Summary
Цель протокола состоит в том, чтобы проиллюстрировать различные анализы, связанные с вирусной записи, которые могут быть использованы для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа.
Abstract
Противовирусные анализы, которые механически изучить вирусный вход уместно различить, на каком этапе оцененные агенты являются наиболее эффективными, и позволяют для выявления кандидатов вирусных ингибиторы входа. Здесь мы представляем экспериментальные подходы к идентификации малых молекул, способных блокировать инфекцию неконвертированным коксакивирусом A16 (CVA16) путем ориентации на частицы вируса или конкретные шаги в начале вирусного вступления. Анализы включают в себя время-оф-наркотик-дополнение анализа, поток цитометрии на основе вирусной связывания анализа, и вирусной инактивации анализа. Мы также представляем протокол молекулярного стыковки с использованием белков капсидов вируса для прогнозирования потенциальных остатков, на которые нацелены противовирусные соединения. Эти анализы должны помочь в выявлении кандидата противовирусных агентов, которые действуют на вирусный вход. Будущие направления могут исследовать эти возможные ингибиторы для дальнейшего развития лекарственных средств.
Introduction
Заболевания рук, ног и рта (HFMD) – это заболевание, чаще всего вызываемые коксакивирусом A16 (CVA16) и энтеровирусом 71 (EV71) у детей младшего возраста. В последнее время в Азиатско-Тихоокеанском регионе наблюдается значительный подъем в CVA16-индуцированной HFMD. Хотя симптомы могут быть мягкими, тяжелые осложнения могут возникнуть, которые влияют на мозг и сердце, с потенциальной летальностью1,2. В настоящее время для CVA16 не существует лицензированных противовирусных препаратов или прививок, и поэтому существует настоятельная необходимость в разработке противовирусных стратегий по пресечению будущих вспышек и связанных с ними осложнений.
CVA16 является неконвертированный вирус, который имеет icosahedral capsid собраны из pentamers, что каждый содержит 4 структурных белков, а именно VP1, VP2, VP3, и VP4. Окружающая каждая пятикратная ось в пентамаке является "каньон" области, которая показывает, как депрессия и известен своей ролью в рецепторе связывания3. На дне этого каньона находится гидрофобный карман в регионе VP1, который содержит натуральный жирный лиганд под названием сфингозин (SPH). Сотовые рецепторы, такие как человеческий P selectin гликопротеин лиганд 1 (PSGL-1) и мусорщик рецепторов класса B 2 (SCARB2), было предложено играть роль в вирусной связывания, вытесняя этот лиганд, который приводит к конформационным изменениям капсида и последующее выброса вирусного генома в клетку-хозяина4,5,6. Выявление возможных ингибиторов, которые блокируют последовательные события в процессе вирусного вступления может обеспечить потенциальные терапевтические стратегии против CVA16 инфекции.
Шаги в жизненном цикле вируса могут быть вскрыты с помощью экспериментальных подходов в качестве мишеней, чтобы помочь определить режим конкретных противовирусных агентов. Анализ времени добавления препарата исследует эффект лечения препарата в разное время во время вирусной инфекции, включая предварительное вступление (добавлено до вирусной инфекции), вступление (добавлено одновременно с вирусной инфекцией) и после вступления (добавлено после вирусной инфекции)7. Воздействие может быть оценено с помощью стандартного налета анализ путем количественной оценки количества вирусных бляшек, образуются в каждом из условий лечения. Поток цитометрии основе вирусной связывания асссе определяет, если препарат предотвращает вирусное вложение в клетки-хозяина. Это достигается путем изменения температуры с 37 градусов по Цельсию, при котором происходит большинство вирусных инфекций человека, до 4 градусов по Цельсию, где вирионы могут связываться с поверхностью клетки-хозяина, но не могут войти в клетки7. Частицы вируса, связанные с клеточной мембраной, затем количественно определяются с помощью иммуностоинга против вирусных антигенов и оцениваются цитометрией потока. Вирусная инактивация анализ, с другой стороны, помогает оценить потенциальные физические взаимодействия препарата со свободными частицами вируса, либо экранирование или нейтрализации virions, или вызывая агрегации или конформационные изменения, которые делают их неактивными для последующие взаимодействия с поверхностью клетки-хозяина во время инфекции8,9. В этом эксперименте, вирусный инокулум разрешается сначала инкубировать с препаратом, прежде чем разбавленной титрировать препарат до заражения монослойной клетки хозяина и выполнения стандартного зубного налета асссее8. Наконец, молекулярная стыковка является мощным инструментом для прогнозирования потенциальных мест взаимодействия наркотиков на поверхности вириона, включая вирусные гликопротеины от окутанных вирусов и вирусные капсидные белки от неконвертированных вирусов, с помощью вычислительных Алгоритмы. Это помогает механически определить цели способа действия препарата и предоставить полезную информацию, которая может быть дополнительно проверена вниз по течению анализов.
Недавно мы использовали описанные выше методы для выявления противовирусных соединений,которые эффективно блокировали инфекцию неохваченным CVA16 9. В этом вопросе описаны и обсуждены подробные протоколы, которые были использованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры и вирусные инфекции должны проводиться в сертифицированных капюшонах биобезопасности, которые подходят для уровня биобезопасности обрабатываемых образцов. Два танина класса малых молекул хебулагиновой кислоты (CHLA) и punicalagin (PUG), которые наблюдались эффективно блокировать CVA16 инфекции9, используются в качестве примеров кандидата ингибирующих агентов. Для основных принципов в методах вирусологии, распространение вируса, определение вируса титр, и понятия бляшки формирования единиц (PFU) или множественность инфекции (МВД), читатель ссылается на ссылку10.
1. Культура клеток, подготовка вируса, подготовка соединения и совонки цитотоксичность
- Клетки рабдомиосаркомы человека (РД) являются клетками-хозяевами, разрешительными для инфекции CVA1611. Выращивайте RD-клетки в 10 мл модифицированной среды Орла (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 200 U/mL пенициллина G, 200 мкг/мл стрептомицина и 0,5 мкг/мл амфотерицина В в т-75 фляги при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубаторе.
- Подготовка CVA16 путем распространения вируса в клетках RD и определить вирусный титр в PFU/mL. Для оптимизированного протокола, пожалуйста, обратитесь к ссылке11.
- Подготовьте испытательные соединения и элементы управления с помощью соответствующих растворителей: например, растворите CHLA и PUG в диметилсульфодокси (DMSO). Для всех этапов инфекции базальная среда состояла из DMEM плюс 2% FBS и антибиотиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация DMSO в тестовых соединений лечения равна или ниже 0,25% в экспериментах; 0,25% DMSO включен в качестве отрицательного контроля лечения в анализы для сравнения. - Выполните анализ цитотоксичности испытательных соединений на RD-клетках с помощью жизнеспособности клеток, определяющих реагент, такой как XTT ((2,3-метокси-4-нитро-5-сульфофенил-5-фениламино)-углеродил-2H-тетразолий гидроксид). Для получения подробного протокола, пожалуйста, обратитесь к ссылке12. Определите концентрацию цитотоксичности испытательных соединений с помощью аналитического программного обеспечения, такого как GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя. Концентрации наркотиков, которые не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток (95% жизнеспособных клеток), используются для оставшейся части исследования.
2. Время-оф-наркотик-дополнение Ассай
-
Оценить влияние препаратов на клетки-хозяина до вирусной инфекции (предварительное лечение)
- Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
- Лечить RD-клетки с тестовыми соединениями в нецитотоксических концентрациях (определяется со ступени 1,4) в 1 мл базального объема носителя на 1 ч или 4 ч.
- Вымойте клетки с 1-2 мл PBS перед добавлением 50 PFU/well вируса в базальной среде (окончательный объем инокулума составляет 300 л) на 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
- После инфекции, мыть монослой снова с помощью PBS, затем наложение с 1 мл базальных носителей, содержащих 0,8% метилцеллюлозы для дальнейшей инкубации при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатора.
- После 72 ч инкубации удалите накладные носители и промойте скважины с помощью 2 мл PBS.
- Закрепите скважины с помощью 0,5 мл 37% формальдегида в течение 15 мин.
- Удалите супернатант и снова помойте с помощью PBS.
- Пятно скважин с помощью 0,5 мл 0,5% кристаллофийно-фиолетового раствора. Затем удалите пятнового раствора в течение 2 мин и промойте колодцы мягким потоком воды перед высыханием воздуха.
- Посчитайте вирусные бляшки, поместив пластину на коробку с белым светом. Рассчитать процент (%) CVA16 инфекции следующим образом: (Средний ) бляшки вирус-препарат / Средний ) налета вирус -DMSO контроль)
-
Оценить эффект одновременного добавления лекарств и вируса (совместное добавление)
- Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
- Лечить RD-клетки с испытательными соединениями в соответствующих концентрациях и 50 PFU/well CVA16 (окончательный объем инокулума составляет 300 кл) одновременно в течение 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
- Вымойте клетки с 1 мл PBS, а затем наложить с 1-2 мл базальных носителей, содержащих 0,8% метилцеллюлозы для дальнейшей инкубации при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатора.
- Пятно вирусных бляшек с кристаллофийным после 72 ч после инфекции и определить% CVA16 инфекции, как описано выше.
-
Оценить эффект медикаментозного лечения после вирусного вступления (после инфекции)
- Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатордля для получения монослой.
- Прививать RD-клетки с 50 PFU/well CVA16 (окончательный объем инокулума составляет 300 л) на 1 ч. Рок пластины каждые 15 минут.
- Вымойте скважины 1-2 мл PBS и налейте клетки с базальными носителями, содержащими 0,8% метилцеллюлозы и соответствующие концентрации испытательных соединений.
- Пятно вирусных бляшек с кристально фиолетовой и рассчитывать после 72 ч после инфекции и определить% CVA16 инфекции инкубаций, описанных выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все PBS смает осторожно, чтобы избежать подъема клеток.
3. Поток цитометрии основе связывания ассе
- Семена RD-клеток в 12-колодцах при плотности посева 2 х 105 клеток/хорошо. Инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 инкубатор для достижения монослой.
- Предварительно охладите монослой клеток при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Заразить RD-клетки CVA16 (MOI No 100) при наличии и отсутствии испытательных соединений в течение 3 ч при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните вирусную прививку на льду и последующую инкубацию в холодильнике 4 градусов по Цельсию для поддержания температуры при температуре 4 градусов по Цельсию, что позволяет вирусную связывание, но не вход. - Удалить вирус инокулум и промыть один раз с 1-2 мл ледяной PBS.
- Поднимите клетки, добавив 1 мл ледяного буфера диссоциации к скважинам на льду в течение 3 мин, прежде чем собирать клетки и повторно приостанавливать их в ледяном потоке цитометрии буфера (1x PBS плюс 2% FBS).
- Дважды вымойте клетки с помощью ледяного цитометрии и зафиксировать клетки с 0,5 мл 4% параформальдегида в течение 20 минут на льду.
- Вымойте клетки с помощью PBS, чтобы удалить любые несвязанные или слабо связанные вирусы, а затем пятно клеток с 1 мл анти-VP1 антитела (1:2,000; разбавленные в PBS, содержащие 3% BSA) на льду в течение 1 ч, а затем инкубации со вторичным Alexa 488-конъюгированных анти-мышь IgG (1:250; разбавленный в PBS, содержащий 3% BSA) на льду в течение 1 ч. Выполните PBS смыляет (3 раза) после каждого лечения антителами.
- Resuspend клетки в 0,5 мл ледяного потока цитометрии буфера и выполнять циклометрический анализ потока цитометр с помощью стандартных процедур. Представляйте данные в гистограммах с использованием связанного с этим программного обеспечения и квантитировать для представления барного графика.
4. Вирусный инактивации Ассай
-
Выполните вирусную инактивацию, как описано ранее12, используя следующие условия:
- Стартовая концентрация 106 PFU/mL CVA16.
- RD-клеточные монослои в 12-колодных пластинах от плотности посева 2 х 105 клеток/колодца.
- 50-кратное разбавление для титрирование из лекарственных соединений в результате чего окончательная концентрация вируса 50 PFU/ хорошо.
- Мыть шаги с использованием 1-2 мл PBS.
- Наверсы в средствах массовой информации, содержащей 0,8% метилцеллюлозы. - Выполните окончательное считывание вирусной инфекции с использованием кристально фиолетового окрашивания вирусных бляшек процедуры, как описано выше.
5. Молекулярный стыковочный анализ
- Скачать 3D молекулы испытательных соединений из PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Если молекулы не имеют 3D-структуры загружены, загрузите 2D структуры или используйте последовательность строк SMILES и преобразуйте в 3D молекулы через молекулярную программу (например, CORINA).
- Скачать вирусную биологическую сборочную единицу от RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) и подготовить модель вирусной структуры с помощью биокомпьютерной программы (например, UCSF Chimera). Например, в случае CVA16 зрелая кристаллическая структура virion (PDB: 5C4W)3, удалить растворители из файла PDB, заменить неполные боковые цепи с использованием данных из библиотеки Dunbrach 2010 Rotamer, и добавить водороды и заряды в структуру как ранее сообщалось13. Стыковочные мишени могут быть любыми соответствующими вирусными белками для предполагаемого анализа с информацией о биологической сборке (Protein Data Bank).
-
Док-тест соединений на подготовленный вирус единицы, используя, например, UCSF Chimera, и анализировать выходные файлы с визуализацией программного обеспечения (например, Autodock Vina, PyMol):
- Загрузите файл испытательного соединения в UCSF Chimera как «лиганд» и выполните слепую стыковку, выбрав весь подготовленный вирусный белок в качестве «рецептора». Используйте компьютерную мышь или трекпад, чтобы изменить размер объема поиска на весь "рецептор". В "Расширенных опциях" позволяет максимально еколичество режимов связывания. Стыковочные рамы будут автоматически ранжированы от самой высокой до самой низкой привязки энергии.
- (Необязательно) В дополнение к слепой стыковке, ограничить стыковки на вирусный белок в регионах, представляющих интерес, полученных от слепых результатов стыковки с помощью мыши или трекпад снова уменьшить объем поиска (например, 100 х 100 х 100 евро). Этот шаг помогает подтвердить результаты слепой стыковки и увеличивает специфичность.
- Используйте молекулярную графическую систему (например, PyMol) для анализа положения связывающих режимов путем загрузки стыковочного файла. Найти полярные контакты от соединения к вирусному белку, выбрав «лиганд» и идентифицируя полярные контакты с вариантом «к любым атомам»; изучить результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Время-оф-наркотик-дополнение анализ указан на рисунке 1 и показывает влияние от лечения с использованием малых молекул CHLA и PUG на CVA16 инфекции либо предварительно вирусной записи (предварительное лечение), во время вирусного вступления (совместное добавление), или после вирусного вступления ( после инфекции). Обе небольшие молекулы только производится незначительное воздействие против CVA16 инфекционной ли в предварительной обработке клеток-хозяев до вирусной инфекции(Рисунок 1A) или в пост-инфекции лечения (рисунок1C). В отличие от chlA и PUG эффективно отменил CVA16 инфекции на йgt;80% в совместное дополнение лечения(рисунок 1B). Эти наблюдения, таким образом, показывают, что эти два соединения являются наиболее эффективными, когда они одновременно присутствуют с частицами вируса на поверхности клетки-хозяина во время инфекции.
На рисунке 2, циклометрический анализ связывания на основе потока (схематично иллюстрированный на рисунке 2A) подтверждает, что два танина предотвращают ввод CVA16, предотвращая привязку вирусной частицы к клеткам-хозяину. Данные количественной оценки на рисунке 2B показывают, что количество вируса, обнаруженного на поверхности RD-клеток в присутствии двух препаратов, составляет менее 10%, подобно гепарину положительный контроль, который, как известно, предотвращает CVA16 вложения14. Рисунок 2C, 2D, и 2E изображают связанные циклометрические гистограммы потока, где полоса сдвиг из-за обнаружения CVA16 на поверхности клетки RD значительно снижается, когда CHLA и PUG присутствуют.
На рисунке 3A показано, как проводился эксперимент по вирусной инактивации. Соединение препарата было либо смешано с частицами вируса CVA16 и инкубировано в течение 1 ч (долгосрочного) до шага разбавления, либо смешанное и немедленно разбавленное (краткосрочным) до инфицирования. Как показано на рисунке 3B, предварительное инкубацию частиц CV16 с испытательными агентами в течение 1 ч привело к почти полной защите RD-клеток от вирусной инфекции по сравнению с краткосрочной инкубации и контроля DMSO. Полученные результаты свидетельствуют о том, что и CHLA, и PUG взаимодействуют с частицами CVA16 и способны сделать их неактивными при последующей инфекции.
Поскольку наши данные показывают, что соединения препарата могут непосредственно инактивировать частицы CVA16, и, следовательно, определить вирион себя как правдоподобную цель их противовирусной активности, мы использовали молекулярную стыковку, чтобы предсказать потенциальное взаимодействие (ы) между этими агентов и CVA16 капсид пентамак. На рисунке 4A показана поверхностная проекция pentamer CVA16, которая составляет икосахедральный капсид virion CVA16. Молекулярная стыковка танинов CHLA(рисунок 4B;зеленый) и PUG (рисунок4C;синий) показывают, что они оба, по прогнозам, связываются в районе каньона pentamer CVA16. В частности, обе небольшие молекулы связаны чуть выше карманного входа(рисунок 4B и 4C,увеличенные панели), который держит карманный фактор и играет важную роль для посредничества CVA16 связывания и вступления в клетку-хозяина. Таким образом, как CHLA, так и PUG, как представляется, маскируют область входного кармана, что теоретически препятствует взаимодействию между частицами вируса и рецепторами клеток-хозяев. Рисунок 4D и 4E указывают на уникальные остатки, предсказанные от полярных контактов CHLA и PUG, соответственно, вокруг карманного входа, причем большинство из этих взаимодействий происходит с VP1 для обоих соединений и 3 аминокислот Asn85 , Lys257, и Asn417, будучи общим между двумя танинами.
Рисунок 1: Эффект добавления времени CHLA и PUG против инфекционности CVA16. RD-клетки лечились CHLA (20 мкм) или PUG (25 мкм) в разное время прививки CVA16 (50 PFU/well). DMSO (0.25%) лечение было включено в качестве отрицательного контроля и все анализы были проанализированы налет анализа с использованием кристалло-фиолетового окрашивания 72 ч после инкубации. ()Для предварительной обработки, клетки были инкубированы с испытательными соединениями в течение 1 ч или 4 ч, а затем были промыты до CVA16 инфекции. (B) Для совместного добавления анализы, клетки вводили с наркотиками и вирусом одновременно в течение 1 ч, а затем промывают. (C) В пост-инфекции, клетки были инфицированы CVA16 в течение 1 ч, промывают, а затем лечение с испытательными соединениями. Показанные данные являются средствами и стандартным отклонением (SD) от трех независимых экспериментов. р-р злт; 0,05 по сравнению с соответствующей группой "только вирус". Статистический анализ проводился с использованием одностороннего анализа дисперсии. Эта цифра была адаптирована из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: CHLA и PUG отменяют привязку CVA16 к ячейке-хозяину. (A) Схема потока цитометрии основе связывания ассе. (B) RD-клетки (2 х 105 клеток/хорошо) были инфицированы CVA16 (MOI No 100) при наличии или отсутствии CHLA (20 мкм), ПУГ (25 мкм), растворимого гепарина (500 мкг/мл, положительный контроль) или DMSO (0,25%, отрицательный контроль) для 3 ч при 4 градусах Цельсия. Инокула из скважин были собраны в трубки, промывают pbS дважды, фиксированной, и окрашенные антителами против VP1 следуют Alexa 488-конъюгированных вторичных антител для цитометрии потока обнаружения поверхностных вирусов. Количественные данные из обнаруженных сигналов флуоресценции были построены в качестве средства sD из трех независимых экспериментов в барном графике, как "Вирусная привязка (%). Статистический анализ проводился с использованием одностороннего анализа дисперсии. Показаны репрезентативные цитометрические гистограммы CHLA (C), PUG (D)и гепарина (E ) лечения. Эта цифра была адаптирована из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: CHLA и PUG инактивируют частицы вируса CVA16 без клеток. (A) Схема вирусного инактивации асссе. (B) CVA16 (106 PFU/well) был обработан CHLA (20 мкм) или PUG (25 мкм) и немедленно смешан для краткосрочной инактивации или инкубирован в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия для длительной инактивации, прежде чем разбавлен 50-кратной до неэффективной концентрации теста соединений до прививки на RD-клетки (окончательная концентрация вируса 50 PFU/well). DMSO (0.25%) был использован в качестве отрицательного контроля. Эксперименты были проанализированы с помощью доски с использованием кристаллического фиолетового окрашивания 72 ч после инфекции. Данные, показанные, являются средствами и SD из трех независимых экспериментов. р-р злт; 0,05 по сравнению с соответствующей группой "только вирус". Статистический анализ проводился с использованием одностороннего анализа дисперсии. Эта цифра была адаптирована из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: CHLA и PUG нацелены на капсид CVA16 возле карманного входа. Поверхностная проекция частицы virиона CVA16 с мономерным структурным пентамером, очерченным красными линиями (A). Дополнительные pentamers на virion показаны в циании, пурпурный, индиго, бронза, и зеленый. Молекулярный стыковочный анализ CHLA (B, зеленый) и PUG (C , синий) на PENtamer CVA16 (PDB: 5C4W); увеличенные панели разграничены желтым цветом. VP1 - оранжевый, VP2 - серый, VP3 - белый; полярные контакты показаны как черные тире. Остатки, что макияж карманный вход окрашены в красный цвет (Ile94, Asp95, Gln207, Met212, Met213, Lys257, Thr258). Д., Е. Вид сбоку крупным планом в каньон, где находитсякарманный вход и где CHLA (D) и PUG (E ) привязываются к. Уникальные остатки полярных контактов от полярных контактов соединений на пентамаке помечены желтыми (VP1), белыми (VP2) и черными (VP3) шрифтами. Белая пунктирной линии указывает на область карманного входа. Эта цифра была адаптирована из ссылки9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе мы описали протоколы, которые полезны для идентификации противовирусных кандидатов, нацеленных на вирусную запись, в частности против неконвертированных CVA16. Анализы разработаны таким образом, чтобы вскрыть ранние события во время вирусной записи, что полезно для уточнения механизма (ы) действия и потенциальной цели (ы) противовирусной активности тестовых агентов. Анализ «времени добавления наркотиков» позволяет в целом определить потенциальную цель испытательных соединений, например, неинфицированные клетки-хозяина (анализ предварительной обработки), частицы вируса или его взаимодействия с поверхностью клетки-хозяина (анализ совместного добавления ), или вирус-инфицированной клетки-хозяина во время вирусной репликативной фазы (после инфекционный анализ). Этот анализ сам по себе может определить метод взаимодействия с соединениями (например, совместное добавление), что приводит к последующей анализ, описанный в этом протоколе (например, вирусной инактивации анализа и связывания анализа). Шаги мытья имеют решающее значение для обеспечения того, чтобы исследуемый метод лечения специфичен для проанализированных. Использование "потока цитометрии основе связывания анализ" помогает оценить влияние соединений, в частности, на вирус связывания с клеткой-хозяином. Поддержание температуры эксперимента на уровне 4 градусов по Цельсию имеет важное значение для окончательного обнаружения вирионов на поверхности клетки, так как эта температура позволяет вирусную связывание, но не вход. «Анализ вирусной инактивации» может помочь определить потенциальное физическое взаимодействие соединений препарата с частицами вируса, свободных от клеток. Критическим шагом является разбавление для титрирования из лекарственных соединений после инкубации с вирусной инокулум, так как это необходимо для предотвращения любого значимого взаимодействия препаратов с поверхностью клетки хозяина в последующем этапе инфекции12.
Поскольку вирусный вход является многоступенчатое событие, вирусный класс ингибитора входа противовирусных агентов, возможно, может оказать несколько типов механизмов, в том числе: (1) модуляции факторов входа поверхности клетки / рецепторов или связанных с ними сигнальных путей; (2) влияет на текучесть или целостность клеточной мембраны; (3) ориентация на электростатические или ван дер Ваалы взаимодействия между частицами вируса и поверхностью клетки-хозяина; (4) индуцирование физических изменений в вирионах, таких как поломка частиц или агрегация; (5) привязка к вирусным гликопротеитам или капсидным белкам и предотвращение их функций или конформационных изменений; (6) блокирование механизмов, связанных с синтезом; и (7) предотвратить высвобождение вирусного генома внутри клетки-хозяина. Таким образом, анализы, описанные в настоящем докладе, могут помочь указать на перечисленные выше потенциальные способы действий, которые могут быть дополнительно подтверждены дополнительными экспериментами. Наконец, описанный здесь «молекулярный стыкововый анализ» играет важную роль в прогнозировании потенциальных регионов взаимодействия между соединениями препарата и вирусными частицами, и как таковой может помочь определить кандидаты вирусных капсидов или гликопротеинов связующих и целевых остатков на частицах вируса. Однако эти прогнозы зависят от стыковочного программного обеспечения, а также от разрешения и точности кристаллических структур вирусного белка. Важно отметить, что дополнительный метод ограниченного стыковки в шаге 5.3.2 был добавлен, потому что часто при использовании вирусных структурных белков в качестве "рецепторной" молекулы, лиганд может, возможно, связываться с регионами, как правило, не доступны или подвергаются на поверхности ( например, под поверхностью вириона капсид, обращенный к внутренней стороне вириона, трансмембранных областей гликопротеинов конверта и т.д.). Ограничение окна поиска позволяет только доступные области вирусного белка, которые будут направлены и исключает любые нереалистичные взаимодействия. Молекулярная стыковка зависит от кристаллизованных структур, но последние достижения в моделировании гомологии позволили анализнезировать некристаллизованные структуры путем установки его аминокислотной последовательности на тесно связанную кристаллизованную структуру15. Это позволило проанализировать больше структур, и полученная информация может быть полезна для дальнейших исследований, включая мутационный анализ, который может помочь проверить прогнозируемые взаимодействия.
В заключение, анализы и протоколы, описанные в настоящем докладе, специально обслуживаются для выявления кандидата противовирусных агентов, которые нацелены на вирусный вход, и предоставить информацию о том, на каком этапе вирусного процесса вступления тестовый агент цели, будь то они взаимодействовать со свободными частицами вируса, и прогнозирование возможных сайтов взаимодействия наркотиков на virions. Эти типы анализов могут быть повторены на других неконвертированных вирусов или адаптированы к окутанным вирусами в качестве метода скрининга противовирусных соединений наркотиков для возможных ингибиторов вирусного вступления. Использование такого механизма, ориентированного на выявление противовирусных кандидатов, могло бы способствовать ускорению процесса разработки лекарств и расширению сферы применения противовирусных терапевтических средств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарны доктору Джошуа Бекхэму (Joshua Beckham) из Техасского университета в Остине за техническую поддержку с помощью молекулярной стыковки. Это исследование было частично поддержано за счет финансирования со стороны Министерства науки и техники Тайваня (MOST107-2320-B-037-002 до C.-J.L. и L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 и MOST107-2320-B-038-034-MY3 в Л.-Т.Л.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
