSM har gjort det möjligt för oss att i realtid visualisera dynamiken i TCRs före och efter människohandel till synapsen med den resulterande pMHC-TCR interaktion (figur 1). LLSM kan därför användas för att lösa aktuella frågor om tcr-formatdynamiken och ge insikter för att förstå hur en cell skiljer mellan själv- och utländska antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5C. C7 TCR-transgena RAG2 knockout möss i B10. En bakgrund användes i denna studie enligt ett protokoll som godkänts av institutionella Animal Care and Use Committee vid University of Chicago.
1. Skörda och aktivera T-celler
Den här delen av protokollet baseras på tidigare protokoll. Se citat för mer information20,21.
- Avliva en 10-12 veckor gammal 5C. C7 transgen mus av båda könen (~ 20-25 g) enligt det godkända IACUC-protokollet (dvs. CO2 kammare följt av massundersökning förskjutning).
- Spraya muskadavret noggrant med 70% etanol för att suga ner pälsen och föra in i ett BSL-2 säkerhetsskåp.
- Vrid musen på höger sida och gör ett litet snitt i kroppshålan med kirurgisk sax. Ta bort mjälten med hjälp av kirurgiska pincett. Skär bort bindväv efter behov med kirurgisk sax.
- Placera mjälte i en 70 μm-pore mesh cell sil och mosa med baksidan av en 1 ml spruta kolv. Tvätta genom silen noggrant med komplett RPMI (RPMI med 10% fetalt bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin, 50 μM 2-mercaptoetanol).
- Centrifug encellig suspension av splenocyter vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
PELLETEN vid denna punkt kommer att vara röd. - Omblanda splenocytes i 5 ml RBC lys buffert. Inkubera i 5 min, sedan släcka med 5 ml komplett RPMI.
- Centrifug encellig suspension av splenocyter vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
PELLETEN i detta punkt ska vara vit, inte röd. - Omblanda pelleten i 5 ml komplett RPMI.
- Överför till en T-25-kolv och tillsätt 10 μM mal cytokrom-C (MCC, sekvens ANERADLIAYLKQATK). Sätt cellerna i en cellkulturinkubator vid 37 °C, 5% CO2 över natten.
- På nästa dag, tillsätt rekombinant mus IL-2 till en slutlig koncentration av 100 U / ml.
- Observera följande dagar och lägg till nya medier när det aktuella mediet blir gult. T-celler kommer att dö om de lämnas i gula medier obevakade i över 48 h. Cellerna är redo att använda 6-10 dagar efter skörden.
2. Förbered celler
- Inkubera 5 mm runda täckslipsar med 0,1% poly-L-lysin i 10 min. Aspirera av och låt torka naturligt.
- Använd en densitet gradient reagens (se Materialförteckningen) för att separera döda celler och för att få 1 x 106 T-celler och 1 x 106 APC (CH27 celler21,22 transduced med cykliskmCherry) separat.
Celler räknas med hjälp av en hemocytometer.- Tillsätt 3 ml densitet gradient reagens till en 15 ml konisk rör och tillsätt celler dropwise till kanten av röret noggrant. Blanda inte. Centrifug vid 930 x g i 10 min vid 4 °C. acceleration/retardation: LÅNGSAM/LÅNGSAM. Ta bort det tunna mellersta lagret av celler mellan hela mediet och densitetgradientreagensen noggrant, sätta varje celltyp i separata koniska rör.
OBS: Det är nödvändigt att förbereda fler celler än vad som behövs för bildbehandling, eftersom vi finner att 50% går förlorade i genomsnitt under processen. Ju fler celler som används för processen, desto lättare är det att skörda dem från densitetgradienten. Vi använder 4-8 ml av båda celltyperna för att säkerställa överflödiga celler. Om så önskas kan celler räknas före detta steg för att säkerställa att volymen behövs. Eventuella extra celler sätts tillbaka i sina respektive kolvar. - Tvätta båda rören i T-celler och CH27-celler tre gånger med 5 ml komplett RPMI (300 x g i 5 min). Kassera supernatanten varje gång under tvätten. Omupphäng i varje rör i 1 ml komplett RPMI och räkna celler med en hemocytometer.
- Tillsätt 3 ml densitet gradient reagens till en 15 ml konisk rör och tillsätt celler dropwise till kanten av röret noggrant. Blanda inte. Centrifug vid 930 x g i 10 min vid 4 °C. acceleration/retardation: LÅNGSAM/LÅNGSAM. Ta bort det tunna mellersta lagret av celler mellan hela mediet och densitetgradientreagensen noggrant, sätta varje celltyp i separata koniska rör.
- Omupphäng 1 x 106 APC i 500 μL komplett RPMI och tillsätt 10 μM MCC. Inkubera i 3 timmar vid 37 °C, 5% CO2. Tvätta cellerna tre gånger med 500 μL komplett RPMI (300 x g i 5 min). Kasta supernatanterna.
- Omupphäng 1 x 106 T-celler i 500 μL komplett RPMI. Tillsätt 2 μg anti-TCRβ Alexa488-märkt Fab (klon H57) till 500 μL celler. Inkubera i 30 min vid 37 °C, 5% CO2. Tvätta cellerna tre gånger med 500 μl komplett RPMI (300 x g i 5 min). Kassera supernatant efter varje tvätt.
OBS: Divalent anti-TCR antikropp klipptes i monovalent Fab med hjälp av en Fab beredningkit (se Materialförteckningen)för att undvika crosslinking T-cellreceptorerna av divalent antikropp (detta steg är valfritt). - Omblanda båda celltyperna i 500 μL bildmedier (fenolrödfritt Leibovitz L-15 medium med 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 2 mM L-glutamin).
3. Genomföra LLSM daglig anpassning
OBS: (Viktigt) Detta anpassningsprotokoll baseras på det LLSM-instrument som används (se materialförteckningen). Varje LLSM kan vara olika och kräver olika anpassningsstrategier, särskilt de som är hembyggda. Utför lämplig rutininriktning och fortsätt till avsnitt 4.
- Tillsätt 10 ml vatten plus 30 μL fluorescein (1 mg/ml lager) till LLSM-badet (~10 ml volym), tryck på Bild (Hem) för att flytta målet till bildposition och titta på ett enda Bessel laserstrålemönster. Rikta in laserstrålen med hjälp av styrskenorna och den förinställda intresseregionen (ROI) för att göra strålen till ett tunt mönster balanserat i alla riktningar.
- Strålen ska också visas fokuserad i finder-kameran. Använd två spegeltiltjusterare, övre mikrometer, fokus och utsläppsobjektiv krage för att justera. Se figur 2A,B för korrekt justerad stråle.
- Tvätta badet och mål med minst 200 ml vatten för att helt ta bort fluorescein.
- Bildstandard fluorescerande pärlor i bildåtergivningsmediet (beredda genom att följa pärlor na till ett 5 mm täckprov med poly-L-lysin, se materialförteckningen;detta kan förprepareras och återanvändas) för fysisk punktspridningsfunktion (PSF) i bildmaterial.
OBS: Det kan bara finnas en pärla i sikte för senare bearbetning, så försök att hitta en pärla som är i sig i betraktaren eller lätt kan beskäras för att få en enda pärla.- Slå på dither genom att ställa in till 3 i rutan "X Galvo range". Tryck på Live för att visa det aktuella fältet. Gå längs Z riktning för att hitta locket glida och pärlor. Hitta mitten av en pärla genom att flytta längs Z, tryck på Stoppa för att pausa lasern. Kontrollera 3D, tryck på Center och tryck sedan på Kör. Detta kommer att samla in data.
- Justera lutningsspegeln manuellt, objektiv krage och fokusmikrometer för högsta gråvärden och justera sedan efter behov för att få rätt mönster för objektiv skanning, z galvo, z+mål (totPSF) och provsökning (samplePSF) fångstlägen. Se figur 2C-F för korrekt justerade maximala intensitetsprojektioner.
Obs: De olika insamlingslägen (objektiv skanning, z galvo, z + mål och provskanning) ändra hur ljus-arket rör sig genom provet. Alla skanningslägen ska användas för justering. - Exempelsökningen visar hur data ska samlas in under experimentet. Samla in provet sf genom att trycka på Kör i provskanningsläge för skrivbordsy ning och avsvällning (se avsnitt 5). Ändra lasrar till tre färgläge (488, 560, 647) och tryck på Kör igen.
OBS: Eftersom LLSM-bilderna i vinkel (57,2°) samlas bilder tagna i "provskanningsläget" i denna vinkel och är därför "skeva". De-skewing är processen att korrigera för denna vinkel och "justera" bilden till en sann z-stack. Dessa data måste samlas in i bildmedier och i alla kanaler som ska avvisas under experimentet. Om detta inte samlas in korrekt kommer uppgifterna inte att de-skeva. Se också till att media har värmts upp till 37 °C (eller önskad experimentell temperatur).
4. Ställa in celler med LLSM
- Tillsätt 100 000 APC(50 μL) från steg 2,5 till ett cirkulärtäcksglas med 5 mm från steg 2.1 och låt dem nöja sig med 10 min.
- Smörj provhållaren och tillsätt sedan täckglascellen uppåt till den. Lägg till en droppe bildåtergivningsmedia på baksidan av täckglasen för att undvika bubblor innan du placerar i badet. Skruva fast provhållaren på piezo och tryck på Bild (Hem).
- Hitta en APC till bild för att säkerställa att LLSM- och bildprogramvaran (se Materialförteckning) fungerar korrekt.
OBS: Vi bild på 0,4 μm stegstorlek med 60 z-steg och 10 ms exponering för två färger med dither inställd på 3, vilket resulterar i 1,54 s per bild av 3D-bild med ~ 200 nm XY och 400 nm Z upplösning. Dessa inställningar kan behöva justeras baserat på cellstorlek, önskad z-upplösning och signalstyrka från den fluorescerande märkningsteknik som används. Lasereffektanvändning varierar också beroende på fluorescerande märkningsteknik som används.- Tryck på Live för att visa den aktuella bilden. Flytta längs Z för att hitta locket glida och celler.
- Hitta mitten av en APC genom att flytta i Z-riktningen och tryck sedan på Stoppa för att pausa lasern. Kontrollera 3D och ange önskade inställningar (se steg 4.3.1), tryck på Center och tryck sedan på Kör. Detta kommer att samla in data.
- Sänk scenen för att ladda positionen och tillsätt 50 μL T-celler i bildmediet (100 000 celler, från steg 2.5) dropwise direkt över täckslipen. Det är bäst att låta en droppe form på slutet av pipettspetsen och sedan röra spetsen till badvätskan. Höj scenen tillbaka genom att klicka på "Bild (Retur)".
- Börja imaging. Var noga med att ställa in önskad stackstorlek och tidsfördröjning. Bild 60 z-stackar med stegstorlek på 0,4 μm och inmatning 500 tidsramar. (Vanligtvis) stoppa inspelningen innan 500 bilder nås för att undvika fotoblekning. Använd Live-läge för att söka efter cellpar och när du har angett och önskade inställningar trycker du på Kör för att samla in data. Se film 1 och figur 1 för ett exempel.
5. Spåra Surface Dynamics
- Exportera data från bildprogramvaran (se materialförteckningen). Detta skapar Z-stack TIF-filer för varje gång punkt i varje färg.
- Först deskew och deconvolve data.
OBS: Vi använder LLSpy rörledningen under licens av HHMI: s Janelia Research Campus18, men skrivbordewing och deconvolution finns också inom flera bildframställning mjukvaror (se Table of Materials). - Debleach data.
OBS: Vi använder Fijis debleach funktion med histogram matchning (Fiji Pathway: Image | Justera | Korrigering av blekmedel | Histogram Matchning | OK). - Importera till spårningsprogramvaran (se materialförteckningen). Spåra kluster enligt programvaruspecifikationer. Se film 2 för ett exempel.
Spårningsresultaten beror på den spårningsprogramvara som används, algoritmen vald, önskade utdataparametrar valda, etc. I spårningsprogramvaran som vi använde (se materialförteckningen)valde vi till exempel att låta programvaran spåra oregelbundna former, i stället för att tilldela varje funktion en enda plats, eftersom TCR-kluster inte är organiserade i perfekta sfärer. Dessutom valde vi att samla in 35 parametrar, inklusive hastighet, riktning, volym, intensitet, område, plats och spåra varaktighetsinformation. Olika metoder eller parametrar kommer dock att vara till nytta för att besvara olika frågor.- Om spårning inte önskas använder du ClearVolume-plugin-programmet för Fiji för att visualisera och skapa filmer från hyperstackdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi isolering, förberedelse och avbildning av primär mus 5C. C7 T-celler med hjälp av ett galler ljusplåtmikroskop. Under avsnitt 3 är det absolut nödvändigt att justera mikroskopet korrekt och att dagligen samla in PSF som för att avsvälla data efter insamling. I figur 2visar vi rätt justeringsbilder som kommer att ses när mikroskopet justeras. Figur 2A och figur 2B visar rätt strålväg respektive strålriktning när den avbildes i fluorescein. Målskanningen bör visa en stor X-form i XZ- och YZ-projektionerna som är så symmetriska som möjligt. Detta bör också justeras så att det är så litet av ett X som möjligt (figur 2C). Detta uppnås främst genom att justera utsläppsmålkragen. Z galvo-skanningen ska visa en oval i XZ och XY med en enda punkt på vardera sidan (ovanför och under för XZ och till vänster och höger för YZ) (figur 2D). Detta uppnås främst genom att justera galvo spegel lutning, antingen manuellt eller med motoriserad justering i programvaran. Slutligen bör både z+målskanningen och provskanningen visa punkter som ser så runda som möjligt(figur 2E respektive figur 2F). Dessa kan ha ett litet X, men detta bör vara så dimished som möjligt. Dessa bör vara väl anpassade om målet scan och z galvo sattes väl, men om justeringar är nödvändiga, kommer de mestadels att genomföras med galvo spegeln. Det är viktigt att notera att under denna anpassning, varje gång kragen och galvo justeras, fokus (mikrometer över utsläppsmålet) måste justeras också.
Med hjälp av detta protokoll kan vi se tat-cellens fyrdimensionella dynamik på en T-cellsyta (figur 1, film 1). Den största fördelen med detta mikroskop ligger i förmågan att spåra de visualiserade ytenheterna i TCRs, och att få kvantifierade data från deras storlek, rörelse, signalintensitet, etc. (se Materialförteckning). Film 2 visar ett exempel på de spår som erhållits.
Figur 1: 4-dimensionell avbildning av T-cell-APC Synapse. (A) Ett representativt exempel 3D time-lapse LLSM-bilder som visar en T-cell som interagerar med en APC. Visas är TCR (grön, märkt av anti-TCR-AF488) dynamik i att känna igen antigener som presenteras på ytan av en APC (röd, cyklisk mCherry). Skalstång = 5 μm. Se även film 1. (B)Orthogonal XY skiva (A). Infälld är en referensram för en hel cell. Skalstång = 5 μm. (C)Orthogonal YZ skiva (A). Infälld är en referensram för en hel cell. Skalstång = 5 μm. (D) Dubbel orthogonal skiva (A). Infälld är referensramen för hela cellen. Skalstång = 5 μm. Se även Film 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: LLSM-justering. (A) Önskat strålmönster för LLSM-bildexperiment. (B) Skärmbild av stråljusteringsprocessen; till vänster är fokusfönstret som visar den trånga, fokuserade strålen; längst upp till höger finns ett diagram som visar att strålen är centrerad i fönstret. längst ner till höger är finder kameran, som också bör vara en tunn, fokuserad stråle. (C) Maximala intensitetsprognoser för en pärla genom objektiv skanning. (D)Maximala intensitetsprojektioner (MIPs) av en pärla genom z-galvo scan. (E)Maximala intensitetsprojektioner av en pärla genom z+målsökning. (F) Maximala intensitetsprojektioner av en pärla genom provskanning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: T cellsynapsbildning. Tvåfärgsvolymåtergivning av interaktionen mellan en T-cell märkt med αTCR-AF488 (grön) med ett mål APC som uttrycker cytosolic mCherry (röd) över 70 tidspunkter med 1,54 s intervall. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 2: Spåra Dynamisk tcr-rörelse. Jämför med film 1. Kluster som motsvarar synliga TCR-strukturer spårades i 3D över tid med bildprogramvara. Dragon svansar som visar kluster positioner över de föregående fyra bildrutorna är färgkodade av förskjutning längd. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 3: Ortogonala skivor av T-cellsynaps. Jämför med film 1 och figur 1B-D. Dubbel ortogonal skiva av film 1, som visar att αTCRβ-AF488 Fab verkligen märka cellytan TCRs. Infälld är en referensram för hela cellen. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet optimerades för användning av CD4+ T-celler isolerade från 5C. C7 transgena möss på LLSM-instrumentet som används, och därför kan andra cellsystem och LLSMs behöva optimeras på olika sätt. Detta protokoll visar dock kraften i 4D-avbildning, eftersom det kan användas för att kvantifiera dynamiken i en ytreceptor på en hel cell med minst distorsion i fysiologiska förhållanden. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar av denna teknik.
Ett kritiskt steg gör det möjligt för cellerna att bosätta sig vid en lämplig koncentration. Om alltför många APC bosätta sig på täcksen och bli för tät, är det svårt att hitta en T-cell som interagerar med endast en enda APC. När en T-cell har flera synapser kan spårning och tolkning av data bli mycket komplicerad. På samma sätt, om för få APC är närvarande, hitta en T-cell bildar en synaps är också svårt. I våra händer, så 50.000 celler att nöja sig med 10 min uppnår en optimal densitet. Det här problemet kan dock undvikas om du använder ett system med vidhäftande celler. Celler kan odlas i inkubatorn med täckslips till önskad sammanflödet.
På samma sätt är antalet T-celler som tappas in i systemet beroende av badets storlek och avståndet de kan skingra. I LLSM-systemet som används här, det finns en 12 mL bad och en 2,5 mL bad, i motsats till den tidigare versionen av systemet som bara hade en 10 mL bad tillgängliga. Vi använder 12 mL bad för den ursprungliga fluorescein avbildning sedan byta till 2,5 ml bad för avbildning av cellerna. Detta möjliggör mindre noggrann tvättning av badet efter strålvisualiseringssteget, och sänker även antalet T-celler som krävs för varje bildbehandling. I sin tur skulle detta göra det möjligt för användare att använda färre celler.
Att hitta celler vid rätt interaktionspunkt är också en utmaning. I våra händer tar T-celler ca 2 min för att slå sig ner till APC på täckglas, så det är viktigt att börja söka i täckglas för dynamiska T-celler nära APC. En stor förbättring av detta har varit den senaste tidens tillägg av LED-ljuset i finder kameran. Om du använder ett hembyggt system rekommenderar vi starkt att du inkluderar den här funktionen i designen.
Slutligen är fluorescerande märkning strategier en annan viktig faktor. Varje fluorescerande protein eller färgämne har en annan kvantavkastning och graden av fotoblekning. Fluorescerande färgämnen är vanligtvis ljusare, men om cellerna har blivit stabilt transduced med en fluorescerande protein märkt molekyl, är etiketten fylls på som cellen fortsätter att producera molekylen. Därför är märkningstrategi en viktig faktor att tänka på när du utformar experiment.
Vi vill avsluta med en diskussion om framtida riktlinjer för tekniken. LLSM kan också strukturerade belysningsmikroskopi (SIM), vilket resulterar i 150 nm XY upplösning och 280 nm Z upplösning, och är minst 10 gånger snabbare än widefield SIM12. Därför, medan LLSM ger oöverträffad hastighet av 4D-avbildning, kan det inte uppnå den rumsliga upplösningen av nuvarande super-upplösning tekniker4,5,6. Denna resolution skulle dock kunna förbättras om en STED LLSM kunde skapas. Ljusblad STED och stimulerad utsläpp utarmning med selektiv plan belysning mikroskopi (STED-SPIM) har använts, men saknar tidsmässig upplösning av LLSM21,22,23,24. Om STED-SPIM anpassades för att införliva ett galler, skulle vi kunna få 50 nm axiell upplösning med mycket mindre photobleaching, och bild snabbare än för närvarande tillgängliga tekniker. Ändå, med nuvarande tillgänglig teknik, ger LLSM oss den snabbaste tidsmässiga upplösningen med hög axiell upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill erkänna råd och vägledning från Dr Vytas Bindokas vid University of Chicago. Vi tackar Integrated Light Microscopy Core Facility vid University of Chicago för att stödja och underhålla galler ljusplåtmikroskop. Detta arbete stöddes av NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 och NSF Career Award 1653782 (till J.H.). Jr stöds av NSF Graduate Research Fellowships Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
