Summary
Målet med protokollen er at illustrere de forskellige assays vedrørende viral Entry, der kan anvendes til at identificere de ansøske virale indgangs hæmmere.
Abstract
Antiviral assays, der mekanisk undersøger viral indrejse er relevante for at skelne på hvilket trin de evaluerede agenter er mest effektive, og giver mulighed for identifikation af kandidat viral Entry hæmmere. Her præsenterer vi de eksperimentelle tilgange til identifikation af små molekyler i stand til at blokere infektion med den ikke-kappeklædte coxsackievirus A16 (CVA16) gennem målretning viruspartikler eller specifikke skridt i tidlig viral indrejse. Assays omfatter analyse af tidspunktet for lægemiddel tilsætning, flow cytometri-baseret viral bindings test og viral inaktiverings test. Vi præsenterer også en molekylær docking-protokol, der udnytter virus kapsid-proteiner til at forudsige potentielle rester, der er målrettet mod antivirale forbindelser. Disse analyser bør hjælpe i identifikationen af kandidat antivirale midler, der virker på viral indrejse. Fremtidige retninger kan udforske disse mulige hæmmere for yderligere narkotika udvikling.
Introduction
Mund-, mund-og klovesyge (HFMD) er en sygdom, der oftest forårsages af coxsackievirus A16 (CVA16) og enterovirus 71 (EV71) hos små børn. For nylig i Asien-Stillehavsområdet har der været en betydelig stigning i CVA16-induceret HFMD. Mens symptomerne kan være milde, kan der opstå svære komplikationer, som påvirker hjernen og hjertet, med potentiel dødsfald1,2. På nuværende tidspunkt er der ingen licenserede antivirale behandlinger eller vaccinationer til rådighed for CVA16, og derfor er der et presserende behov for at udvikle antivirale strategier til at bremse fremtidige udbrud og de tilhørende komplikationer.
CVA16 er en ikke-kappeklædte virus, der har en icosahedral kapsid samlet fra pentamers, der hver indeholder 4 strukturelle proteiner, nemlig VP1, VP2, VP3, og VP4. Omkranser hver femdobling akse i pentamer kosmetisk er en ' Canyon ' region, der viser som en depression og er kendt for sin rolle i receptor binding3. I bunden af denne Canyon ligger en hydrofobe lomme i VP1-regionen, der indeholder en naturlig fed ligand, der hedder sphingosin (sph). Cellulære receptorer, såsom humant P molekylet glykoprotein ligand 1 (psgl-1) og Scavenger receptor klasse B-medlem 2 (SCARB2), er blevet foreslået til at spille en rolle i viral binding ved at forlede dette ligand, hvilket resulterer i konformationelle ændringer af kapsid og efterfølgende udslyngning af viral genom i værtscellen4,5,6. Identificering af mulige inhibitorer, der blokerer de successive hændelser i viral indrejse processen kunne give potentielle terapeutiske strategier mod CVA16 infektion.
Trinene i virus livscyklus kan dissekeret gennem eksperimentelle tilgange som mål for at hjælpe med at identificere mode-specifikke antivirale midler. En time-of-Drug-tilsætning analyse undersøger narkotikabehandling effekt på forskellige tidspunkter under virus infektion, herunder pre-Entry (tilføjet før virus infektion), indrejse (tilføjet samtidig med virus infektion), og post-Entry (tilføjet efter virus infektion)7. Virkningen kan vurderes ved hjælp af en standard plaque-analyse ved at kvantitere antallet af virale plaques dannet under hver af behandlingsbetingelserne. Den flowcytometri-baserede viral binding analyse afgør, om lægemidlet forhindrer viral fastgørelse til værtceller. Dette opnås ved at flytte temperaturen fra 37 °C, hvor størstedelen af menneskelige virusinfektioner forekommer, til 4 °C, hvor virions er i stand til at binde til værtscellens overflade, men er ude af stand til at komme ind i cellerne7. De celle membranbundne viruspartikler kvantificeres derefter ved immun farvning mod virale antigener og vurderes af flowcytometri. Viral inaktivering assay på den anden side hjælper med at vurdere potentielle fysiske interaktioner af lægemidlet med gratis viruspartikler, enten afskærmning eller neutralisering af virions, eller forårsager aggregeringer eller konformationelle ændringer, der gør dem inaktive for efterfølgende interaktioner med værtscellens overflade under infektionen8,9. I dette eksperiment er viral inokulum tilladt først at inkubere med lægemidlet, før det fortyndes for at titrere lægemidlet, inden det inficerer værtscellens enkeltlags og udfører en standard plaque-analyse8. Endelig er molekylær docking et effektivt værktøj til at forudsige potentielle lægemiddel interaktions steder på virion-overfladen, herunder de virale glykoproteiner fra kappeklædte vira og de virale kapsid-proteiner fra ikke-kappeklædte vira, ved hjælp af Computational Algoritmer. Dette hjælper til mekanisk at udpege mål for narkotika virkningsmekanisme og give nyttige oplysninger, der kan yderligere valideret af downstream analyser.
Vi har for nylig ansat de ovenfor beskrevne metoder til at identificere antiviral forbindelser, der effektivt blokeret infektion af ikke-kappeklædte CVA169. Heri beskrives og diskuteres de detaljerede protokoller, der blev brugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Alle cellekulturer og virusinfektioner skal udføres i certificerede biosikkerhedshætter, der er passende for biosikkerheds niveauet for de prøver, der håndteres. De to tannin-klasse af små molekyler chebulaginsyre (CHLA) og punicalagin (PUG), der blev observeret for effektivt at blokere CVA16 infektion9, anvendes som eksempler på kandidat hæmmende midler. For grundlæggende principper i virologi teknikker, virus formering, bestemmelse af virus titer, og begreber af plak dannende enheder (PFU) eller mangfoldighed af infektion (MOI), er læseren henvist til reference10.
1. cellekultur, virus præparat, sammensat præparat, og sammensatte cytotoksicitet
- Humane rabdomyosarkom (RD) celler er værtsceller, der er undergivende for CVA16 infektion11. Udvid RD-cellerne i 10 mL Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 200 U/mL penicillin G, 200 μg/mL streptomycin og 0,5 μg/mL amphotericin B i T-75-kolber ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator.
- Forbered CVA16 ved at formerings virussen i RD-celler og bestemme viral titer i PFU/mL. For optimeret protokol henvises til reference11.
- Klargør test forbindelserne og kontrollerne ved hjælp af deres respektive opløsningsmidler: for eksempel opløses CHLA og PUG i dimethylsulfoxid (DMSO). For alle infektion trin, den basale medium bestod af DMEM plus 2% FBS og antibiotika.
Bemærk: Den endelige koncentration af DMSO i de test sammensatte behandlinger er lig med eller under 0,25% i forsøgene; 0,25% DMSO er inkluderet som en negativ kontrol behandling i assays til sammenligning. - Udføre cytotoksicitet analyse af test forbindelser på RD-celler ved hjælp af en cellelevedygtighed bestemme reagens såsom XTT ((2,3-bis [2-methoxy-4-Nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxid). For detaljeret protokol henvises til reference12. Bestemme cytotoksicitet koncentrationer af test forbindelser ved hjælp af en analytisk software såsom GraphPad Prism i henhold til producentens protokol. Lægemiddelkoncentrationer, der ikke påvirker cellernes levedygtighed signifikant (≥ 95% levedygtige celler), anvendes i resten af studiet.
2. analyse af tidspunktet for lægemiddel tilsætning
-
For at evaluere indflydelsen af lægemidler på værtsceller før virus infektion (forbehandling)
- Seed RD-celler i 12-brønds plader ved en såning tæthed på 2 x 105 celler/godt. Inkubér natten over ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for at opnå et monolayer.
- Behandling af RD-celler med test forbindelser ved ikke-cytotoksiske koncentrationer (bestemt fra trin 1,4) i 1 mL basal medie volumen i 1 time eller 4 timer.
- Vask celler med 1-2 ml PBS, før du tilføjer 50 PFU/Well of virus i basal medium (den endelige volumen af inokulum er 300 μl) for 1 h. klippe pladen hver 15 min.
- Efter infektionen vaskes monolayerne igen ved hjælp af PBS, derefter overlay med 1 mL basal medier indeholdende 0,8% methylcellulose til yderligere inkubation ved 37 ° c i en 5% CO2 kubiator.
- Efter 72 h inkubation fjernes overlay-mediet, og brøndene vaskes med 2 mL PBS.
- Fastgør brøndene ved hjælp af 0,5 mL 37% formaldehyd i 15 min.
- Fjern supernatanten og vask igen med PBS.
- Pletter brøndene ved hjælp af 0,5 mL 0,5% krystalviolet opløsning. Fjern derefter pletten inden for 2 minutter og vask brøndene med en blid strøm af vand, før lufttørring.
- Tæl de virale plaques ved at placere pladen på en hvid-lys boks. Beregn procentdelen (%) CVA16 infektion som følger: (gennemsnit # af plaque virus + stof /Mean # af plaque virus + DMSO kontrol) × 100%.
-
At evaluere effekten af tilsætning af narkotika og virus samtidig (co-addition)
- Seed RD-celler i 12-brønds plader ved en såning tæthed på 2 x 105 celler/godt. Inkubér natten over ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for at opnå et monolayer.
- Behandling af RD-celler med test forbindelserne ved de relevante koncentrationer og 50 PFU/Well of CVA16 (den endelige volumen af inokulum er 300 μl) samtidig for 1 h. klippe pladen hver 15 min.
- Der vaskes med 1 mL PBS og derefter overlejring med 1-2 mL basal medie indeholdende 0,8% methylcellulose til yderligere inkubation ved 37 °C i en 5% CO2 -kubiator.
- Stain viral plaques med krystalviolet efter 72 h post infektion og bestemme% CVA16 infektion som beskrevet ovenfor.
-
Til at evaluere virkningen af lægemidlet efter virus indtastning (efter infektion)
- Seed RD-celler i 12-brønds plader ved en såning tæthed på 2 x 105 celler/godt. Inkubér natten over ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for at opnå et monolayer.
- Inokulere RD-cellerne med 50 PFU/Well of CVA16 (den endelige volumen af inocuum er 300 μL) for 1 h. klippe pladen hver 15 min.
- Brøndene vaskes med 1-2 mL PBS og overlejrer cellerne med basale medier indeholdende 0,8% methylcellulose og de relevante koncentrationer af test forbindelser.
- Stain viral plaques med krystalviolet og tælle efter 72 h post infektion og bestemme% CVA16 infektion inkubationer beskrevet ovenfor.
Bemærk: Udfør alle PBS-skyller forsigtigt for at undgå at løfte cellerne.
3. strømnings cytometri-baseret bindings analyse
- Seed RD-celler i 12-brønds plader ved en såning tæthed på 2 x 105 celler/godt. Inkubér natten over ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator for at opnå et monolayer.
- Pre-chill cellen enkeltlags ved 4 °c i 1 time.
- Inficere RD-celler med CVA16 (MOI = 100) ved tilstedeværelse og fravær af test forbindelser i 3 timer ved 4 °C.
Bemærk: Udfør viral inokulering på is og den efterfølgende inkubation i et 4 °C køleskab for at holde temperaturen ved 4 °C, hvilket tillader viral binding, men ikke adgang. - Fjern virus inokulum og vask en gang med 1-2 mL iskold PBS.
- Løft cellerne ved at tilsætte 1 mL iskold dissociations buffer til brøndene på is i 3 minutter, før cellerne indsamles, og de opblandes i en iskold flow cytometri-buffer (1x PBS plus 2% FBS).
- Vask cellerne to gange ved hjælp af iskold flow cytometri buffer og fastgør cellerne med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min på is.
- Vask cellerne ved hjælp af PBS for at fjerne eventuelle ubundne eller svagt bundne vira, og plette derefter cellerne med 1 mL anti-VP1 antistof (1:2000; fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA) på is i 1 time, efterfulgt af inkubation med en sekundær Alexa 488-konjugeret anti-mus IgG (1:250; fortyndet i PBS indeholdende 3% BSA) på is i 1 h. Foretag PBS skylninger (3 gange) efter hver antistof behandling.
- Cellerne opslæmmes i 0,5 mL af den iskold flow cytometri-buffer og udfører flow cytometri-analyse på et flow-flowcytometer ved hjælp af standardprocedurer. Præsenterer data i histogrammer ved hjælp af den tilhørende software og kvantiterer for søjlegraf repræsentation.
4. analyse af viral inaktivering
-
Udfør viral inaktiverings analysen som tidligere beskrevet12 under anvendelse af følgende betingelser:
-En startkoncentration på 106 PFU/ml CVA16.
-Celle monolag i 12-brønds plader fra en såning tæthed på 2 x 105 celler/brønd.
-50-fold fortynding til titrering af lægemiddel forbindelser, hvilket resulterer i en endelig viruskoncentration på 50 PFU/Well.
-Vask trin med 1-2 mL PBS.
-Overlay-medier, der indeholder 0,8% methylcellulose. - Udfør endelig aflæsning af viral infektion ved hjælp af krystalviolet farvning af viral plaques procedure som beskrevet ovenfor.
5. analyse af molekylær docking
- Download 3D molekyler af test forbindelser fra PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Hvis molekyler ikke har en 3D-struktur uploadet, skal du downloade 2D-strukturerne eller bruge Lyskæden i SMILET og omdanne dem til 3D-molekyler via et molekyle program (f. eks. CORINA).
- Download viral biologisk samlings enhed fra RCSB protein data Bank (https://www.rcsb.org/) og Forbered den virale strukturmodel ved hjælp af en biocomputing program (f. eks UCSF Chimera). For eksempel, i tilfælde af CVA16 moden virion Crystal struktur (FBF: 5C4W)3, slette opløsningsmidler fra FBF fil, erstatte ufuldstændige sidekæder ved hjælp af data fra Dunbrach 2010 rotamer biblioteket, og tilføje hydrogener og afgifter til strukturen som tidligere rapporterede13. Docking-mål kan være alle relevante virale proteiner til den tilsigtede analyse med en biologisk samlings information (protein data Bank).
-
Dock test forbindelser på den forberedte virus enhed ved hjælp af for eksempel UCSF Chimera, og analysere output-filer med en visualisering software (f. eks Autodock Vina, PyMol):
- Upload testen sammensatte fil til UCSF Chimera som ' ligand ' og udføre blind docking ved at vælge hele forberedt viral protein som ' receptor '. Brug computermusen eller pegefeltet til at ændre størrelsen på søge lydstyrken til hele ' receptoren '. I "avancerede indstillinger" kan antallet af bindings tilstande være højest. Dockingrammer vil automatisk blive rangeret fra højeste til laveste bindingsenergi.
- Valgfri Ved blind docking skal du begrænse dockingstedet til det virale protein i områder af interesse afledt af de blinde dockingresultater ved hjælp af musen eller pegefeltet igen for at reducere søge lydstyrken (f. eks. 100 Å x 100 Å x 100 Å). Dette trin hjælper med at bekræfte resultaterne af blind docking og øger specificiteten.
- Brug et Molekylær grafiksystem (f. eks. PyMol) til at analysere bindings tilstandene ved at uploade dockingfilen. Find polære kontakter fra forbindelsen til det virale protein ved at vælge ' ligand ' og identificere Polar kontakter med muligheden ' til alle atomer '; Undersøg resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tid-af-stof-tilsætning analyse er angivet i figur 1 og viser indflydelsen fra behandling ved hjælp af de små MOLEKYLER chla og Pug på CVA16 infektion enten præ-viral indrejse (forbehandling), under viral indrejse (co-addition), eller post-viral indrejse ( efter infektion). Begge små molekyler producerede kun marginal effekt mod CVA16 infektivitet, uanset om de var i forbehandling af værtscellerne før virus infektion (figur 1a) eller efter infektions behandling (figur 1c). I modsætning hertil ophævede CHLA og PUG effektivt den CVA16 infektion med > 80% i den Co-addition behandling (figur 1b). Disse observationer tyder derfor på, at de to forbindelser er mest effektive, når de samtidig er til stede med viruspartiklerne på værtscellens overflade under infektionen.
I figur 2bekræfter strømnings cytometri-baseret bindings analyse (skematisk illustreret i figur 2a), at de to tanniner forhindrer CVA16 indtastning ved at forhindre viral partikel binding til værtscellerne. Kvantificerings dataene i figur 2b viser, at mængden af virus, der er påvist på RD-cellens overflade i nærværelse af de to lægemidler, er mindre end 10%, svarende til heparin-positiv kontrol, som vides at forhindre CVA16 fastgørelse14. Figur 2c, 2Dog 2E viser de associerede flowcytometri histogrammer, hvor bånd skiftet på grund af detektion af CVA16 på RD-cellens overflade REDUCERES betydeligt, når chla og Pug er til stede.
Figur 3a viser, hvordan forsøget med viral inaktivering blev udført. Stof forbindelsen blev enten blandet med de CVA16 viruspartikler og inkuberet i 1 time (langsigtet) forud for fortyndings trinnet eller blandet og straks fortyndet (kortvarig) før infektionen. Som vist i figur 3bførte en præ-inkubation af de CV16 partikler med test agenterne i 1 h til en nær fuldstændig beskyttelse af RD-cellerne mod virusinfektionen sammenlignet med kortvarig inkubation og DMSO-kontrollen. Resultaterne tyder derfor på, at både CHLA og PUG interagerer med de CVA16 partikler og er i stand til at gøre dem inaktive i den efterfølgende infektion.
Da vores data indikerer, at narkotika forbindelser kan direkte inaktivere CVA16 partikler, og dermed identificere virion selv som et plausibelt mål for deres antiviral aktivitet, vi brugte molekylære docking til at forudsige den potentielle interaktion (r) mellem disse og CVA16 kapsid-pentamer. Figur 4a viser en overflade projektion af CVA16 pentamer kosmetisk, som udgør icosahedral kapsid af CVA16 virion. Molekylær docking af tanniner CHLA (figur 4b; grøn) og Pug (figur 4c; blå) indikerer, at de begge er forudsagt at binde i Canyon-regionen af CVA16 pentamer. Specifikt, begge små molekyler bundet lige over lommen indgangen (figur 4b og 4c, zoomede paneler), som holder lomme faktoren og spiller en vigtig rolle for mæthed CVA16 binding og indrejse i værtscellen. Både CHLA og PUG synes derfor at maskere lomme indgangen region, som teoretisk ville hindre interaktioner mellem viruspartikler og Host celle receptorer. Figur 4d og 4e angiver de unikke rester, der forudsiges fra de polære kontakter i henholdsvis chla og Pug, omkring lomme indgangen, og de fleste af disse interaktioner forekommer med VP1 for begge forbindelser og de 3 aminosyrer ASN85 , Lys257, og asn417 er til fælles mellem de to tanniner.
Figur 1: virkningen af CHLA og PUG på Time-of-Drug-tilsætning mod CVA16 infektivitet. RD-celler blev behandlet med CHLA (20 μM) eller PUG (25 μM) på forskellige tidspunkter med CVA16 inokulation (50 PFU/brønd). DMSO (0,25%) behandling var inkluderet som negativ kontrol og alle assays blev analyseret ved plaque assay ved hjælp af krystalviolet farvning 72 h efter inkubation. A) til forbehandling blev cellerne inkuberet med test forbindelserne i 1 time eller 4 timer og derefter VASKET før CVA16 infektion. (B) for Co-addition assays, celler blev administreret med narkotika og virus samtidigt i 1 h og derefter vasket. (C) i post-infektion, celler blev inficeret med CVA16 for 1 h, vasket, og derefter behandlet med test forbindelser. De viste data er middel ± standardafvigelsen (SD) fra tre uafhængige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med den respektive gruppe "kun virus". Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs analyse af variansen. Dette tal er blevet tilpasset fra reference9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CHLA og PUG AFSKAFFER CVA16 binding til værtscellen. A) skematisk af strømnings cytometri-baseret bindings analyse. (B) RD-celler (2 x 105 celler/brønd) blev inficeret med CVA16 (Moi = 100) ved tilstedeværelse eller fravær af Chla (20 ΜM), Pug (25 μm), opløseligt heparin (500 μg/ml, positiv kontrol) eller DMSO (0,25%, negativ kontrol) i 3 timer ved 4 °c. Inocula fra brønde blev samlet i rør, vasket med PBS to gange, fast, og plettet med anti-VP1 antistof efterfulgt af Alexa 488-konjugeret sekundært antistof til flow flowcytometri påvisning af overflade-bundne vira. Kvantificerede data fra de detekterede fluorescens signaler blev afbildet som middel ± SD fra tre uafhængige eksperimenter i søjlegrafen som ' virus binding (%) '. *p < 0,05 sammenlignet med "DMSO"-kontrolbehandlingen. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs analyse af variansen. De repræsentative strømnings cytometri-histogrammer af CHLA (C), Pug (D) og heparin (E)-behandlinger vises. Dette tal er blevet tilpasset fra reference9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: CHLA og PUG inaktivere celle-fri CVA16 viruspartikler. A) skematisk af viral inaktiverings analysen. B) CVA16 (106 PFU/Well) blev behandlet med Chla (20 ΜM) eller Pug (25 μm) og straks blandet med kort tids inaktivering eller inkuberet i 1 time ved 37 °c for langvarig inaktivering, før det fortyndes 50 gange til en ikke-effektiv koncentration af test forbindelser, før de inokulerer på RD-celler (endelig viruskoncentration = 50 PFU/Well). DMSO (0,25%) blev brugt som en negativ kontrol. Eksperimenter blev analyseret ved plaque assay ved hjælp af krystalviolet farvning 72 h efter infektion. De viste data er midlerne ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med den respektive gruppe "kun virus". Statistisk analyse blev udført ved hjælp af envejs analyse af variansen. Dette tal er blevet tilpasset fra reference9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: chla og Pug mål CVA16 kapsid i nærheden af lomme indgangen. Overflade projektion af CVA16 virion-partiklen med den monomeriske strukturelle pentamer kosmetisk afgrænset af røde streger (A). Yderligere pentamers på virion er vist i cyan, magenta, Indigo, bronze og grøn. Molekylær docking-analyse af CHLA (B, grøn) og Pug (C, blå) på CVA16-pentamer kosmetisk (FBF: 5c4w); zoomede paneler afgrænses i gult. VP1 = orange, VP2 = grå, VP3 = hvid; Polar-kontakter vises som sorte streger. Rester, som make-up Pocket indgangen er farvet rød (Ile 94,ASP 95, gln207, met212, met213, lys257, thr258). D, E. Close-up side view ind i canyonen, hvor lommen indgangen er placeret, og hvor CHLA (D) og Pug (E) binde til. Unikke rester, der er Polar-kontakter fra forbindelsers polære kontakter på pentamer kosmetisk, er mærket med gul (VP1), hvid (VP2) og i sort (VP3) skrifttyper. Den hvide stiplede linje angiver lomme indgangs regionen. Dette tal er blevet tilpasset fra reference9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapport beskrev vi de protokoller, der er nyttige til identifikation af antivirale kandidater, der er målrettet mod viral indrejse, især i forhold til de ikke-kappeklædte CVA16. Assays er designet på måder at dissekere de tidlige hændelser under viral indrejse, hvilket er nyttigt at præcisere mekanismen (r) af handling og potentielle mål (r) af test agenternes antiviral aktivitet. "Time-of-Drug-tilsætning"-assay giver mulighed for bredt at bestemme det potentielle mål for test forbindelserne, for eksempel de ikke-inficerede værtsceller (forbehandlings analyse), viruspartiklerne eller dets interaktioner med værtscellens overflade (co-addition analyse ) eller den virusinficerede værtscelle i den virale replikerende fase (analyse efter infektion). Denne analyse alene kan bestemme interaktions metoden fra forbindelserne (f. eks. co-addition), der fører til de efterfølgende analyser, som er beskrevet i denne protokol (f. eks. viral inaktiverings analyse og bindende analyser). Vaske trin er afgørende for at sikre, at den behandlede behandlingsmetode er specifik for den analyserede. Anvendelsen af den» flow cytometri-baserede bindings analyse «er med til at vurdere de forbindelser, som specifikt vedrører virus binding til værtscellen. Opretholdelse af temperaturen i forsøget ved 4 °C er vigtigt for den endelige påvisning af virions på cellens overflade, da denne temperatur tillader viral binding, men ikke adgang. "Viral inaktivering assay" kan støtte til at bestemme potentielle fysiske interaktion af narkotika forbindelser med de celle-fri viruspartikler. Det kritiske trin er fortyndingen til titrering af narkotika forbindelserne efter inkubation med viral inoculum, da dette er nødvendigt for at forhindre enhver meningsfuld interaktion af lægemidlerne med værtscellens overflade i den efterfølgende infektion trin12.
Da viral Entry er en multi-step begivenhed, en viral Entry hæmmer klasse af antivirale midler kan muligvis udøve flere typer af mekanismer, herunder: (1) modulere celleoverflade indgangs faktorer/receptorer eller dens tilhørende signalerings veje; 2) påvirkning af cellemembranens fluiditet eller integritet 3) målretning mod elektrostatiske eller van der Waals-interaktioner mellem viruspartiklerne og værtscellens overflade (4) inducerende fysiske ændringer i virions såsom partikel brud eller sammenlægning; 5) binding til virale glykoproteiner eller kapsid-proteiner og til forebyggelse af deres funktioner eller ændringer i kropsbygning 6) blokering af fusionsrelaterede mekanismer og (7) forhindre frigivelse af viral genom inde i værtscellen. De analyser, der er beskrevet i denne rapport, kan derfor bidrage til at pege på de ovenfor anførte potentielle virknings måder, som kan valideres yderligere ved hjælp af yderligere eksperimenter. Endelig er den "molekylære docking-analyse", der er beskrevet her, medvirkende til at forudsige potentielle interaktionsområder mellem narkotika forbindelserne og viruspartiklerne og kan som sådan hjælpe med at identificere ansøger virale kapsid-eller glykoprotein-bindemidler og de målrettede rester på viruspartiklerne. Men disse forudsigelser er afhængige af docking-software, og opløsningen og nøjagtigheden af de virale protein krystalstrukturer. Det er vigtigt at bemærke, at den valgfri indesluttede docking-metode i trin 5.3.2 blev tilføjet, fordi ofte ved brug af virale strukturelle proteiner som ' receptor ' molekyle, kan ligand muligvis binde til regioner, der normalt ikke er tilgængelige eller eksponeret på overfladen ( f. eks. under overfladen af virion kapsid, som vender mod indersiden af virion, transmembran regioner med konvolut glykoproteiner osv.). Begrænser søgefeltet tillader kun tilgængelige områder af det virale protein til at være målrettet og regler ud urealistiske interaktioner. Molekylær docking er afhængig af krystalliserede strukturer, men nylige fremskridt inden for Homologisk modellering har gjort det muligt at analysere ikke-krystalliserede strukturer ved at montere dens aminosyresekvens på en nært beslægtet krystalliseret struktur15. Dette har gjort det muligt at analysere flere strukturer, og de indhentede oplysninger kan være nyttige for yderligere undersøgelser, herunder mutationelle analyser, der kan hjælpe med at validere de forventede interaktioner.
Konklusionen er, at de undersøgelser og protokoller, der er beskrevet i denne rapport, specifikt er taget hensyn til at identificere antivirale agenser, som er målrettet mod viral indrejse, og give oplysninger om, hvilket trin af viral indrejse processen test agenten er målrettet mod, om de interagere med gratis viruspartikler, og forudsige mulige Drug interaktion sites på virions. Disse typer af assays kan gentages på andre ikke-kappeklædte vira eller tilpasset til kappeklædte vira som en metode til screening af antivirale narkotika forbindelser for mulige hæmmere af viral indrejse. Ved hjælp af en sådan mekanisme-drevet tilgang til at identificere antivirale kandidater kunne bidrage til at fremskynde narkotika udvikling proces og udvide omfanget af antiviral Therapeutics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelig for Dr. Joshua Beckham på University of Texas i Austin for teknisk support med molekylær docking. Denne undersøgelse blev delvis støttet af finansiering fra det taiwanske videnskabs-og teknologiministerium (MOST107-2320-B-037-002 til C.-J.L. og L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 og MOST107-2320-B-038-034-MY3 til L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
