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Immunology and Infection

Coxsackievirus A16 के खिलाफ एंटीवायरल उम्मीदवारों की पहचान के लिए वायरल प्रविष्टि परख और आणविक डॉकिंग विश्लेषण का उपयोग

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59920
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 3,5
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin, 2School of Pharmacy, College of Pharmacy, Kaohsiung Medical University, 3Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 5Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

Summary

प्रोटोकॉल का लक्ष्य वायरल प्रविष्टि है कि उम्मीदवार वायरल प्रविष्टि inhibitors की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है से संबंधित विभिन्न परख वर्णन है.

Abstract

एंटीवायरल का कहना है कि यंत्रवत् वायरल प्रविष्टि की जांच करने के लिए उचित है, जिस पर मूल्यांकन एजेंट सबसे प्रभावी हैं, और उम्मीदवार वायरल प्रविष्टि अवरोधकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यहाँ, हम वायरस कणों या जल्दी वायरल प्रविष्टि में विशिष्ट चरणों को लक्षित करने के माध्यम से गैर-enveloped coxsackievirus A16 (CVA16) द्वारा संक्रमण को अवरुद्ध करने में सक्षम छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। परख समय के दवा-योग विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री आधारित वायरल बाध्यकारी परख, और वायरल निष्क्रियता परख शामिल हैं. हम एंटीवायरल यौगिकों द्वारा लक्षित संभावित अवशेषों की भविष्यवाणी करने के लिए वायरस कैप्सिड प्रोटीन का उपयोग करने के लिए एक आणविक डॉकिंग प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं। ये परख ों यावायरल एजेंटों की पहचान करने में मदद करनी चाहिए जो वायरल प्रविष्टि पर कार्य करते हैं। भविष्य की दिशाओं आगे दवा के विकास के लिए इन संभव inhibitors का पता लगाने कर सकते हैं.

Introduction

हाथ, पैर, और मुंह की बीमारी (HFMD) एक रोग सबसे अधिक coxsackievirus A16 (CVA16) और enterovirus 71 (EV71) छोटे बच्चों में की वजह से है. हाल ही में एशिया-प्रशांत क्षेत्र में, सीवीए 16 प्रेरित HFMD में एक महत्वपूर्ण उछाल रहा है। जबकि लक्षण हल्के हो सकते हैं, गंभीर जटिलताएं हो सकती हैं जो मस्तिष्क और दिल को प्रभावित करती हैं, संभावित घातकता1,2के साथ । वर्तमान में, सीवीए 16 के लिए कोई लाइसेंस एंटीवायरल उपचार या टीकाकरण उपलब्ध नहीं है, और इस प्रकार भविष्य के प्रकोपों और संबंधित जटिलताओं को रोकने के लिए एंटीवायरल रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है।

CVA16 एक गैर-enveloped वायरस है जो एक icosahedral capsid pentamers से इकट्ठे हुए है कि प्रत्येक 4 संरचनात्मक प्रोटीन अर्थात् VP1, VP2, VP3, और VP4 होते हैं. पंचक में प्रत्येक पांच गुना अक्ष encircling एक 'कैनियन' क्षेत्र है कि एक अवसाद के रूप में दिखाता है और रिसेप्टर बंधन3में अपनी भूमिका के लिए विख्यात है. इस घाटी के तल पर VP1 क्षेत्र है कि एक प्राकृतिक फैटी ligand नाम sphingosine (SPH) में एक हाइड्रोफोबिक जेब निहित है. सेलुलर रिसेप्टर्स, जैसे मानव P selectin ग्लाइकोप्रोटीन लिगंड 1 (PSGL-1) और scavenger रिसेप्टर वर्ग बी सदस्य 2 (SCARB2), इस ligand विस्थापित द्वारा वायरल बाइंडिंग में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है जो capsid के लिए अनुरूप परिवर्तन में परिणाम और इसके बाद , मेजबान कोशिका4,5,6में वायरल जीनोम का निष्कासन . संभावित अवरोधकों की पहचान करना जो वायरल प्रविष्टि प्रक्रिया में क्रमिक घटनाओं को अवरुद्ध करते हैं, सीवीए 16 संक्रमण के खिलाफ संभावित चिकित्सीय रणनीति प्रदान कर सकते हैं।

वायरस जीवन चक्र में कदम मोड-विशिष्ट एंटीवायरल एजेंटों की पहचान करने में मदद करने के लिए लक्ष्य के रूप में प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के माध्यम से विच्छेदन किया जा सकता है। एक समय के दवा-अतिरिक्त विश्लेषण वायरल संक्रमण के दौरान विभिन्न समय पर दवा उपचार प्रभाव की जांच, पूर्व प्रवेश सहित (वायरस संक्रमण के लिए पूर्व जोड़ा), प्रविष्टि (वायरस संक्रमण के लिए समवर्ती जोड़ा), और बाद में प्रवेश (के बाद जोड़ा वायरस संक्रमण)7| प्रत्येक उपचार स्थितियों में गठित वायरल प्लेक की संख्या की मात्रा निर्धारित करके एक मानक पट्टिका परख का उपयोग करके प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री आधारित वायरल बाइंडिंग परख निर्धारित करता है कि दवा कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए वायरल लगाव को रोकता है। यह तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस से स्थानांतरित करके हासिल किया जाता है, जिस पर अधिकांश मानव वायरस संक्रमण होते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस तक, जहां virions मेजबान सेल सतह से बांधने में सक्षम होते हैं लेकिन कोशिकाओं7में प्रवेश करने में असमर्थ होते हैं। कोशिका झिल्ली-बद्ध वायरस कणों को तब वायरल एंटीजन के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से मात्रा निर्धारित की जाती है और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। दूसरी ओर वायरल निष्क्रियता परख मुक्त वायरस कणों के साथ दवा की संभावित शारीरिक बातचीत का आकलन करने में मदद करता है, या तो परिरक्षण या virions तटस्थ, या समुच्चय या अनुरूप परिवर्तन है कि उन्हें निष्क्रिय के लिए प्रदान के कारण संक्रमण के दौरान मेजबान कोशिका की सतह के साथ बाद में बातचीत8,9. इस प्रयोग में, वायरल इनोकुलम को मेजबान सेल मोनोलेयर को संक्रमित करने और एक मानक पट्टिका परख8प्रदर्शन करने से पहले दवा को पतला करने से पहले दवा के साथ पहले इनक्यूबेट करने की अनुमति दी जाती है। अंत में, आणविक डॉकिंग virion सतह पर संभावित दवा बातचीत साइटों की भविष्यवाणी करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लिफाफा वायरस से वायरल ग्लाइकोप्रोटीन और गैर-enveloped वायरस से वायरल capsid प्रोटीन सहित, कम्प्यूटेशनल का उपयोग करके एल्गोरिदम. यह मशीनी रूप से कार्रवाई की दवा के मोड के लक्ष्यों को इंगित करने में मदद करता है और उपयोगी जानकारी प्रदान करता है जिसे डाउनस्ट्रीम परख द्वारा आगे मान्य किया जा सकता है।

हमने हाल ही में एंटीवायरल यौगिकों की पहचान करने के लिए उपरोक्त विधियों का इस्तेमाल किया है जो गैर-एवेलप्ड CVA169द्वारा संक्रमण को कुशलतापूर्वक अवरुद्ध करते हैं। इसमें, विस्तृत प्रोटोकॉल है कि इस्तेमाल किया गया वर्णन और चर्चा कर रहे हैं.

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Protocol

नोट: सभी सेल संस्कृति और वायरस संक्रमण प्रमाणित जैव सुरक्षा डाकू है कि नमूनों के जैव सुरक्षा स्तर के लिए उपयुक्त हैं में आयोजित किया जाना चाहिए संभाला जा रहा है. छोटे अणुओं के दो टैनिन वर्ग के चेबुलाजिक एसिड (CHLA) और punicalagin (PUG), कि कुशलता पूर्वक CVA16 संक्रमण9ब्लॉक करने के लिए मनाया गया, उम्मीदवार निरोधात्मक एजेंटों के उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है. विषाणु विज्ञान तकनीकों में बुनियादी सिद्धांतों के लिए, वायरस का प्रचार, वायरस टिटर का निर्धारण, और प्लेक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) या संक्रमण की बहुलता (एमओआई) की अवधारणाओं, पाठक को10संदर्भ के लिए संदर्भित किया जाता है।

1. सेल संस्कृति, वायरस तैयारी, यौगिक तैयारी, और यौगिक Cytotoxicity

  1. मानव rabdoyosarcoma (आरडी) कोशिकाओं CVA16 संक्रमण11के लिए अनुमति देने वाले मेजबान कोशिकाओं रहे हैं. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) के 10 एमएल में आरडी कोशिकाओं को बढ़ाएं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 200 यू/एमएल पेनिसिलिन जी, 200 डिग्री ग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और टी-75 फ्लास्क में टी-75 फ्लास्क के साथ पूरक 37 डिग्री सेल्सियस में टी-75 फ्लास्क।
  2. आरडी कोशिकाओं में वायरस का प्रचार करके CVA16 तैयार करें और PFU/mL में वायरल टिटर निर्धारित करें। अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए, कृपया संदर्भ11को देखें.
  3. परीक्षण यौगिकों और उनके संबंधित सॉल्वैंट्स का उपयोग कर नियंत्रण तैयार करें: उदाहरण के लिए, dimethyl suloxide (DMSO) में CHLA और PUG भंग. सभी संक्रमण चरणों के लिए, बेसल माध्यम DMEM प्लस 2% FBS और एंटीबायोटिक दवाओं से मिलकर.
    नोट: परीक्षण यौगिक उपचार में DMSO के अंतिम एकाग्रता के बराबर है या नीचे 0.25% प्रयोगों में; 0.25% DMSO तुलना के लिए assays में एक नकारात्मक नियंत्रण उपचार के रूप में शामिल है.
  4. आरडी कोशिकाओं पर परीक्षण यौगिकों की साइटोटॉक्सिता परख करें जो XTT (2,3-bis$2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium हाइड्रॉक्साइड का निर्धारण करने वाली कोशिका व्यवहार्यता का उपयोग करते हैं)। विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, कृपया संदर्भ12देखें. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार GraphPad Prism के रूप में एक विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परीक्षण यौगिकों की cytotoxicity सांद्रता निर्धारित करते हैं. दवा सांद्रता है कि काफी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते हैं ( $ 95% व्यवहार्य कोशिकाओं) अध्ययन के शेष के लिए उपयोग किया जाता है.

2. समय के दवा-योग परख

  1. वायरल संक्रमण से पहले मेजबान कोशिकाओं पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए (उपचार)
    1. 2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक बोने घनत्व पर 12 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज आरडी कोशिकाओं। एक मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
    2. गैर-cytotoxic सांद्रता पर परीक्षण यौगिकों के साथ आरडी कोशिकाओं का इलाज (चरण 1.4 से निर्धारित) 1 h या 4 ज के लिए बेसल मीडिया मात्रा के 1 एमएल में.
    3. बेसल मीडियम में वायरस की 50 पीएफयू/वेल जोड़ने से पहले पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं (इनोकुलम की अंतिम मात्रा 300 डिग्री सेल्सियस है) 1 ज के लिए प्लेट को हर 15 मिनट रॉक करें।
    4. संक्रमण के बाद, पीबीएस का उपयोग करके मोनोलेयरों को फिर से धोएं, फिर बेसल मीडिया के 1 एमएल के साथ ओवरले करें जिसमें 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे ऊष्मायन के लिए 0.8% मिथाइलसेल्यूलोस शामिल हैं।
    5. 72 एच ऊष्मायन के बाद, ओवरले मीडिया को हटा दें और पीबीएस के 2 एमएल का उपयोग करके कुओं को धो लें।
    6. 15 मिनट के लिए 37% formaldehyde के 0.5 एमएल का उपयोग कर कुओं को ठीक करें।
    7. सुपरनेंट निकालें और पीबीएस का उपयोग कर फिर से धो लें।
    8. 0.5% क्रिस्टल बैंगनी समाधान के 0.5 एमएल का उपयोग कर कुओं दाग। फिर 2 मिनट के भीतर दाग समाधान को हटा दें और हवा सुखाने से पहले पानी की एक कोमल धारा के साथ कुओं को धो लें।
    9. एक सफेद प्रकाश बॉक्स पर थाली रखकर वायरल प्लेक की गणना करें। प्रतिशत की गणना करें (%) CVA16 संक्रमण इस प्रकार है: (प्लाक वायरस + दवा का मतलब है /
  2. दवाओं और वायरस को एक साथ जोड़ने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए (सह-योग)
    1. 2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक बोने घनत्व पर 12 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज आरडी कोशिकाओं। एक मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
    2. उचित सांद्रता में परीक्षण यौगिकों के साथ आरडी कोशिकाओं का इलाज करें और सीवीए 16 के 50 PFU/वेल (इनोकुलम की अंतिम मात्रा 300 डिग्री सेल्सियस है) एक साथ 1 ज के लिए प्लेट को हर 15 मिनट रॉक करें।
    3. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं और फिर बेसल मीडिया के 1-2 एमएल के साथ ओवरले करें जिसमें 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे के ऊष्मायन के लिए 0.8% मिथाइलसेलुलोस होता है।
    4. 72 एच पोस्ट संक्रमण के बाद क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग वायरल प्लेक और ऊपर वर्णित के रूप में% CVA16 संक्रमण का निर्धारण।
  3. वायरल प्रविष्टि के बाद दवा उपचार प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए (पोस्ट संक्रमण)
    1. 2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक बोने घनत्व पर 12 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज आरडी कोशिकाओं। एक मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
    2. सीवीए 16 के 50 PFU/वेल के साथ आरडी कोशिकाओं को टीका करें (इनोकुलम की अंतिम मात्रा 300 डिग्री सेल्सियस है) 1 ज के लिए प्लेट को हर 15 मिनट रॉक करें।
    3. पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ कुओं को धोएं और 0.8% मिथाइलसेलुलोज़ और परीक्षण यौगिकों की उचित सांद्रता वाले बेसल मीडिया के साथ कोशिकाओं को ओवरले करें।
    4. क्रिस्टल बैंगनी के साथ दाग वायरल प्लेक और 72 एच पोस्ट संक्रमण के बाद गिनती और ऊपर वर्णित% CVA16 संक्रमण ऊष्मायन निर्धारित करते हैं।
      नोट: कोशिकाओं को उठाने से बचने के लिए सभी पीबीएस washes धीरे प्रदर्शन.

3. प्रवाह Cytometry आधारित बंधन परख

  1. 2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक बोने घनत्व पर 12 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज आरडी कोशिकाओं। एक मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. सेल मोनोलेयर को 1 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले से ठंडा करना।
  3. सीवीए 16 (एमओआईआई जेड 100) के साथ आरडी कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए परीक्षण यौगिकों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में संक्रमित करें।
    नोट: बर्फ पर वायरल टीका और 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में आगामी ऊष्मायन प्रदर्शन 4 डिग्री सेल्सियस पर तापमान को बनाए रखने के लिए, जो वायरल बाध्यकारी लेकिन प्रवेश नहीं अनुमति देता है।
  4. वायरस इनोकुलम निकालें और बर्फ-ठंडा पीबीएस के 1-2 एमएल के साथ एक बार धो लें।
  5. 3 मिनट के लिए बर्फ पर कुओं के लिए बर्फ ठंडा वियोजन बफर के 1 एमएल जोड़कर लिफ्ट कोशिकाओं, कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पहले और उन्हें बर्फ ठंडा प्रवाह साइटोमेट्री बफर (1x पीबीएस प्लस 2% FBS) में ressssing.
  6. बर्फ-ठंडा प्रवाह साइटोमेट्री बफर का उपयोग करके कोशिकाओं को दो बार धोएं और बर्फ पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  7. किसी भी असीम या कमजोर बाध्य वायरस को हटाने के लिए पीबीएस का उपयोग कर कोशिकाओं को धो लें, और फिर 1 एमएल एंटी-वीपी1 एंटीबॉडी (1:2,000; पीबीएस में पतला 3% बीएसए युक्त) के साथ 1 एच के लिए बर्फ पर, इसके बाद एक माध्यमिक एलेक्सा 488-संयोजित एंटी-माउस आईजीजी (1:250; पीबीएस में पतला 3% बीएसए युक्त) बर्फ पर 1 एच के लिए प्रदर्शन पीबीएस washes (3 बार) प्रत्येक एंटीबॉडी उपचार के बाद.
  8. बर्फ ठंडा प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 0.5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित और मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर एक प्रवाह साइटोमीटर पर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण प्रदर्शन। संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हिस्टोग्राम में डेटा प्रस्तुत करें और बार ग्राफ निरूपण के लिए परिमाणित करें।

4. वायरल निष्क्रियता परख

  1. वायरल निष्क्रियता परख के रूप में पहले वर्णित12 निम्न स्थितियों का उपयोग कर निष्पादित करें:
    - CVA16 के 106 PFU/एमएल की एक प्रारंभिक एकाग्रता।
    - 2 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक बोने घनत्व से 12 अच्छी तरह से प्लेटों में आरडी सेल मोनोलेयर्स।
    - 50 PFU के एक अंतिम वायरस एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप दवा यौगिकों बाहर titrating के लिए 50 गुना कमजोर पड़ने /
    - पीबीएस के 1-2 एमएल का उपयोग कर कदम धो।
    - ओवरले मीडिया जिसमें 0.8% मेथिलसेलुलोस है।
  2. ऊपर विस्तृत के रूप में वायरल प्लेक प्रक्रिया के क्रिस्टल बैंगनी धुंधला का उपयोग कर वायरल संक्रमण के अंतिम रीडआउट प्रदर्शन।

5. आणविक डॉकिंग विश्लेषण

  1. PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) से परीक्षण यौगिकों के 3 डी अणुओं डाउनलोड करें. यदि अणुओं एक 3 डी संरचना अपलोड नहीं है, 2 डी संरचनाओं डाउनलोड या मुस्कान स्ट्रिंग अनुक्रम का उपयोग करें और एक आणविक कार्यक्रम के माध्यम से 3 डी अणुओं में बदलना (जैसे CORINA).
  2. आरसीएसबी प्रोटीन डाटा बैंक (https://www.rcsb.org/) से वायरल जैविक विधानसभा इकाई डाउनलोड करें और एक बायोकम्प्यूटिंग कार्यक्रम (जैसे UCSF Chimera) का उपयोग कर वायरल संरचना मॉडल तैयार करें। उदाहरण के लिए, CVA16 परिपक्व virion क्रिस्टल संरचना के मामले में (PDB: 5C4W)3, PDB फ़ाइल से सॉल्वैंट्स हटाएँ, Dunbrach 2010 Rotamer पुस्तकालय से डेटा का उपयोग कर अधूरा पक्ष श्रृंखला की जगह, और हाइड्रोजन और शुल्क जोड़ने के रूप में संरचना के लिए पहले13की सूचना दी . डॉकिंग लक्ष्य एक जैविक विधानसभा जानकारी (प्रोटिन डेटा बैंक) के साथ इरादा विश्लेषण के लिए किसी भी प्रासंगिक वायरल प्रोटीन हो सकता है.
  3. तैयार वायरस इकाई पर डॉक परीक्षण यौगिकों उदाहरण UCSF Chimera का उपयोग कर, और एक दृश्य सॉफ्टवेयर के साथ उत्पादन फ़ाइलों का विश्लेषण (उदाहरण के लिए, Autodock विना, PyMol):
    1. 'लिगंड' के रूप में UCSF Chimera में परीक्षण यौगिक फ़ाइल अपलोड करें और 'रिसेप्टर' के रूप में पूरी तैयार वायरल प्रोटीन का चयन करके अंधा डॉकिंग प्रदर्शन करते हैं। संपूर्ण 'रिसेप्टर' के लिए खोज वॉल्यूम का आकार बदलने के लिए कंप्यूटर माउस या ट्रैकपैड का उपयोग करें। 'उन्नत विकल्प' में, बाइंडिंग मोड की संख्या अधिकतम होने की अनुमति दें. डॉकिंग फ्रेम स्वचालित रूप से उच्चतम से सबसे कम बाध्यकारी ऊर्जा के लिए स्थान दिया जाएगा.
    2. (वैकल्पिक) इसके अलावा अंधा डॉकिंग के लिए, खोज मात्रा को कम करने के लिए माउस या trackpad का उपयोग कर फिर से अंधा डॉकिंग परिणामों से व्युत्पन्न ब्याज के क्षेत्रों में वायरल प्रोटीन पर डॉकिंग साइट सीमित (जैसे, 100 ] x 100 [ x 100 ]). यह चरण अंधा डॉकिंग परिणामों की पुष्टि करने में मदद करता है और विशिष्टता बढ़ाता है।
    3. डॉकिंग फ़ाइल अपलोड करके बाइंडिंग मोड की स्थितियों का विश्लेषण करने के लिए आणविक ग्राफिक्स सिस्टम (उदा., PyMol) का उपयोग करें। 'लिगंड' का चयन और 'किसी भी परमाणुओं के लिए' विकल्प के साथ ध्रुवीय संपर्कों की पहचान करके वायरल प्रोटीन के लिए यौगिक से ध्रुवीय संपर्कों का पता लगाएं; परिणामों की जांच करें।

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Representative Results

समय के दवा-अतिरिक्त परख चित्रा 1 में संकेत दिया है और छोटे अणुओं CHLA और PUG CVA16 संक्रमण पर या तो पूर्व वायरल प्रविष्टि (पूर्व उपचार), वायरल प्रविष्टि के दौरान (सह-योग), या पोस्ट वायरल प्रविष्टि का उपयोग कर उपचार से प्रभाव से पता चलता है ( संक्रमण के बाद)। दोनों छोटे अणुओं ने केवल सीवीए16 संक्रमितता के विरुद्ध सीमांत प्रभाव उत्पन्न किया चाहे वह वायरल संक्रमण से पहले मेजबान कोशिकाओं के पूर्व व्यवहार में हो (चित्र 1क) या संक्रमण के बाद उपचार में (चित्र 1C) . इसके विपरीत, CHLA और PUG कुशलतापूर्वक सह-योग उपचार में CVA16 संक्रमण द्वारा abrogated (चित्र 1B)। इसलिए इन प्रेक्षणों का सुझाव है कि दो यौगिकों सबसे प्रभावी रहे हैं जब वे एक साथ संक्रमण के दौरान मेजबान सेल सतह पर वायरस कणों के साथ मौजूद हैं.

चित्र 2में, प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित बाइंडिंग विश्लेषण (चित्र 2कमें योजनाबद्ध रूप से सचित्र) इस बात की पुष्टि करता है कि दो टैनिन मेजबान कोशिकाओं के लिए वायरल कण बंधन को रोककर CVA16 प्रविष्टि को रोकते हैं। चित्र 2ख में परिमाणीकरण आंकड़ों से पता चलता है कि दो औषधियों की उपस्थिति में आरडी सेल की सतह पर पाए गए वायरस की मात्रा 10% से कम है, जो हेपरिन सकारात्मक नियंत्रण के समान है जो CVA16 अनुलग्नक14को रोकने के लिए जाना जाता है। चित्र 2C, 2D, और 2E संबद्ध प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम को चित्रित करता है जहां आरडी सेल सतह पर CVA16 का पता लगाने के कारण बैंड शिफ्ट काफी कम हो जाता है जब CHLA और PUG मौजूद हैं।

चित्र 3क में यह दर्शाया गया है कि वायरल निष्क्रियता प्रयोग किस प्रकार किया गया था। दवा यौगिक या तो CVA16 वायरस कणों के साथ मिलाया गया था और कमजोर पड़ने कदम से पहले 1 एच (दीर्घकालिक) के लिए incubated, या मिश्रित और तुरंत पतला (अल्पकालिक) संक्रमण से पहले. जैसा कि चित्र 3 बीमें दिखाया गया है, 1 एच के लिए परीक्षण एजेंटों के साथ CV16 कणों की एक पूर्व इनक्यूबेशन अल्पकालिक ऊष्मायन और DMSO नियंत्रण की तुलना में वायरल संक्रमण के खिलाफ आरडी कोशिकाओं की लगभग पूरी सुरक्षा के लिए नेतृत्व किया। इसलिए परिणाम सुझाव है कि दोनों CHLA और PUG CVA16 कणों के साथ बातचीत और उन्हें बाद के संक्रमण में निष्क्रिय प्रदान करने में सक्षम हैं.

चूंकि हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि दवा यौगिकों सीधे CVA16 कणों निष्क्रिय कर सकते हैं, और इसलिए उनके एंटीवायरल गतिविधि का एक विश्वसनीय लक्ष्य के रूप में virion की पहचान, हम आणविक डॉकिंग का इस्तेमाल किया इन दोनों के बीच संभावित बातचीत (ओं) की भविष्यवाणी एजेंटों और CVA16 capsid पेंटामर. चित्र 4A CVA16 पेंटामर की सतह प्रक्षेपण से पता चलता है जो CVA16 virion के icosahedral capsid बनाता है. टैनिन्स CHLA (चित्र4B; हरे) और PUG (चित्र 4C; नीला) की आण्विक डॉकिंग से संकेत मिलता है कि वे दोनों सीवीए 16 पंचक के घाटी क्षेत्र में बाँधने की भविष्यवाणी कर रहे हैं। विशेष रूप से, दोनों छोटे अणुओं जेब प्रवेश द्वार के ठीक ऊपर बंधे (चित्र 4B और 4C, zoomed पैनलों), जो जेब कारक रखती है और CVA16 बाध्यकारी और मेजबान सेल में प्रवेश मध्यस्थता के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. दोनों CHLA और PUG इसलिए जेब प्रवेश क्षेत्र मुखौटा दिखाई देते हैं, जो सैद्धांतिक रूप से वायरस कणों और मेजबान सेल रिसेप्टर्स के बीच बातचीत में बाधा होगी. चित्र 4D और 4E से संकेत मिलता है अद्वितीय अवशेषों CHLA और PUG के ध्रुवीय संपर्कों से भविष्यवाणी की, क्रमशः, जेब प्रवेश द्वार के आसपास, इन दोनों यौगिकों और 3 एमिनो एसिड Asn85 के लिए VP1 के साथ होने वाली बातचीत के अधिकांश के साथ , Lys257, और Asn417 दो टैनिन के बीच आम में किया जा रहा है.

Figure 1
चित्र 1: सीवीए 16 संक्रमितता के खिलाफ CHLA और PUG के समय के दवा-अतिरिक्त प्रभाव। आरडी कोशिकाओं CHLA के साथ इलाज किया गया (20 डिग्री सेल्सियस) या PUG (25 डिग्री सेल्सियस) CVA16 टीका के विभिन्न समय पर (50 PFU / डीएमएसओ (0.25%) उपचार नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था और सभी परख इनक्यूबेशन के बाद क्रिस्टल बैंगनी धुंधला 72 एच का उपयोग पट्टिका परख द्वारा विश्लेषण किया गया। (ए) प्रीउपचार के लिए, कोशिकाओं को 1 ज या 4 एच के लिए परीक्षण यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किया गया था और फिर सीवीए16 संक्रमण से पहले धोया गया था। (बी) सह-योग परख के लिए, कोशिकाओं को 1 ज के लिए एक साथ दवाओं और वायरस के साथ प्रशासित किया गया और फिर धोया गया। (ग) संक्रमण के बाद कोशिकाओं को 1 ज के लिए CVA16 से संक्रमित किया गया, धोया गया, और फिर परीक्षण यौगिकों के साथ इलाज किया गया। दिखाए गए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मानक विचलन (एसडी) के साधन हैं। * p;lt; 0.05 संबंधित 'वायरस केवल' समूह की तुलना में. सांख्यिकीय विश्लेषण प्रसरण के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था. यह आंकड़ा संदर्भ9से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: CHLA और PUG समाप्त CVA16 मेजबान सेल के लिए बाध्यकारी. (ए) प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित बाध्यकारी परख का स्केमेटिक। (बी) आरडी कोशिकाओं (2 x 105 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) सीवीए 16 (एमओआई जेड 100) की उपस्थिति या CHLA की अनुपस्थिति में (20 डिग्री सेल्सियस), PUG (25 डिग्री सेल्सियस), घुलनशील हेपरिन (500g/mL, सकारात्मक नियंत्रण), या DMSO (0.25%, नकारात्मक नियंत्रण) 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए संक्रमित थे। कुओं से inocula ट्यूबों में एकत्र किए गए थे, दो बार पीबीएस के साथ धोया, तय, और विरोधी VP1 एंटीबॉडी के साथ दाग सतह से बाध्य वायरस के प्रवाह साइटोमेट्री का पता लगाने के लिए Alexa 488-कंजुटेड माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया. पता चला फ्लोरोसेंट संकेतों से परिमाणित डेटा 'वायरस बाइंडिंग (%)' के रूप में बार ग्राफ में तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी के रूप में साजिश रची गई थी। *च और 0.05 'डीएमएसओ' नियंत्रण उपचार की तुलना में। सांख्यिकीय विश्लेषण प्रसरण के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था. CHLA (C), PUG (D) और हेपरिन (ई) उपचार के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम दिखाए जाते हैं . यह आंकड़ा संदर्भ9से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: CHLA और PUG निष्क्रिय सेल मुक्त CVA16 वायरस कणों. (A) वायरल निष्क्रियता परख के Schematic. (बी) सीवीए16 (106 PFU/well) CHLA (20 डिग्री सेल्सियस) या PUG (25 डिग्री सेल्सियस) के साथ इलाज किया गया था और तुरंत अल्पकालिक निष्क्रियता के लिए मिश्रित या परीक्षण के एक गैर प्रभावी एकाग्रता के लिए 50 गुना पतला किया जा रहा से पहले लंबी अवधि के निष्क्रियता के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए incubated आरडी कोशिकाओं पर टीका से पहले यौगिकों (अंतिम वायरस एकाग्रता ] 50 PFU / डीएमएसओ (0.25%) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रयोगों का विश्लेषण क्रिस्टल बैंगनी धुंधला 72 एच पोस्ट संक्रमण का उपयोग कर पट्टिका परख द्वारा किया गया। दिखाए गए डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी के साधन हैं। * p;lt; 0.05 संबंधित 'वायरस केवल' समूह की तुलना में. सांख्यिकीय विश्लेषण प्रसरण के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था. यह आंकड़ा संदर्भ9से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: CHLA और PUG जेब प्रवेश द्वार के पास CVA16 capsid लक्ष्य. लाल रेखाओं (ए) द्वारा रेखांकित मोनोमेरिक संरचनात्मक पेंटामर के साथ सीवीए 16 विरिऑन कण का सतह प्रक्षेप । virion पर अतिरिक्त pentamers सियान, मैजंटा, इंडिगो, कांस्य, और हरे रंग में दिखाए जाते हैं। CVA16 पेंटामर (PDB: 5C4W) पर CHLA (बी, हरी ) और PUG (सी, नीला) का आण्विक डॉकिंग विश्लेषण; बढ़ी हुई पैनलों पीले रंग में सीमांकन कर रहे हैं। VP1 - नारंगी, VP2 - ग्रे, VP3 - सफेद; ध्रुवीय संपर्क काले डैश के रूप में दिखाए जाते हैं। अवशिष्ट है कि मेकअप जेब प्रवेश लाल रंग का है (इल94, एएसपी95, Gln207, मेट212, मेट213, Lys257, Thr258) . डी, ई. घाटी में क्लोज़-अप साइड व्यू जहां जेब प्रवेश द्वार स्थित है और जहां CHLA (डी) और PUG (ई) के लिए बाध्य. अद्वितीय अवशेषों कि pentamer पर यौगिकों ध्रुवीय संपर्कों से ध्रुवीय संपर्क कर रहे हैं पीले (VP1), सफेद (VP2), और काले (VP3) फोंट में लेबल हैं. सफेद डैश्ड लाइन जेब प्रवेश क्षेत्र को इंगित करती है। यह आंकड़ा संदर्भ9से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस रिपोर्ट में, हमने उन प्रोटोकॉलकां का वर्णन किया है जो एंटीवायरल उम्मीदवारों की पहचान के लिए उपयोगी हैं जो वायरल प्रविष्टि को लक्षित करते हैं, विशेष रूप से गैर-एवडील CVA16 के खिलाफ। परख वायरल प्रविष्टि के दौरान जल्दी घटनाओं विच्छेदन के तरीके में डिजाइन किए हैं, जो कार्रवाई के तंत्र (ओं) और परीक्षण एजेंटों एंटीवायरल गतिविधि के संभावित लक्ष्य (ओं) को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है. 'समय के दवा-अतिरिक्त परख' मोटे तौर पर परीक्षण यौगिकों के संभावित लक्ष्य को निर्धारित करने के लिए परमिट, उदाहरण के लिए uninfected मेजबान कोशिकाओं (पूर्व उपचार विश्लेषण), वायरस कणों या मेजबान सेल सतह के साथ अपनी बातचीत (सह-अतिरिक्त विश्लेषण ), या वायरल प्रतिकृति चरण (पोस्ट संक्रमण विश्लेषण) के दौरान वायरस से संक्रमित होस्ट सेल। यह परख अकेले यौगिकों से बातचीत की विधि निर्धारित कर सकते हैं (जैसे, सह-अतिरिक्त) कि बाद में इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख की ओर जाता है (जैसे, वायरल निष्क्रियता परख और बाध्यकारी विश्लेषण). धो कदम यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि जांच की गई उपचार विधि विश्लेषण किए गए व्यक्ति के लिए विशिष्ट है। 'प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित बाइंडिंग परख' का उपयोग विशेष रूप से मेजबान सेल के लिए बाध्यकारी वायरस पर यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने में मदद करता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग के तापमान को बनाए रखने सेल सतह पर virions के अंतिम पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस तापमान वायरल बाध्यकारी लेकिन प्रवेश नहीं अनुमति देता है। 'वायरल निष्क्रियता परख' सेल मुक्त वायरस कणों के साथ दवा यौगिकों की संभावित शारीरिक बातचीत निर्धारित करने के लिए सहायता कर सकते हैं. वायरल इनोकुलम के साथ ऊष्मायन के बाद दवा यौगिकों को बाहर निकालने के लिए महत्वपूर्ण कदम कमजोर पड़ रहा है, क्योंकि बाद के संक्रमण चरण12में मेजबान सेल सतह के साथ दवाओं के किसी भी सार्थक संपर्क को रोकने के लिए यह आवश्यक है।

चूंकि वायरल प्रविष्टि एक बहु-चरण घटना है, एंटीवायरल एजेंटों का एक वायरल प्रविष्टि अवरोधक वर्ग संभवतः कई प्रकार के तंत्र लागू कर सकता है, जिसमें शामिल हैं: (1) सेल सतह प्रवेश कारकों/ (2) कोशिका झिल्ली तरलता या अखंडता को प्रभावित करना; (3) वायरस कणों और मेजबान सेल सतह के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक या वैन डर वाल्स बातचीत को लक्षित करना; (4) इस तरह के कण टूटना या एकत्रीकरण के रूप में virions के लिए शारीरिक परिवर्तन को प्रेरित; (5) वायरल ग्लाइकोप्रोटीन या कैप्सिड प्रोटीन के लिए बाध्यकारी और उनके कार्यों या अनुरूप परिवर्तन को रोकने; (6) संलयन संबद्ध तंत्र को अवरुद्ध करना; और (7) मेजबान सेल के अंदर वायरल जीनोम की रिहाई को रोकने के. इसलिए इस रिपोर्ट में वर्णित विश्लेषण कार्रवाई के ऊपर-सूचीबद्ध संभावित मोड को इंगित करने में मदद कर सकते हैं, जिन्हें अतिरिक्त प्रयोगों द्वारा आगे मान्य किया जा सकता है. अंत में, 'आण्विक डॉकिंग विश्लेषण' यहाँ वर्णित दवा यौगिकों और वायरस कणों के बीच संभावित बातचीत क्षेत्रों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, और इस तरह के रूप में उम्मीदवार वायरल capsid या ग्लाइकोप्रोटीन बांधने की मशीन और लक्षित की पहचान करने में मदद कर सकते हैं वायरस कणों पर अवशेष. हालांकि, इन भविष्यवाणियों डॉकिंग सॉफ्टवेयर पर निर्भर हैं, और संकल्प और वायरल प्रोटीन क्रिस्टल संरचनाओं की सटीकता. यह ध्यान दें कि कदम 5.3.2 में वैकल्पिक सीमित डॉकिंग विधि जोड़ा गया था क्योंकि अक्सर जब 'रिसेप्टर' अणु के रूप में वायरल संरचनात्मक प्रोटीन का उपयोग कर, ligand संभवतः सामान्य रूप से सुलभ नहीं या सतह पर उजागर क्षेत्रों के लिए बाध्य कर सकते हैं ( उदा., virion capsid की सतह के नीचे virion के अंदर का सामना करना पड़, लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, आदि के transmembrane क्षेत्रों. खोज बॉक्स सीमित वायरल प्रोटीन के केवल सुलभ क्षेत्रों को लक्षित किया जा करने के लिए अनुमति देता है और किसी भी अवास्तविक बातचीत से बाहर नियम. आण्विक डॉकिंग क्रिस्टलीकृत संरचनाओं पर निर्भर है, लेकिन होमोलोजी मॉडलिंग में हाल ही में हुई प्रगति ने बारीकी से संबंधित क्रिस्टलीकृत संरचना15पर अपने एमिनो एसिड अनुक्रम को फिट करके गैर-क्रिस्टलीकृत संरचनाओं का विश्लेषण सक्षम किया है। यह और अधिक संरचनाओं का विश्लेषण किया जा करने की अनुमति दी है और प्राप्त जानकारी उत्परिवर्तन विश्लेषण है कि मदद कर सकते हैं भविष्यवाणी की बातचीत मान्य सहित आगे के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है.

अंत में, इस रिपोर्ट में वर्णित assays और प्रोटोकॉल विशेष रूप से उम्मीदवार एंटीवायरल एजेंटों है कि वायरल प्रविष्टि को लक्षित की पहचान करने के लिए catered हैं, और जानकारी प्रदान करते हैं जो वायरल प्रवेश प्रक्रिया के कदम पर परीक्षण एजेंट लक्ष्य, चाहे वे मुक्त वायरस कणों के साथ बातचीत, और virions पर संभव दवा बातचीत साइटों की भविष्यवाणी. परख के इन प्रकार के अन्य गैर-enveloped वायरस पर दोहराया जा सकता है या वायरल प्रविष्टि के संभावित inhibitors के लिए एंटीवायरल दवा यौगिकों स्क्रीनिंग की एक विधि के रूप में लिफाफा वायरस के लिए अनुकूलित. एंटीवायरल उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए इस तरह के तंत्र-चालित दृष्टिकोण का उपयोग करने से दवा विकास प्रक्रिया में तेजी लाने और एंटीवायरल चिकित्सकीय कार्यप्रणाली के दायरे का विस्तार करने में मदद मिल सकती है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक आणविक डॉकिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में डॉ यहोशू बेखम के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन को आंशिक रूप से ताइवान के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST107-2320-B-037-002 से C.-J.L. और L.-T.L.) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था; MOST106-2320-B-038-021 और MOST107-2320-B-038-034-MY3 से L.-T.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 149 Antivirals दवा विकास प्रवेश inhibitors वायरल प्रविष्टि बाध्यकारी विश्लेषण आणविक डॉकिंग Autodock PyMol UCSF Chimera
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Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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