Summary
该协议的目的是说明与病毒进入相关的不同检测,可用于识别候选病毒进入抑制剂。
Abstract
抗病毒测定,机械检查病毒进入是相关的,以辨别哪个步骤评估的剂是最有效的,并允许识别候选病毒进入抑制剂。在这里,我们介绍通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入中的具体步骤来识别能够阻止非包络的coxsackie病毒A16(CVA16)感染的小分子的实验方法。分析包括药物添加时间分析、基于流细胞学的病毒结合测定和病毒失活测定。我们还提出了一种分子对接协议,利用病毒帽蛋白来预测抗病毒化合物靶向的潜在残留物。这些检测应有助于识别对病毒进入作用的候选抗病毒药物。未来的方向可以探索这些可能的抑制剂,以进一步的药物开发。
Introduction
手足口病 (HFMD) 是一种最常见的疾病,由病毒病毒 A16 (CVA16) 和肠道病毒 71 (EV71) 在幼儿中引起。最近,在整个亚太地区,CVA16引起的手足口病显著上升。虽然症状可能是轻微的,严重的并发症可能发生,影响大脑和心脏,与潜在的死亡1,2。目前,CVA16没有获得许可的抗病毒疗法或疫苗接种,因此迫切需要制定抗病毒战略,以遏制未来的疫情和相关并发症。
CVA16 是一种非包络病毒,其病毒由五角星组装而成,每个病毒都含有 4 种结构蛋白,即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。五角星中每个五折轴的包围是一个"Canyon"区域,它表现出抑郁症,并以其在受体结合3中的作用而闻名。在这个峡谷的底部是一个疏水口袋在VP1区域,其中包含一个天然脂肪配体名为狮身人面像(SPH)。细胞受体,如人P选择糖蛋白配体1(PSGL-1)和清除受体B类成员2(SCARB2),已被建议在病毒结合中发挥作用,取代这种配体,导致与帽状的变化随后将病毒基因组喷射到宿主细胞4,5,6。识别阻止病毒进入过程中连续事件的可能抑制剂可以提供针对CVA16感染的潜在治疗策略。
病毒生命周期中的步骤可以通过实验方法作为帮助识别特定模式的抗病毒药物的目标进行剖析。药物添加时间分析检查病毒感染期间不同时间的药物治疗效果,包括进入前(在病毒感染之前添加)、进入(与病毒感染并发添加)和进入后(在病毒感染)7.可以通过定量在每个治疗条件下形成的病毒斑块数量,使用标准斑块测定来评估其影响。基于流细胞学的病毒结合测定确定药物是否阻止病毒附着细胞的附着。这是通过将温度从37°C(大多数人类病毒感染发生的地方)转移到4°C来实现的,其中病毒能够结合到宿主细胞表面,但不能进入细胞7。然后,通过免疫染色对病毒抗原进行定量,并通过流动细胞学进行评估,从而对细胞膜结合的病毒颗粒进行量化。另一方面,病毒失活检测有助于评估药物与游离病毒颗粒的潜在物理相互作用,屏蔽或中和病毒,或导致聚集或构象变化,使它们失去活性在感染8,9期间与宿主细胞表面的后续相互作用。在这个实验中,病毒接种允许先用药物孵育,然后再被稀释,在感染宿主细胞单层并进行标准斑块测定之前,将药物分三子。最后,分子对接是一个强大的工具,用于预测病毒表面潜在的药物相互作用位点,包括来自包络病毒的病毒糖蛋白和非包络病毒的病毒帽蛋白,通过使用计算算法。这有助于机械地确定药物作用模式的目标,并提供有用的信息,可以通过下游检测进一步验证。
我们最近使用上述方法识别抗病毒化合物,有效阻止非包络的CVA169感染。本文将介绍并讨论所使用的详细协议。
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Protocol
注:所有细胞培养和病毒感染必须在与所处理样品的生物安全水平相适应的经认证的生物安全罩中进行。两种单宁类小分子化学酸(CHLA)和双核蛋白(PUG),被观察有效阻止CVA16感染9,被用作候选抑制剂的例子。关于病毒学技术、病毒传播、病毒牙斑测定以及斑块形成单元(PFU)或感染多重性(MOI)的概念等基本原则,读者参考参考文献10。
1. 细胞培养、病毒制备、化合物制备和复合细胞毒性
- 人类横纹肌瘤(RD)细胞是宿主细胞,允许CVA16感染11。在 Dulbeco 的改性 Eagle 培养基 (DMEM) 的 10 mL 中生长 RD 细胞,辅以 10% 胎儿牛血清 (FBS)、200 U/mL 青霉素 G、200 μg/mL 链霉素和 0.5 μg/mL 安培林 B 在 T-75 烧瓶中,在 37°C 的 Co2培养箱中。
- 通过在RD细胞中传播病毒,确定PFU/mL中的病毒性定位剂,制备CVA16。有关优化的协议,请参阅参考11。
- 使用各自的溶剂制备测试化合物和对照组:例如,将CHLA和PUG溶解在二甲基亚硫酸盐(DMSO)中。对于所有感染步骤,基础介质由 DMEM 加 2% FBS 和抗生素组成。
注:试验中DMSO的最终浓度等于或低于实验的0.25%;0.25% DMSO 作为阴性对照处理包含在检测中进行比较。 - 使用XTT(((2,3-bis_2-甲基-4-硝基-5-苯基-5-苯丙胺)-碳基®-2H-四氯二苯甲酸氢氧化铝)等细胞活力测定试剂对RD细胞执行测试化合物的细胞毒性测定。有关详细协议,请参阅参考12。根据制造商的协议,使用 GraphPad 棱镜等分析软件确定测试化合物的细胞毒性浓度。药物浓度对细胞活力没有显著影响(+95%活细胞)用于研究的其余部分。
2. 药物加法时间测定
-
评估药物在病毒感染前对宿主细胞的影响(预处理)
- 种子RD细胞在12孔板,播种密度为2 x 105细胞/孔。在5%的CO2培养箱中,在37°C下孵育过夜,以获得单层。
- 在基底介质体积的1 mL下用无细胞毒性浓度(从步骤1.4测定)处理具有测试化合物的RD细胞1小时或4小时。
- 在基底培养基(接种的最终体积为300μL)中加入50 PFU/孔病毒之前,用1-2 mL的PBS清洗细胞,每15分钟摇动一次板。
- 感染后,再次使用PBS清洗单层,然后用含有0.8%甲基纤维素的1mL基底培养基,在5%CO2培养箱中37°C下进一步孵育。
- 孵育72小时后,取出覆盖介质,并使用2 mL的PBS清洗水井。
- 使用 0.5 mL 的 37% 甲醛修复油井 15 分钟。
- 取出上清液,并使用 PBS 再次清洗。
- 使用 0.5 mL 0.5% 的水晶紫色溶液染色油井。然后在2分钟内去除污渍溶液,在空气干燥前用温和的水流清洗水井。
- 将板放在白灯盒上,计算病毒斑块。计算百分比 (%)CVA16感染如下: (平均 + 斑块病毒+药物/ 平均 # 斑块病毒 +DMSO 控制) = 100%.
-
同时评估添加药物和病毒的效果(共增)
- 种子RD细胞在12孔板,播种密度为2 x 105细胞/孔。在5%的CO2培养箱中,在37°C下孵育过夜,以获得单层。
- 用适当浓度和50 PFU/孔CVA16(接种液的最终体积为300μL)同时处理RD细胞,每15分钟摇动板1小时。
- 用1 mL的PBS清洗细胞,然后用含有0.8%甲基纤维素的1-2 mL基底培养基,在5%CO2培养箱中37°C下进一步孵育。
- 感染后72小时后,用水晶紫罗兰染色病毒斑块,并确定上述CVA16感染百分比。
-
评估病毒进入(感染后)的药物治疗效果
- 种子RD细胞在12孔板,播种密度为2 x 105细胞/孔。在5%的CO2培养箱中,在37°C下孵育过夜,以获得单层。
- 用 50 PFU/孔 CVA16(接种液的最终体积为 300 μL)接种 RD 细胞 1 小时。
- 用1-2 mL的PBS清洗水井,用含有0.8%甲基纤维素和适当浓度的试验化合物的基础培养基覆盖细胞。
- 染色病毒斑块与水晶紫罗兰和计数后72小时感染,并确定上述CVA16感染孵育%。
注:轻轻执行所有 PBS 乳清,以避免抬起细胞。
3. 基于流细胞学的绑定测定
- 种子RD细胞在12孔板,播种密度为2 x 105细胞/孔。在5%的CO2培养箱中,在37°C下孵育过夜,实现单层。
- 在4°C下预冷细胞单层1小时。
- 在4°C下有和没有测试化合物3小时的情况下,用CVA16(MOI = 100)感染RD细胞。
注:在冰上进行病毒接种,随后在4°C冰箱中孵育,使温度保持在4°C,允许病毒结合,但不进入。 - 去除病毒接种,洗一次1-2 mL的冰冷的PBS。
- 在冰上加入1 mL的冰冷分离缓冲液3分钟,然后收集细胞并在冰冷的流细胞学缓冲液中重新悬浮细胞(1x PBS加2%FBS),提升细胞。
- 使用冰冷的流细胞学缓冲液两次清洗细胞,并用0.5 mL的4%甲醛将细胞固定在冰上20分钟。
- 使用PBS清洗细胞,去除任何未结合或弱结合的病毒,然后用1mL的抗VP1抗体(1:2,000;在含有3%BSA的PBS中稀释)在冰上染色1小时,然后用继发Alexa 488结合的抗小鼠IgG孵育(1:250);在含有3%BSA的PBS中稀释1小时,每次抗体处理后进行PBS冲部(3次)。
- 在 0.5 mL 的冰冷流细胞学缓冲液中重新悬浮细胞,并使用标准程序对流式细胞仪执行流式细胞测定分析。使用关联软件在直方图中显示数据,并限定为条形图表示。
4. 病毒失活测定
-
使用以下条件执行前面描述的病毒失活测定:
- CVA16 的起始浓度为 106 PFU/mL。
- 12孔板中的RD细胞单层,播种密度为2 x 105细胞/孔。
- 50倍稀释,用于对药物化合物进行定子,最终病毒浓度为50 PFU/井。
- 使用 1-2 mL 的 PBS 清洗步骤。
- 覆盖介质中含有0.8%甲基纤维素。 - 执行病毒感染的最终读出使用病毒斑块的水晶紫色染色程序,如上文详细。
5. 分子对接分析
- 从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载测试化合物的3D分子。如果分子没有上传3D结构,下载2D结构或使用SMILES字符串序列,并通过分子程序(例如CORINA)转换为3D分子。
- 从RCSB蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)下载病毒生物组装单元,并使用生物计算程序(例如UCSF Chimera)准备病毒结构模型。例如,在 CVA16 成熟病毒晶体结构 (PDB: 5C4W)3的情况下,从 PDB 文件中删除溶剂,使用 Dunbrach 2010 Rotamer 库的数据替换不完整的侧链,并将氢和电荷添加到结构中,此前报道13。停靠目标可以是任何相关的病毒蛋白,用于使用生物组装信息(蛋白质数据库)进行预期分析。
-
使用 UCSF Chimera 等将测试化合物停靠到准备好的病毒单元上,并使用可视化软件(例如,Autodock Vina、PyMol)分析输出文件:
- 将测试化合物文件上传至UCSF Chimera作为"配体",并通过选择整个制备的病毒蛋白作为"受体"进行盲点对接。使用计算机鼠标或触控板将搜索卷调整到整个"受体"。在"高级选项"中,允许绑定模式的数量为最大值。停靠帧将自动从最高到最低绑定能量进行排名。
- (可选)除了盲点坞,将停靠点限制在从盲基块结果派生的感兴趣区域,再次使用鼠标或触控板来减少搜索量(例如,100 × x 100 × x 100 Ω)。此步骤有助于确认盲停靠结果并增加特异性。
- 使用分子图形系统(例如 PyMol)通过上传停靠文件来分析绑定模式的位置。通过选择"配体"和识别"任何原子"选项的极性接触,从化合物到病毒蛋白的极性接触;检查结果。
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Representative Results
药物添加时间测定如图1所示,显示了使用小分子CHLA和PUG治疗对CVA16感染的影响,无论是病毒输入前(预治疗),病毒进入(共添加),还是病毒后进入(感染后)。无论是病毒感染前对宿主细胞的前期处理(图1A),还是在感染后治疗(图1C),这两种小分子对CVA16的感染性只产生轻微影响。相比之下,CHLA 和 PUG 在共增治疗中有效废除了 CVA16 感染(图 1B)。因此,这些观察表明,当两种化合物在感染期间与宿主细胞表面的病毒颗粒同时存在时,它们最为有效。
在图2中,基于流细胞学的结合分析(如图2A所示)证实,两种单宁通过阻止病毒颗粒结合宿主细胞来防止CVA16进入。图2B中的定量数据显示,在两种药物存在的情况下,RD细胞表面检测到的病毒量小于10%,与肝素阳性对照相似,后者已知可预防CVA16附件14。图2C、2D和2E描绘了相关的流式细胞直方图,当CHLA和PUG存在时,RD细胞表面的CVA16检测引起的带移明显减少。
图 3A描述了病毒失活实验的进行方式。药物化合物要么与CVA16病毒颗粒混合,在稀释步骤前孵育1小时(长期),要么在感染前混合并立即稀释(短期)。如图3B所示,与短期孵育和DMSO对照相比,CV16粒子与测试试剂的预孵育1小时,使RD细胞几乎完全保护免受病毒感染。因此,结果表明,CHLA和PUG都与CVA16粒子相互作用,并能够使其在随后的感染中处于非活动状态。
由于我们的数据表明,药物化合物可以直接灭活CVA16颗粒,因此确定病毒本身是其抗病毒活性的一个合理的目标,我们使用分子对接来预测这些代理和 CVA16 辣椒五角星。图 4A显示了 CVA16 五角星的表面投影,该图构成 CVA16 病毒的 icosahedral 瓶盖。单宁CHLA(图4B;绿色)和PUG(图4C;蓝色)的分子对接表明,它们预计在CVA16五角星的峡谷区域结合。具体来说,两个小分子都绑定在口袋入口正上方(图4B和4C,放大面板),这包含口袋因子,并在调解CVA16绑定和进入宿主细胞方面起着重要作用。因此,CHLA 和 PUG 似乎掩盖了袖珍入口区域,理论上这将阻碍病毒颗粒与宿主细胞受体之间的相互作用。图 4D和4E分别表明从 CHLA 和 PUG 的极性接触中预测到的独特残留物,分别出现在口袋入口周围,其中大多数与 VP1 的化合物和 3 个氨基酸 Asn85发生这些相互作用,Lys257和 Asn417是两个单宁之间的共同点。
图1:CHLA和PUG对CVA16感染力的加药时间效应。在CVA16接种的不同时间(50 PFU/井)用CHLA(20μM)或PUG(25μM)处理RD细胞。DMSO (0.25%)治疗包括阴性对照,所有测定均通过培养后72小时结晶紫罗兰染色的斑块测定进行分析。(A) 进行预处理,用测试化合物孵育细胞1小时或4小时,然后在CVA16感染前清洗。(B) 对于共增分测定,细胞与药物和病毒同时施用1小时,然后清洗。(C) 在感染后,细胞感染CVA161小时,洗涤,然后用测试化合物处理。显示的数据是三个独立实验的均值 = 标准偏差 (SD)。*p < 0.05 与相应的"仅病毒"组相比。使用方差的单向分析进行统计分析。这个数字已根据参考文献9改编。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:CHLA和PUG废除CVA16与主机单元的绑定。(A) 基于流细胞学的结合测定的原理图.(B) RD细胞(2 x 105细胞/井)在存在或不存在 CHLA (20 μM)、PUG (25 μM)、可溶性肝素 (500 μg/mL,阳性控制) 或 DMSO (0.25%,阴性对照) 时感染 CVA16 (MOI = 100), 在 4 °C 下 3 小时。从井中收集到管子中的接种,用PBS洗涤两次,固定,并沾上抗VP1抗体,然后是Alexa 488结合的二级抗体,用于流动细胞学检测表面结合病毒。从检测到的荧光信号的量化数据绘制为方法 = SD 从三个独立的实验在条形图为"病毒绑定 (%)". =p < 0.05 相比的"DMSO"控制处理。使用方差的单向分析进行统计分析。显示了CHLA(C)、PUG(D)和肝素(E)治疗的代表性流细胞直方图。这个数字已根据参考文献9改编。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:CHLA和PUG灭活无细胞CVA16病毒颗粒。(A) 病毒失活测定的原理图.(B) CVA16 (106 PFU/井) 使用 CHLA (20 μM) 或 PUG (25 μM) 处理,并立即混合进行短期灭活或孵育 1 小时,在 37°C 下长期失活,然后稀释 50 倍至非有效测试浓度在RD细胞上接种前的化合物(最终病毒浓度=50PFU/井)。DMSO (0.25%)用作负控制。使用晶体紫罗兰染色72h感染后,通过斑块测定对实验进行了分析。所示数据是三个独立实验的均值和 SD。*p < 0.05 与相应的"仅病毒"组相比。使用方差的单向分析进行统计分析。这个数字已根据参考文献9改编。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:CHLA 和 PUG 瞄准了口袋入口附近的 CVA16 辣椒。CVA16 病毒粒子的表面投影,用红线(A) 划定的单体结构五角星。病毒上的其他五角形以青色、品红色、蓝绿色、青铜色和绿色显示。CVA16五角星(PDB:5C4W)上的CHLA(B、绿色)和PUG(C、蓝色)的分子对接分析;放大面板以黄色表示表示。VP1 = 橙色,VP2 = 灰色,VP3 = 白色;极性触点显示为黑色破折号。化妆口袋入口的残留物是红色(Ile 94,Asp95,Gln207,Met212,Met213,Lys257,Thr258)。D,E.特写侧视图到峡谷的口袋入口的位置和CHLA (D) 和 PUG (E) 绑定到的地方.五角星上化合物极性接触体中的唯一残留物标有黄色 (VP1)、白色 (VP2) 和黑色 (VP3) 字体。白色虚线表示口袋入口区域。这个数字已根据参考文献9改编。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在本报告中,我们描述了有助于识别针对病毒进入的抗病毒候选项,特别是针对非包络的CVA16的抗病毒候选方案。检测方法旨在剖析病毒进入过程中的早期事件,有助于阐明检测剂抗病毒活性的作用机制和潜在靶点。"药物添加时间测定"允许广泛确定测试化合物的潜在目标,例如未感染的宿主细胞(预处理分析)、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用(共增分析)),或病毒复制阶段(感染后分析)中受病毒感染的宿主细胞。仅此测定就可以确定导致本协议中所述后续测定的化合物(例如共添加物)的相互作用方法(例如,病毒失活测定和结合分析)。洗涤步骤对于确保所检查的治疗方法特定于所分析的方法至关重要。使用"流细胞学结合测定"有助于评估化合物对病毒结合对宿主细胞的影响。将实验温度保持在4°C对于最终检测细胞表面的病毒非常重要,因为此温度允许病毒结合,但不能进入。"病毒失活测定"可以帮助确定药物化合物与无细胞病毒颗粒的潜在物理相互作用。关键的一步是稀释与病毒性接种孵育后对药物化合物进行分子,因为这是防止药物与宿主细胞表面在后续感染步骤12中产生任何有意义的相互作用所必需的。
由于病毒进入是一个多步骤事件,抗病毒剂的病毒进入抑制剂类别可能施加几种机制,包括:(1)调节细胞表面进入因子/受体或其相关的信号通路;(2) 影响细胞膜流动性或完整性;(3) 靶向病毒颗粒与宿主细胞表面之间的静电或范德瓦尔斯相互作用;(4) 诱导物理变化,如颗粒断裂或聚集;(5) 与病毒性糖蛋白或辣椒蛋白结合,防止其功能或构象变化;(6)阻断融合相关机制;(7)防止宿主细胞内病毒基因组的释放。因此,本报告中描述的分析有助于指出上述可能的行动模式,这些模式可以通过其他实验进一步验证。最后,此处描述的"分子对接分析"有助于预测药物化合物和病毒颗粒之间的潜在相互作用区域,因此有助于确定候选病毒辣椒或糖蛋白粘合剂和靶向病毒颗粒上的残留物。然而,这些预测取决于对接软件,以及病毒蛋白晶体结构的分辨率和准确性。需要注意的是,在步骤5.3.2中添加了可选的有限对接方法,因为当使用病毒结构蛋白作为"受体"分子时,配体可能结合到通常无法到达或暴露在表面上的区域(例如,在病毒帽的表面之下,面对病毒内侧,包络糖蛋白的跨膜区域等)。限制搜索框只允许病毒蛋白的可访问区域被瞄准,并排除任何不切实际的相互作用。分子对接取决于结晶结构,但最近同源建模的进步使得分析非结晶结构能够将其氨基酸序列拟合到密切相关的结晶结构15上。这允许分析更多的结构,获得的信息可用于进一步研究,包括突变分析,有助于验证预测的相互作用。
总之,本报告中描述的测定和协议专门用于识别针对病毒进入的候选抗病毒药物,并提供有关测试剂针对的病毒进入过程步骤的信息,以及测试剂是否与自由病毒颗粒相互作用,并预测病毒上可能存在的药物相互作用部位。这些类型的检测可以在其他非包络病毒上重复,或适应包络病毒作为筛选抗病毒药物化合物的方法,以寻找病毒进入的可能抑制剂。利用这种机制驱动的方法确定抗病毒候选药物有助于加快药物开发过程,扩大抗病毒治疗范围。
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Disclosures
提交人声明他们之间没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢德克萨斯大学奥斯汀分校的约书亚·贝克汉姆博士为分子对接提供技术支持。这项研究部分得到台湾科技部(MOST107-2320-B-037-002至C.-J.L.和L.T.L.)的资助;MOST106-2320-B-038-021 和 MOST107-2320-B-038-034-MY3 到 L.T.L.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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