Summary
מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הנושא השונה המתייחס לערך ויראלי שניתן להשתמש בו כדי לזהות מעכבי כניסה ויראלית של מועמד.
Abstract
אנטי וירוס מספר כי המכונה לבחון כניסה ויראלית הם רלוונטיים להבחין באיזה שלב הסוכנים העריכו הם יעילים ביותר, ולאפשר זיהוי של מועמד ויראלי כניסה מעכבי. כאן, אנו מציגים את הגישות הנסיוניות לזיהוי מולקולות קטנות המסוגל לחסום את הזיהום על ידי וירוס שאינו עטוף A16 (CVA16) דרך המיקוד חלקיקי וירוס או צעדים ספציפיים בכניסה ויראלי מוקדם. Assays כולל ניתוח זמן של תרופות בתוספת התרופה, שיטת הכריכה המבוססת על הזרמת cy, ושיטת הפעלה ויראלית. אנו גם להציג פרוטוקול עגינה מולקולרית ניצול וירוס מקפיסיד חלבונים כדי לנבא שאריות פוטנציאליים ממוקדות על ידי תרכובות אנטי ויראליות. מספר זה אמור לסייע בזיהוי של סוכני אנטי וירוס מועמדים הפועלים על כניסה ויראלית. כיוונים עתידיים יכולים לחקור את המעכבי האפשריות לפיתוח סמים נוסף.
Introduction
יד, כף הרגל, ומחלת הפה (hfmd) היא מחלה הנגרמת בדרך כלל על ידי הנגיף A16 (CVA16) ו מעיים 71 (EV71) אצל ילדים צעירים. לאחרונה מעבר לאזור אסיה-פסיפיק, הייתה הפיכה משמעותית של HFMD המושרה ב-CVA16. בעוד הסימפטומים יכולים להיות מתון, סיבוכים חמורים יכולים להתרחש המשפיעים על המוח והלב, עם הרוגים פוטנציאליים1,2. כיום, אין טיפולים אנטי ויראליים מורשה או חיסונים זמינים עבור CVA16, ולכן יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות אנטי ויראליות כדי לרסן התפרצויות עתידיות ואת הסיבוכים הקשורים.
CVA16 הוא וירוס שאינו עטוף אשר מורכב capsaמישור המורכב מפנטאמרס כי כל אחד מכיל 4 חלבונים מבניים כלומר VP1, VP2, VP3, ו VP4. המקיף כל ציר חמש מתקפל בפנטעאמר הוא אזור ' קניון ' המראה כדיכאון והוא מציין את תפקידה בכריכת הקולטן3. בחלק התחתון של הקניון הזה נמצא כיס הידרופובי באזור VP1 המכיל ליגוגיה שומני טבעי, ספיגוסינוס (SPH). קולטנים סלולריים, כגון האדם P בסלטין גליקופרוטאין ליגנד 1 (psgl-1) ו מחלקת הקולטן הנבלות חבר B 2 (SCARB2), הוצעו לשחק תפקיד בכריכה ויראלית על ידי העברת ליגאס זה והתוצאות שינויים בקונפורמה לקפיסידה וה הוצאה בעקבות הגנום הנגיפי לתוך התא המארח4,5,6. זיהוי מעכבי אפשריים החוסמים את האירועים הרצופים בתהליך הכניסה הנגיפי יכול לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות נגד זיהום CVA16.
ניתן לגזור את השלבים במחזור החיים של הווירוס באמצעות גישות נסיוניות כמטרות כדי לסייע בזיהוי סוכני אנטי-וירוס ספציפיים למצב. ניתוח של זמן של סמים בנוסף בוחן את האפקט של טיפול בסמים בתקופות שונות במהלך הזיהום הנגיפי, כולל טרום כניסה (הוסיף לפני זיהום וירוס), כניסה (הוסיף במקביל לזיהום וירוס), ולאחר הזנה (נוסף בעקבות זיהום וירוס)7. ההשפעה יכולה להיות מוערך באמצעות בדיקת רובד סטנדרטי על ידי כימות הפלאק ויראלי שנוצרו בכל תנאי הטיפול. הזרימה של שיטת הכריכה הנגיפית המבוססת על cy, קובעת אם הסם מונע החזקה ויראלית לתאים מארחים. זה מושגת על ידי העברת הטמפרטורה מ 37 ° c, שבו רוב של זיהומים הנגיף האנושי להתרחש, עד 4 ° c, שם הריטונים מסוגלים לאגד את משטח התא מארח אך אינם יכולים להיכנס לתאים7. התא חלקיקי קרום וירוס מאוגד הם לאחר מכן כימות באמצעות מכתים חיסוני נגד אנטיגנים ויראלי המוערך על ידי cy, לנסות הזרימה. הבדיקה הנגיפית של ההפעלה מצד שני מסייעת להעריך את האינטראקציות הפיזיות הפוטנציאליות של התרופה עם חלקיקי וירוס בחינם, להגן או לנטרל את הריטונים, או לגרום לצבירות או ליצירת שינויים שיגרמו להם להפוך לבלתי פעילים עבור אינטראקציות עוקבות עם משטח התא של המחשב המארח במהלך ההדבקה8,9. בניסוי זה, מותר הנגיף הנגיפי הראשון לדגירה עם התרופה לפני היותו מדולל כדי נכייל את התרופה לפני הדבקה של התא המארח מונרוייר וביצוע שיטת הפלאק סטנדרטי8. לבסוף, עגינה מולקולרית הוא כלי רב עוצמה כדי לנבא את האתרים הפוטנציאליים אינטראקציה הסמים על פני השטח והריאון, כולל גליקורופנים נגיפי מפני וירוסים עטופים והחלבונים capsid ויראלי מווירוסים שאינם עטופים, באמצעות חישובים אלגוריתמים. זה עוזר לספק מטרות באופן מדויק של מצב התרופה של הפעולה ומספקים מידע שימושי שיכול להיות מאומת נוסף על ידי במורד הזרם.
לאחרונה העסקנו את השיטות המתוארות לעיל כדי לזהות תרכובות אנטי ויראליות שחסמו ביעילות את הזיהום על ידי CVA169שאינם עטופים. להלן, הפרוטוקולים המפורטים ששימשו לשימוש מתוארים ודנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל תרבות התא וזיהומים וירוס חייב להתבצע בקולטי בטיחות מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות ביולוגית של הדגימות המטופלות. שני tannin מחלקה של חומצה מולקולות chebulagic קטנה (CHLA) ו punic, כי נצפו ביעילות לחסום CVA16 זיהום9, משמשים כדוגמאות של סוכני מעכבות המועמדים. עבור עקרונות בסיסיים בטכניקות וירולוגיה, הפצת וירוסים, קביעת titer וירוס, ומושגים של יחידות יצירת פלאק (PFU) או ריבוי של זיהום (מוי), הקורא הוא התייחסות10.
1. תרבות התא, הכנת וירוס, הכנה מורכבת, ורעילות מורכבת
- בתאי השרירים האנושיים (RD) הם תאים מארחים מתירני לזיהום CVA1611. לגדל את התאים RD ב 10 מ ל של מדיום שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 200 U/mL פניצילין G, 200 μg/mL סטרפטומיצין, ו 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B ב-T-75 מבחנות ב 37 ° c ב 5% ושות2
- הכן CVA16 על ידי הפצת הווירוס בתאי RD ולקבוע סיכוייו נגיפי ב pfu/mL. עבור פרוטוקול ממוטב, עיין בהפניה11.
- הכינו את תרכובות הבדיקה ואת הבקרות באמצעות ממיסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ו פוג ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עבור כל שלבי ההדבקה, המדיום הבזלי היה מורכב DMEM ועוד 2% FBS ו אנטיביוטיקה.
הערה: הריכוז הסופי של DMSO בטיפולים מורכבים שווה או מתחת 0.25% בניסויים; 0.25% DMSO כלול כטיפול בשליטה שלילית באספרא להשוואה. - לבצע את השימוש הרעילות ציטובית של תרכובות הבדיקה על התאים הRD באמצעות הכדאיות תא לקביעת מגיב כגון XTT (2, 3-bis [2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-פנילאמינו)-2H-טטרזויום הידרוקסיד). לפרוטוקול מפורט, אנא התייחס להפניה12. קבע את ריכוזי הרעלים של תרכובות הבדיקה באמצעות תוכנה אנליטית כגון מנסרה גראפד על פי פרוטוקול היצרן. ריכוזי סמים שאינם משפיעים באופן משמעותי על הכדאיות התאית (≥ 95% תאים בעלי יכולת) משמשים לשארית המחקר.
2. זמן התרופה-שיטת החיבור
-
כדי להעריך את השפעת התרופות על תאים מארחים לפני זיהום נגיפי (טיפול מקדים)
- התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 105 תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%2 לקבלת מונאולייר.
- לטפל בתאי RD עם תרכובות מבחן בריכוזים שאינם ציטוטוקסיים (נקבע משלב 1.4) ב 1 מ ל של נפח מדיה בסיס עבור 1 h או 4 h.
- לשטוף את התאים עם 1-2 mL של PBS לפני הוספת 50 PFU/טוב של וירוס בינוני בסיס (הנפח הסופי של האיתרשת הוא 300 μL) עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
- בעקבות הזיהום, לשטוף את monolayers שוב באמצעות PBS, ואז שכבת עם 1 mL של מדיה בסיס המכיל 0.8% מתילתאית לדגירה נוספת ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה.
- לאחר 72 h של דגירה, להסיר את התקשורת שכבת-על ולשטוף את הבארות באמצעות 2 מ"ל של PBS.
- תקן את הבארות באמצעות 0.5 mL של 37% פורמלדהיד עבור 15 דקות.
- הסר את הסופרנטנט ושטוף שוב באמצעות ה-PBS.
- הכתם את הבארות באמצעות 0.5 mL של 0.5% קריסטל הפתרון הסגול. ואז להסיר את הפתרון הכתם בתוך 2 דקות ולשטוף את הבארות עם זרם עדין של מים לפני ייבוש האוויר.
- לספור את הפלאק ויראלי על ידי הצבת צלחת על תיבת אור לבן. חישוב האחוז (%) CVA16 זיהום כדלקמן: (מתכוון של וירוס פלאק + תרופה /ממוצע של וירוס פלאק + dmso שליטה) × 100%.
-
כדי להעריך את ההשפעה של הוספת התרופות והווירוס בו (תוספת משותפת)
- התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 105 תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%2 לקבלת מונאולייר.
- לטפל בתאי RD עם תרכובות המבחן בריכוזים המתאימים ו-50 PFU/טוב של CVA16 (הנפח הסופי של האינות1 הוא 300 μL) בו עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
- לשטוף תאים עם 1 מ ל של PBS ולאחר מכן כיסוי עם 1-2 mL של המדיה הבזליים המכיל 0.8% מתילתאית לדגירה נוספת ב 37 ° c ב 5% שיתוף חממה2 .
- כתם נגיפי שלטים עם גביש סגול לאחר 72 h לאחר ההדבקה ולקבוע את הזיהום% CVA16 כפי שמתואר לעיל.
-
להערכת אפקט טיפול בסמים לאחר הזנה ויראלית (לאחר ההדבקה)
- התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 105 תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%2 לקבלת מונאולייר.
- איחסן את התאים RD עם 50 PFU/באר של CVA16 (הנפח הסופי של האינות1 הוא 300 μL) עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
- לשטוף את הבארות עם 1-2 mL של PBS ו כיסוי התאים עם מדיה בסיס המכיל 0.8% מתילתאית ואת ריכוזי המתאים של תרכובות בדיקה.
- כתם נגיפי שלטים עם גביש סגול לספור אחרי 72 h לאחר ההדבקה ולקבוע את הזיהום% CVA16 incubations שתוארו לעיל.
הערה: לבצע את כל שוטף PBS בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.
3. שיטת האיגוד המבוססת על הזרמת הזרימה
- התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 105 תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%2 להשגת מונאולייר.
- לפני הצינה מונאולייר התא ב -4 ° c עבור 1 h.
- להדביק את התאים הRD עם CVA16 (מע = 100) בנוכחות והעדר תרכובות הבדיקה עבור 3 h ב 4 ° c.
הערה: בצעו את החיסון הנגיפי על הקרח ואת הדגירה שלאחר מכן במקרר של 4 ° c כדי לשמור על הטמפרטורה ב -4 ° c, אשר מתיר כריכה ויראלית אך לא כניסה. - הסרת וירוסים האירשת ולשטוף פעם אחת עם 1-2 mL של הקרח קר PBS.
- הרימו את התאים על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר דיסוציאציה קר קרח לבארות על הקרח עבור 3 דקות, לפני איסוף התאים והשעיית אותם מחדש הקרח קר הזרימה cy, לנסות מאגר (1x PBS פלוס 2% FBS).
- לשטוף את התאים פעמיים באמצעות הקרח-קר cy, לנסות מאגר ולתקן את התאים עם 0.5 mL של 4% פאראפורמלדהיד עבור 20 דקות על הקרח.
- שטוף את התאים באמצעות PBS כדי להסיר וירוסים כבולים לא מאוגדים או חלש, ולאחר מכן הכתם את התאים עם 1 מ ל של נוגדן anti-VP1 (1:2000; מדולל ב-PBS המכיל 3% bsa) על הקרח עבור 1 h, ואחריו דגירה עם אלקסה משנית 488-מעלה מצושל ה1:250 עכבר ה מדולל ב-PBS המכיל 3% BSA) על הקרח עבור 1 h. בצע מנקי PBS (3 פעמים) לאחר כל טיפול נוגדן.
- להשעות מחדש את התאים ב 0.5 mL של הקרח-קר cy, לנסות מאגר ולבצע הזרימה cy, לנסות ניתוח על cytometry זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים. הצגת נתונים ב היסטגרמות באמצעות התוכנה המשויכת וכימות עבור ייצוג גרף עמודות.
4. שיטת הפעלה נגיפית
-
בצע את שיטת ההפעלה הנגיפית שתוארה בעבר12 באמצעות התנאים הבאים:
-ריכוז התחלתי של 10שישה pfu/ML של CVA16.
-מונאולאיירס תא RD ב 12-טוב צלחות מצפיפות הזריעה של 2 x 105 תאים/טוב.
-50-מקפלים לדילול עבור titrating את תרכובות התרופה וכתוצאה מכך ריכוז וירוס הסופי של 50 PFU/טוב.
-לשטוף את הצעדים באמצעות 1-2 mL של PBS.
-מדיה שכבת-על המכילה 0.8% מתילצלולוזה. - ביצוע הבדיקה הסופית של זיהום נגיפי באמצעות כתמים סגול קריסטל של שלטים ויראלי הליך כמפורט לעיל.
5. ניתוח עגינה מולקולרית
- הורד מולקולות 3D של תרכובות בדיקה מ-"פוכימיה" (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). אם מולקולות לא יש מבנה תלת-ממד שהועלו, להוריד את המבנים 2D או להשתמש ברצף מחרוזת חיוכים ולהפוך למולקולות תלת-ממד באמצעות תוכנית מולקולרית (g. CORINA).
- הורד ויראלי יחידת הרכבה ביולוגית מהבנק לנתוני חלבון RCSB (https://www.rcsb.org/) ולהכין את מודל המבנה הנגיפי באמצעות תוכנית biocomputing יחשוב (למשל, הכמרה). לדוגמה, במקרה של CVA16 בוגרת מבנה גבישי קריסטל (PDB: 5C4W)3, למחוק ממיסים מהקובץ PDB, להחליף שרשראות צד לא הושלמה באמצעות נתונים מתוך הספרייה Dunbrach 2010 rotamer ולהוסיף הידרוגנים וחיובים למבנה כמו בעבר דיווחו על13. מטרות עגינה יכולות להיות כל חלבונים ויראליות רלוונטיים לניתוח המיועד עם מידע הרכבה ביולוגי (בנק הנתונים של החלבון).
-
עגן תרכובות הבדיקה על יחידת וירוס מוכן באמצעות למשל UCSF המרה כמירה, ולנתח את קבצי הפלט עם תוכנת ויזואליזציה (למשל, Autodock Vina, פימול):
- להעלות את הקובץ מתחם הבדיקה לתוך הכמירה בתור "ligand" ולבצע עגינה עיוורת על ידי בחירת החלבון כולו מוכן ויראלי כמו ' קולטן '. השתמש בעכבר המחשב או trackpad כדי לשנות את גודל החיפוש לאורך כל ' קולטן '. באפשרות ' אפשרויות מתקדמות ', הרשה למספר מצבי האיגוד להיות מקסימום. מסגרות עגינה יודרגו באופן אוטומטי מהאנרגיה הגבוהה ביותר לאיגוד הנמוך ביותר.
- אופציונלי בנוסף לעגינה עיוורת, להגביל את אתר העגינה אל החלבון הנגיפי באזורים של עניין נגזר מתוצאות העגינה עיוור באמצעות העכבר או trackpad שוב כדי להפחית את עוצמת החיפוש (למשל, 100 Å x 100 Å x 100 Å). שלב זה מסייע לאשר את תוצאות העגינה העיוורת ומגדיל את הפירוט.
- השתמש במערכת גרפית מולקולרית (לדוגמה, PyMol) כדי לנתח את מיקומי מצבי האיגוד על-ידי העלאת קובץ העגינה. מצא את אנשי הקשר הקוטבי מהמתחם אל החלבון הנגיפי על ידי בחירת ' ligand ' וזיהוי אנשי קשר קוטביים עם האפשרות ' לכל האטומים '; בדוק את התוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזמן של הטיפול בתוספת סמים מצוין באיור 1 ומציג את ההשפעה מהטיפול באמצעות מולקולות קטנות CHLA ו פוג על זיהום CVA16 או הזנה טרום ויראלי (טרום טיפול), במהלך כניסה ויראלי (שיתוף בתוספת), או לאחר ויראלי כניסה ( לאחר ההדבקה). שתי המולקולות הקטנות הפיקו רק השפעה שולית נגד CVA16 הנגועים אם בטיפול הקדם של התאים המארחים לפני זיהום נגיפי (איור 1A) או בטיפול לאחר זיהום (איור 1a). לעומת זאת, CHLA ו-פאג ביעילות הCVA16 את הזיהום באמצעות > 80% בטיפול שיתוף בתוספת (איור 1B). מתצפיות אלה מצביעים על כך ששני התרכובות הן היעילות ביותר כאשר הן נמצאות בו עם חלקיקי הווירוס במשטח התא המארח במהלך ההדבקה.
באיור 2, הזרימה של ניתוח האיגוד המבוסס על cyCVA16 try (מומחש באיור 2 א) מאשרת ששני הטאנינים מונעים הזנה על-ידי מניעת כריכת החלקיקים הנגיפית לתאי המחשב המארח. הנתונים כימות באיור 2B מראה כי כמות הווירוס שאותרו על פני השטח תא RD בנוכחות של שתי תרופות, הוא פחות מ 10%, בדומה לפקד הפרין חיובי אשר ידוע כדי למנוע CVA16 מצורף14. איור 2C, 2c, ו- 2c מתארים את הזרם המשויך cy, לנסות היסטגרמות היכן המשמרת הלהקה עקב זיהוי של CVA16 על פני התא RD מופחת באופן משמעותי כאשר chla ו-פוג נוכחים.
איור 3A מתאר כיצד הניסוי הנגיפי ההפעלה בוצעה. מתחם התרופות היה מעורבב עם חלקיקי וירוס CVA16 ו מודבטים עבור 1 h (לטווח ארוך) לפני שלב הדילול, או מעורבב ומדולל מיד (לטווח קצר) לפני הזיהום. כפי שמוצג באיור 3B, טרום דגירה של חלקיקים CV16 עם סוכני הבדיקה עבור 1 h הוביל להגנה מלאה לחלוטין של התאים RD נגד זיהום נגיפי לעומת הדגירה לטווח קצר ושליטה dmso. התוצאות מרמזות על כך כי הן CHLA ו-פוג אינטראקציה עם החלקיקים CVA16 והם מסוגלים להפוך אותם פעילים בזיהום הבאים.
מאחר שהנתונים שלנו מצביעים על כך שתרכובות התרופות יכולות להשבית באופן ישיר חלקיקים CVA16, ולכן מזהים את הוויריאון עצמו כיעד סביר לפעילות האנטי-ויראלית שלהם, השתמשנו בעגינה מולקולרית כדי לנבא את האינטראקציה הפוטנציאלית בין אלה סוכנים. והCVA16 הקפיסיד פנטמר איור 4A מראה הקרנת פני השטח של CVA16 המחומש אשר מייצר את הקפיסידה האלסית של CVA16 virion. עגינה מולקולרית של הטאנינים CHLA (איור 4B; ירוק) ו-פוג (איור 4b; כחול) מצביעים על כך ששניהם הם ניבאו לאגד באזור הקניון של CVA16 מחומש. באופן ספציפי, הן מולקולות קטנות כרוך ממש מעל כניסת הכיס (איור 4B ו 4b, הגדלת פאנלים), אשר מחזיקה את גורם הכיס וממלא תפקיד חשוב עבור מדיה CVA16 הכריכה והכניסה לתא המארח. גם CHLA ו-פוג מופיעים להסוות את אזור כניסת הכיס, אשר תיאורטית לחסום את האינטראקציות בין חלקיקי וירוס לבין קולטני התא המארחים. איור 4D ו- 4d מצביעים על שאריות ייחודי החזוי מאנשי הקשר הקוטבי של chla ו פוג, בהתאמה, סביב כניסת הכיס, עם רוב האינטראקציות האלה המתרחשים עם VP1 עבור שני תרכובות ו 3 חומצות אמינו Asn85 , Lys257, ו-Asn417 להיות במשותף בין שני הטאנינים.
איור 1: השפעת זמן התרופה בתוספת של CHLA ופאג נגד CVA16 הנגועים. התאים הRD טופלו עם CHLA (20 μM) או פאג (25 μM) בתקופות שונות של CVA16 חיסונים (50 PFU/טוב). (0.25%) הטיפול נכלל כשליטה שלילית וככל בחני נותחו על ידי שיטת הפלאק באמצעות קריסטל סגול מכתים 72 h לאחר הדגירה. (א) לטיפול טרום, תאים היו מודבטים עם תרכובות הבדיקה עבור 1 h או 4 h ולאחר מכן נשטפו לפני זיהום CVA16. (ב) עבור שיתוף בנוסף, התאים היו מנוהלים עם סמים ווירוסים בו עבור 1 h ולאחר מכן שטף. (ג) לאחר זיהום, תאים נדבקו CVA16 עבור 1 h, שטף, ולאחר מכן מטופלים עם תרכובות בדיקה. נתונים המוצגים הם האמצעים ± סטיית תקן (SD) משלושה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05 לעומת הקבוצה ' וירוס בלבד '. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח חד כיוון של סטיה. . הדמות הזאת הותאמה מהפניה9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: CHLA ו-פוג לבטל CVA16 הכריכה לתא המארח. (א) סכמטית של שיטת האיגוד המבוססת על הזרימה של cy, try. (ב) התאים הRD (2 x 105 תאים/גם) נדבקו CVA16 (מארה = 100) בנוכחות או היעדרות של Chla (20 ΜM), פאג (25 μm), הפארין מסיסים (500 μg/mL, בקרה חיובית), או dmso (0.25%, שליטה שלילית) עבור 3 h ב 4 ° אינוולה מבארות נאספו לתוך צינורות, שטף עם הPBS פעמיים, קבוע, ומוכתם עם נוגדן anti-VP1 ואחריו אלקסה 488-מעלה נוגדן משני עבור הזרימה cy, לנסות האיתור של וירוסים מאוגד הקרקע. נתונים בכמת מן אותות הזריחה שזוהו הותוו כמו האמצעים ± SD משלושה ניסויים עצמאיים בגרף בר כמו ' וירוס כריכת (%). *p < 0.05 לעומת הטיפול ' dmso ' בקרה. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח חד כיוון של סטיה. הזרם המייצג cy, לנסות היסטגרמות של CHLA (ג), פאג (D), ו הפארין (E) טיפולים מוצגים. . הדמות הזאת הותאמה מהפניה9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: chla ו-פאג השבית תא ללא CVA16 חלקיקי וירוס. (א) סכמטי של התהליך הנגיפי. (ב) CVA16 (106 pfu/ובכן) טופלה עם Chla (20 ΜM) או פאג (25 μm) ומעורב מיד לטווח קצר הפעלה או מודולות עבור 1 h ב 37 ° צ' לטווח ארוך הפעלה לפני היותו מדולל 50-מקפלים לריכוז לא יעיל של מבחן תרכובות לפני מנווים על התאים הRD (וירוס סופי ריכוז = 50 PFU/טוב). (0.25%) שימש כפקד שלילי. ניסויים נותחו על ידי שיטת הפלאק באמצעות קריסטל סגול מכתים 72 h לאחר ההדבקה. נתונים המוצגים הם האמצעים ± SD משלושה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05 לעומת הקבוצה ' וירוס בלבד '. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח חד כיוון של סטיה. . הדמות הזאת הותאמה מהפניה9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: CHLA ו פוג היעד CVA16 capsid ליד כניסת הכיס. הקרנת פני השטח של החלקיק הCVA16 עם המחומש המבני של monomeric התחום על ידי קווים אדומים (א). מחומש נוספים על הויריאון מוצגים בציאן, מגנטה, אינדיגו, ברונזה וירוק. מולקולרית ניתוח עגינה של CHLA (ב, ירוק) ו פוג (ג, כחול) על CVA16 פנטעאמר (PDB: 5c4w); לוחות מוגדלת בצבע צהוב. VP1 = כתום, VP2 = אפור, VP3 = לבן; אנשי קשר קוטביים מוצגים כמקפים שחורים. משקעים כי איפור כניסתהכיס הם בצבע אדום (Ile94, Asp95, gln207, נפגשו212, נפגשו213, Lys257, שלושה ב258). ד, אי השקפה צדדית מקרוב לתוך הערוץ שבו כניסת הכיס ממוקמת ואיפה CHLA (D) ו-פוג (E) לאגד. שאריות ייחודיים שהם אנשי קשר קוטביים מאנשי הקשר הקוטבי של התרכובות על המחומש מסומנים בצהוב (VP1), לבן (VP2), ובגופנים שחורים (VP3). הקו המקווקו הלבן מציין את אזור כניסת הכיס. . הדמות הזאת הותאמה מהפניה9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדוח זה, תיארנו את הפרוטוקולים השימושיים לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים המכוונות לכניסה ויראלית, במיוחד נגד הCVA16 הבלתי-עטופים. האסמאומר מתוכננים בדרכים לנתח את האירועים המוקדמים במהלך הזנה ויראלית, המועילה להבהיר את המנגנון (של) הפעולה והיעד הפוטנציאלי של הפעילות האנטי-נגיפית של סוכני הניסוי. היתרי "זמן הסמים בנוסף" מאפשרת לקבוע בהרחבה את היעד הפוטנציאלי של תרכובות הבדיקה, למשל את התאים המארחים נגוע (ניתוח טרום טיפול), את חלקיקי וירוס או אינטראקציות עם משטח התא המארח (ניתוח שיתוף בתוספת ), או בתא המארח הנגוע בווירוס במהלך השלב הנגיפי (ניתוח לאחר הידבקות). שיטה זו בלבד יכולה לקבוע את שיטת האינטראקציה של התרכובות (למשל, שיתוף נוסף) המובילה להליך הבא המתואר בפרוטוקול זה (למשל, שיטת הפעלה וניתוח מחייב ויראלי). שלבי השטיפה הם קריטיים כדי להבטיח ששיטת הטיפול שנבדקה היא ספציפית לניתוח. השימוש בערכת הכריכה המבוססת על הזרמת cy, מבוססת על השפעת התרכובות באופן ספציפי על כריכת וירוסים לתא המארח. שמירה על טמפרטורת הניסוי ב -4 ° c חשובה לגילוי הסופי של הריטונים על משטח התא, משום שטמפרטורה זו מאפשרת כריכה נגיפית אך לא כניסה. ' המבנה האנטי-ויראלי ' יכול לסייע בקביעת האינטראקציה הפיזית הפוטנציאלית של תרכובות התרופות עם חלקיקי וירוס ללא תא. הצעד הקריטי הוא הדילול עבור החוצה תרכובות התרופה לאחר הדגירה עם האינויוציה ויראלית, כפי שנדרש כדי למנוע כל אינטראקציה משמעותית של הסמים עם משטח התא המארח בשלב הזיהום הבא12.
מאז הכניסה ויראלי הוא אירוע רב-שלבים, כיתת מעכבי כניסה ויראלי של סוכני אנטי וירוס יכול להפעיל מספר סוגים של מנגנונים, כולל: (1) מודול הזנה של משטח התא גורמים/קולטנים או מסלולים הקשורים שלה איתות; (2) המשפיעים על ממברנה תא נזילות או יושרה; (3) מיקוד אינטראקציות אלקטרוסטטית או ון דר וואלס בין חלקיקי הווירוס לבין משטח התא המארח; (4) גרימת שינויים פיזיים לרימונים כגון שבירה או צבירה של חלקיקים; (5) כריכה לגליקוציליות ויראלית או הקפדת חלבונים ומניעת התפקודים שלהם או התאמות שינוי; (6) חסימת מנגנוני היתוך משויכים; ו (7) למנוע שחרור של גנום נגיפי בתוך התא המארח. הניתוח המתואר בדו ח זה יכול לסייע להצביע על מצבי פעולה פוטנציאליים המפורטים לעיל, אשר ניתן לאמת עוד על ידי ניסויים נוספים. לבסוף, ' ניתוח עגינה מולקולרית ' המתואר כאן הוא אינסטרומנטלי כדי לנבא את אזורי האינטראקציה הפוטנציאליים בין תרכובות התרופה ואת חלקיקי וירוס, וככזה יכול לעזור לזהות מועמד נגיפי capsid או בקלסרים גליקופרוטאין ואת היעד שאריות על חלקיקי וירוס. עם זאת, תחזיות אלה תלויות בתוכנת העגינה, והרזולוציה והדיוק של מבני גביש החלבון הנגיפי. חשוב לציין כי שיטת העגינה המוגבלת האופציונלית בשלב 5.3.2 התווספה מכיוון שעתים קרובות כאשר משתמשים בחלבונים מבניים ויראליים כמולקולה ' קולטן ', הליגון יכול לאגד לאזורים בדרך כלל לא נגישים או חשופים על פני השטח ( לדוגמה, תחת פני השטח של capsid הפנים מול החלק הפנימי של הוויריון, אזורי הממברנה של גליקורופנס מעטפות, וכו '). העברת תיבת החיפוש מאפשרת רק אזורים נגישים של החלבון הנגיפי להיות ממוקד וכולל כל אינטראקציות לא מציאותיות. עגינה מולקולרית תלויה במבנים מתגבשו, אך ההתקדמות האחרונה במידול הומולוגיה אפשרה ניתוח של מבנים שאינם מתגבשו על ידי התאמת רצף חומצת האמינו שלו אל מבנה מגובש הקשור היטב15. הדבר איפשר לבצע ניתוח של מבנים נוספים והמידע שנרכש יכול להועיל למחקרים נוספים, כולל ניתוחי מוסיקה שיכולים לסייע באימות האינטראקציות החזויות.
לסיכום, ההליכים והפרוטוקולים המתוארים בדו ח זה מתבקשים לזהות סוכני אנטי-וירוס מועמדים המיועדים לכניסה ויראלית, ולספק מידע לגבי השלב של תהליך הכניסה הנגיפי אליו מטרות סוכני הבדיקה, בין אם הם אינטראקציה עם חלקיקי וירוס בחינם, וחיזוי אתרים אפשריים של אינטראקציה בין סמים על הריטונים. סוגים אלה של בחני ניתן לחזור על וירוסים אחרים שאינם עטופים או להתאים וירוסים מעטפת כשיטה של הקרנת תרכובות תרופות אנטי ויראליות לאיתור מעכבי אפשרי של הזנה ויראלי. שימוש בגישה מונעת כזו לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים יכול לסייע לזרז את תהליך פיתוח התרופה ולהרחיב את היקף הtherapeutics האנטי-ויראלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה ד ר יהושע בקהאם באוניברסיטת טקסס באוסטין לתמיכה טכנית עם עגינה מולקולרית. מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי מימון משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (MOST107-2320-B-037-002 ל-C.-J.L. ו-L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 ו MOST107-2320-B-038-034-MY3 ל L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
