Summary
Målet med protokollet är att illustrera de olika analyser som avser viral inmatning som kan användas för att identifiera kandidat virus inläggs hämmare.
Abstract
Antiviral analyser som mekanistiskt undersöka viral inträde är relevanta för att urskilja vid vilken steg de utvärderade agenterna är mest effektiva, och möjliggöra identifiering av kandidaten viral Entry-hämmare. Här presenterar vi experimentella metoder för identifiering av små molekyler som kan blockera infektion av den icke-höljeförsedda coxsackievirus A16 (CVA16) genom att rikta in viruspartiklarna eller specifika steg i tidig viral inmatning. Analyser inkluderar tid-av-drog-addition analys, flödescytometri-baserade viral binding assay, och viral inaktivering assay. Vi presenterar också ett molekylärt docknings protokoll som utnyttjar virus kapsid proteiner för att förutsäga potentiella rester riktade av de antivirala föreningarna. Dessa analyser bör bidra till att identifiera kandidat antivirala medel som verkar på viral inträde. Framtida riktningar kan utforska dessa möjliga hämmare för ytterligare läkemedelsutveckling.
Introduction
Hand-, mul-och klövsjuka (HFMD) är en sjukdom som oftast orsakas av coxsackievirus A16 (CVA16) och enterovirus 71 (EV71) hos små barn. Nyligen i hela Asien och Stillahavsområdet, det har varit en betydande uptick i CVA16-inducerad HFMD. Medan symtomen kan vara lindriga, allvarliga komplikationer kan förekomma som påverkar hjärnan och hjärtat, med potentiell dödsfall1,2. För närvarande finns det inga licensierade antivirala terapier eller vaccinationer tillgängliga för CVA16, och därför finns det ett trängande behov av att utveckla antivirala strategier för att bromsa framtida utbrott och tillhörande komplikationer.
CVA16 är en icke-höljeförsedda virus som har en ikosaedrisk kapsid monteras från pentamers att varje innehåller 4 strukturella proteiner nämligen VP1, VP2, VP3, och VP4. Omslutande varje femfaldig axel i pentamer är en "Canyon" region som visar som en depression och är känd för sin roll i receptorbindning3. Längst ner i denna kanjon ligger en hydrofoba ficka i VP1 regionen som innehåller en naturlig fet ligand som heter sfingosin (SPH). Cellulära receptorer, såsom humant P selektin glykoprotein ligand 1 (psgl-1) och Scavenger receptor klass B medlem 2 (SCARB2), har föreslagits för att spela en roll i viral bindning genom att förtränga denna ligand vilket resulterar i överensstämmande förändringar till kapsid och efterföljande utmatning av viral genomet till värdcellen4,5,6. Identifiera möjliga hämmare som blockerar de successiva händelserna i viral Entry-processen kan ge potentiella terapeutiska strategier mot CVA16 infektion.
Stegen i virusets livscykel kan dissekeras genom experimentella metoder som mål för att hjälpa till att identifiera läge-specifika antivirala medel. En tid-av-drog-addition analys undersöker läkemedelsbehandling effekt vid olika tidpunkter under virusinfektion, inklusive pre-entry (läggas före virusinfektion), inträde (läggas till samtidiga viruset infektion), och post-entry (läggas till efter virusinfektion)7. Effekten kan bedömas med hjälp av en vanlig plack-analys genom att kvantitera antalet virala plack som bildas i vart och ett av behandlings villkoren. Flödet cytometry-baserade viral binding assay avgör om drogen förhindrar viral fastsättning att vara värdceller. Detta uppnås genom att temperaturen förskjuts från 37 ° c, vid vilken majoriteten av humana virusinfektioner uppträder, till 4 ° c, där virionerna kan binda till värdcellytan men inte kan komma in i cellerna7. De cellmembran bundna viruspartiklarna kvantifieras sedan genom immunofärgning mot virala antigener och bedöms av flödescytometri. Viral inaktivering assay å andra sidan hjälper till att bedöma potentiella fysiska interaktioner av drogen med fria viruspartiklar, antingen avskärmning eller neutralisera virionerna, eller orsakar aggregeringar eller överensstämmande förändringar som gör dem inaktiva för efterföljande interaktioner med värd cells ytan under infektionen8,9. I detta experiment, viral inokulum är tillåtet att först Inkubera med drogen innan de späds att titrera ut drogen innan infektera värdcellen enskiktslager och utföra en standard plack assay8. Slutligen, molekylär dockning är ett kraftfullt verktyg för att förutsäga potentiella läkemedelsinteraktioner webbplatser på spjälkat virus ytan, inklusive viral glykoproteiner från höljeförsedda virus och viral kapsid proteiner från icke-höljeförsedda virus, med hjälp av Computational Algoritmer. Detta bidrar till att mekanistiskt precisera mål av läkemedlets verkningssätt och ge användbar information som kan ytterligare valideras av nedströms analyser.
Vi anställde nyligen ovan beskrivna metoder för att identifiera antivirala föreningar som effektivt blockerade infektion av icke-höljeförsedda CVA169. Häri beskrivs och diskuteras de detaljerade protokollen som användes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Alla cellkulturer och virusinfektioner måste utföras i certifierade biosäkerhets fläktar som är lämpliga för biosäkerhets nivån hos de prover som hanteras. De två tannin-klass av små molekyler chebulagic syra (CHLA) och punicalagin (mops), som observerades för att effektivt blockera CVA16 infektion9, används som exempel på kandidat inhibitoriska agenter. För grundläggande principer i virologisk teknik, virusförökning, bestämning av virus titer, och begrepp för plack bildar enheter (PFU) eller mångfald av infektion (MOI), läsaren hänvisas till referens10.
1. cell kultur, virus beredning, sammansatt beredning och sammansatt cytotoxicitet
- Mänskliga rabdomyosarkom (RD) celler är värdceller tillåtande till CVA16 infektion11. Odla RD cellerna i 10 mL av Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS), 200 U/mL Penicillin G, 200 μg/mL streptomycin, och 0,5 μg/mL amfotericin B i T-75 flaskor vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
- Förbered CVA16 genom att sprida viruset i RD-celler och bestäm viral titer i PFU/mL. För optimerat protokoll hänvisas till referens11.
- Bered test föreningarna och kontrollerna med hjälp av respektive lösningsmedel: lös till exempel CHLA och PUG i dimetylsulfoxid (DMSO). För alla infektions steg bestod det basala mediet av DMEM plus 2% FBS och antibiotika.
Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av DMSO i test sammansatta behandlingar är lika med eller under 0,25% i experimenten; 0,25% DMSO ingår som en negativ kontroll behandling i analyserna för jämförelse. - Utföra cytotoxicitetstest av test föreningarna på RD-cellerna med hjälp av en cellgenomförbarhet som bestämmer reagens, såsom XTT ((2, 3-BIS [2-Methoxy-4-Nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino)-karbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid). För detaljerat protokoll, se referens12. Bestäm cytotoxicitetskoncentrationerna för test föreningarna med hjälp av en analytisk programvara såsom GraphPad Prism enligt tillverkarens protokoll. Läkemedelskoncentrationer som inte signifikant påverkar cellernas lönsamhet (≥ 95% livskraftiga celler) används för återstoden av studien.
2. tid-för-drog-addition assay
-
Att utvärdera påverkan av läkemedel på värdceller före virusinfektion (förbehandling)
- Seed RD celler i 12-brunn tallrikar vid en seedning densitet av 2 x 105 celler/brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator för att få en monolayer.
- Behandla RD-celler med test föreningar vid icke-cytotoxiska koncentrationer (bestäms från steg 1,4) i 1 mL basal medie volym för 1 h eller 4 h.
- Tvätta celler med 1-2 ml PBS innan du lägger till 50 PFU/brunn av virus i basal medium (den slutliga volymen av inokulum är 300 μl) för 1 h. vagga plattan var 15 min.
- Efter infektionen, tvätta enskiktslager igen med PBS, sedan overlay med 1 ml basala medier som innehåller 0,8% metylcellulosa för ytterligare inkubering vid 37 ° c i en 5% Co2 inkubator.
- Efter 72 h av inkubering, ta bort överlagrad media och Tvätta brunnarna med 2 mL PBS.
- Fixera brunnarna med 0,5 mL 37% formaldehyd i 15 min.
- Ta bort supernatanten och tvätta igen med PBS.
- Fläcka brunnarna med 0,5 mL 0,5% kristall violett lösning. Ta sedan bort fläcken lösningen inom 2 min och Tvätta brunnarna med en mild ström av vatten innan lufttorkning.
- Räkna virala plack genom att placera plattan på en vit-ljuslampa låda. Beräkna procent (%) CVA16 infektion enligt följande: (medelvärde # av plack virus + läkemedel /Mean # av plack virus + DMSO kontroll) × 100%.
-
Att utvärdera effekten av att lägga till läkemedel och viruset samtidigt (co-addition)
- Seed RD celler i 12-brunn tallrikar vid en seedning densitet av 2 x 105 celler/brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator för att få en monolayer.
- Behandla RD-celler med test föreningarna vid lämpliga koncentrationer och 50 PFU/brunn av CVA16 (den slutliga volymen av inokulum är 300 μl) samtidigt för 1 h. vagga plattan var 15 min.
- Tvätta celler med 1 mL PBS och överlägg sedan med 1-2 mL basmaterial som innehåller 0,8% metylcellulosa för ytterligare inkubering vid 37 ° c i en 5% CO2 -inkubator.
- Fläcken virala plack med Crystal Violet efter 72 h post infektion och bestämma% CVA16 infektion som beskrivs ovan.
-
Att utvärdera läkemedelsbehandling effekt efter viral entry (post-infektion)
- Seed RD celler i 12-brunn tallrikar vid en seedning densitet av 2 x 105 celler/brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator för att få en monolayer.
- Inokulera RD-cellerna med 50 PFU/brunn av CVA16 (den slutliga volymen av inokulum är 300 μl) för 1 h. vagga plattan var 15 min.
- Tvätta brunnarna med 1-2 mL PBS och överlagra cellerna med basala medier som innehåller 0,8% metylcellulosa och lämpliga koncentrationer av test föreningar.
- Fläcken virala plack med kristall violett och räkna efter 72 h post infektion och bestämma% CVA16 infektion inkuberingar som beskrivs ovan.
Anmärkning: Utför alla PBS tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna.
3. flödescytometri-baserad bindnings analys
- Seed RD celler i 12-brunn tallrikar vid en seedning densitet av 2 x 105 celler/brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator för att uppnå en monolayer.
- Pre-Chill cellen enskiktslager vid 4 ° c för 1 h.
- Infektera RD-celler med CVA16 (MOI = 100) i närvaro och frånvaro av test föreningarna under 3 h vid 4 ° c.
Anmärkning: Utför viral inokulering på is och den påföljande inkuberingen i ett kylskåp på 4 ° c för att bibehålla temperaturen vid 4 ° c, vilket medger viral bindning men inte inträde. - Ta bort virusinoculum och tvätta en gång med 1-2 mL iskall PBS.
- Lyft celler genom att tillsätta 1 mL iskall dissociationsbuffert till brunnarna på isen under 3 min, innan cellerna inhämtar sig och återför dem i iskall flödescytometribuffert (1x PBS plus 2% FBS).
- Tvätta celler två gånger med hjälp av den iskalla flödescytometribufferten och fixera cellerna med 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min på is.
- Tvätta cellerna med hjälp av PBS för att avlägsna obundna eller svagt bundna virus, och sedan färga cellerna med 1 mL anti-VP1 antikropp (1:2000, utspädd i PBS innehållande 3% BSA) på is för 1 h, följt av inkubering med en sekundär Alexa 488-konjugerat anti-mus-IgG (1:250; utspädd i PBS innehållande 3% BSA) på is under 1 h. utför PBS-tvättar (3 gånger) efter varje antikroppsbehandling.
- Omsuspendera cellerna i 0,5 mL av den iskalla flödescytometribufferten och utför flödescytometrianalys på en flödescytometer med standardprocedurer. Presentera data i histogram med hjälp av tillhörande programvara och kvantitera för bar Graph representation.
4. viral inaktivering analys
-
Utför viral inaktiverings analys som tidigare beskrivits12 med följande villkor:
-En startkoncentration på 106 PFU/ml CVA16.
-RD cell enskiktslager i 12-well plattor från en sådd densitet av 2 x 105 celler/brunn.
-50-faldig utspädning för titrering ut läkemedels föreningarna resulterar i en slutlig virus koncentration av 50 PFU/brunn.
-Tvätta steg med 1-2 mL PBS.
-Överlagrad media som innehåller 0,8% metylcellulosa. - Utföra slutlig avläsning av virusinfektion med hjälp av Crystal Violet färgning av virala plack förfarande som beskrivs ovan.
5. molekylära docknings analys
- Ladda ner 3D-molekyler av test föreningar från PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Om molekyler inte har en 3D-struktur laddas upp, Ladda ner 2D strukturer eller använda SMILES String sekvens och omvandla till 3D-molekyler via ett molekylärt program (t. ex. CORINA).
- Ladda ner viral biologisk församling enhet från rcsb protein data bank (https://www.rcsb.org/) och förbereda viral struktur modell med hjälp av en bioinformatik program (t. ex. UCSF Chimera). Till exempel, i fallet med CVA16 mogna spjälkat virus Crystal Structure (PDB: 5c4w)3, ta bort lösningsmedel från den PDB filen, ersätta ofullständiga sidokedjor med hjälp av data från dunbrach 2010 rotamer bibliotek, och tillsätt hydrogener och avgifter till strukturen som tidigare redovisade13. Dockningsmål kan vara alla relevanta virala proteiner för den avsedda analysen med en biologisk sammansättning information (protein data bank).
-
Docka test föreningar på den förberedda virus enheten med hjälp av till exempel UCSF Chimera, och analysera utdatafiler med en visualisering programvara (t. ex., autodock Vina, PyMol):
- Ladda upp test sammansatta filen till UCSF Chimera som "ligand" och utföra blind dockning genom att välja hela beredda viral protein som "receptor". Använd datormus eller styrplatta för att ändra storlek på sökvolymen till hela "receptorn". I avancerade alternativ tillåter du att antalet bindnings lägen är maximalt. Docknings ramarna rangordnas automatiskt från högsta till lägsta bindande energi.
- Valfritt Vidare till blind dockning, begränsa docknings platsen på viral protein i regioner av intresse som härrör från blind dockning resultat med hjälp av musen eller styrplattan igen för att minska sökvolymen (t. ex., 100 Å x 100 Å x 100 Å). Det här steget hjälper till att bekräfta blind docknings resultat och ökar specificitet.
- Använd ett molekylärt grafiksystem (t. ex. PyMol) för att analysera bindnings lägena positioner genom att ladda upp docknings filen. Hitta Polar kontakter från föreningen till viral protein genom att välja "ligand" och identifiera Polar kontakter med alternativet "till alla atomer"; granska resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tid-för-drog-addition assay anges i figur 1 och visar påverkan från behandling med hjälp av små molekyler CHLA och pug på CVA16 infektion antingen pre-viral inträde (förbehandling), under viral entry (co-tillägg), eller post-viral inträde ( efter infektion). Båda små molekylerna producerade endast marginell påverkan mot CVA16 smittsamhet vare sig vid förbehandling av värdcellerna före virusinfektion (figur 1a) eller vid behandling efter infektion (figur 1c). I kontrast, CHLA och pug upphävts effektivt CVA16 infektionen av > 80% i samtidig behandling (figur 1b). Dessa observationer tyder därför på att de två föreningarna är mest effektiva när de samtidigt är närvarande med viruset partiklar på värdcellytan under infektionen.
I figur 2bekräftar flödescytometribaserad bindnings analys (schematiskt illustrerad i figur 2A) att de två tanninerna förhindrar CVA16 inträde genom att förhindra att virus partikel bindningen till värdcellerna. Kvantifieringsdata i figur 2b visar att mängden virus som upptäcks på RD-cellytan i närvaro av de två läkemedlen är mindre än 10%, liknande den heparin positiva kontroll som är känd för att förhindra CVA16 bilaga14. Figur 2C, 2Doch 2e skildrar de tillhörande flödescytometrihistogrammen där band skiftet på grund av detektion av CVA16 på RD-cellytan reduceras signifikant när CHLA och Pug förekommer.
Figur 3a visar hur det virala inaktiveringsexperimentet utfördes. Drogen föreningen var antingen blandas med CVA16 viruspartiklar och inkuberas för 1 h (långsiktig) före utspädning steg, eller blandas och omedelbart spädas (kortsiktiga) före infektionen. Som framgår i figur 3b, en pre-inkubation av CV16 partiklar med test agenterna för 1 h ledde till ett nära fullständigt skydd av RD-celler mot virusinfektion jämfört med kortsiktig inkubering och DMSO kontroll. Resultaten tyder därför på att både CHLA och PUG interagerar med CVA16 partiklar och kan göra dem inaktiva i den efterföljande infektionen.
Eftersom våra data indikerar att läkemedels föreningarna direkt kan inaktivera CVA16 partiklar, och därmed identifiera själva spjälkat virus som ett trovärdigt mål för sin antivirala aktivitet, använde vi molekylär dockning för att förutsäga den potentiella interaktionen mellan dessa agenter och CVA16 kapsid pentamer. Figur 4a visar en ytprojektion av CVA16 pentamer som utgör den ikosaedrisk kapsid av CVA16 Virion. Molekylär dockning av tanniner CHLA (figur 4b; grön) och mops (figur 4c; blått) indikerar att de båda förutspås binda i Canyon-regionen i CVA16 pentamer. Specifikt, både små molekyler bundna strax ovanför fickan ingången (figur 4b och 4c, zoomade paneler), som innehar fickan faktorn och spelar en viktig roll för medlar CVA16 bindning och inträde i värdcellen. Både CHLA och PUG verkar därför maskera fickan entré regionen, som teoretiskt skulle hindra samspelet mellan viruspartiklar och värd cellreceptorer. Figur 4D och 4e indikerar de unika rester som förutsågs från de POLÄRA kontakterna i CHLA respektive Pug, runt fickingången, där de flesta av dessa interaktioner förekom med VP1 för båda föreningarna och de 3 aminosyrorna ASN85 , Lys257, och asn417 är gemensamma mellan de två tanniner.
Figur 1: tid-för-drog-addition effekt av CHLA och PUG mot CVA16 smittsamhet. RD-celler behandlades med CHLA (20 μM) eller PUG (25 μM) vid olika tidpunkter för CVA16 ympning (50 PFU/well). DMSO (0,25%) behandling inkluderades som negativ kontroll och alla analyser analyserades genom plackanalys med hjälp av kristallviolett färgning 72 h efter inkubering. A) för förbehandling inkuberades cellerna med test föreningarna under 1 h eller 4 timmar och tvättades sedan före CVA16-infektionen. (B) för co-addition analyser, celler administrerades med läkemedel och virus samtidigt för 1 h och sedan tvättas. (C) i post-infektion, celler var infekterade med CVA16 för 1 h, tvättas, och sedan behandlas med test föreningar. Data som visas är medel ± standardavvikelse (SD) från tre oberoende experiment. *p < 0,05 jämfört med respektive "virus bara" grupp. Statistisk analys utfördes med enkelriktad analys av varians. Denna siffra har anpassats från referens9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CHLA och PUG avskaffa CVA16 bindning till värdcellen. (A) schematiskt för flödescytometribaserad bindnings analys. B) RD-celler (2 x 105 celler/brunn) INFEKTERADES med CVA16 (Moi = 100) i närvaro eller frånvaro av CHLA (20 ΜM), mops (25 μm), lösligt heparin (500 μg/ml, positiv kontroll) eller DMSO (0,25%, negativ kontroll) under 3 timmar vid 4 ° c. Inocula från brunnar samlades i rör, tvättas med PBS två gånger, fast, och färgade med anti-VP1 antikropp följt av Alexa 488-konjugerat sekundär antikropp för flödescytometri detektion av ytbundna virus. Kvantifierade data från de upptäckta fluorescenssignalerna plottas som medel ± SD från tre oberoende experiment i stapeldiagram som "virus bindning (%)". *p < 0,05 jämfört med "DMSO" kontroll behandling. Statistisk analys utfördes med enkelriktad analys av varians. De representativa flödescytometrihistogrammen av CHLA (C), pug (D) och heparin (E) behandlingar visas. Denna siffra har anpassats från referens9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CHLA och PUG inaktiverar cellfritt CVA16 viruspartiklar. A) schematiskt av viral inaktiverings analys. B) CVA16 (106 PFU/brunn) behandlades med CHLA (20 ΜM) eller pug (25 μm) och blandades omedelbart för kortvarig inaktivering eller inkuberas i 1 h vid 37 ° c för långvarig inaktivering innan den späddes 50-faldigt till en icke-effektiv koncentration av test föreningar innan vaccinera på RD celler (slutlig virus koncentration = 50 PFU/well). DMSO (0,25%) användes som en negativ kontroll. Experiment analyserades av plack analys med hjälp av Crystal Violet färgning 72 h efter infektion. Data som visas är medel ± SD från tre oberoende experiment. *p < 0,05 jämfört med respektive "virus bara" grupp. Statistisk analys utfördes med enkelriktad analys av varians. Denna siffra har anpassats från referens9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CHLA och pug riktar sig till CVA16 kapsid nära fickingången. Ytprojektion av CVA16 spjälkat virus-partikeln med den monomerstrukturella pentamer som avgränsas med röda linjer (a). Ytterligare pentamers på spjälkat virus visas i cyan, magenta, Indigo, brons och grönt. Molekylär dockning analys av CHLA (B, grön) och pug (C, blå) på CVA16 PENTAMER (PDB: 5c4w); inzoomade paneler avgränsas i gult. VP1 = orange, VP2 = grå, VP3 = vit; polära kontakter visas som svarta streck. Rester som smink ficka ingången är färgade röda (Ile94, ASP95, gln207, träffade212, träffade213, Lys257, THR258). D, E. Närbild sida i kanjonen där fickan ingången är placerad och där CHLA (D) och pug (E) binda till. Unika rester som är polära kontakter från föreningarna Polar kontakter på pentamer är märkta i gult (VP1), vit (VP2), och i svart (VP3) typsnitt. Den vita streckade linjen indikerar fickan entré region. Denna siffra har anpassats från referens9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport beskrev vi de protokoll som är användbara för identifiering av antivirala kandidater som inriktar sig på viral inmatning, särskilt mot icke-höljeförsedda CVA16. Analyserna är utformade på ett sätt att dissekera de tidiga händelserna under viral Entry, vilket är bra att klargöra mekanismen (s) åtgärder och potentiella mål (er) av test agenterna ' antiviral aktivitet. "Tid-för-drog-addition-analysen" medger att i stort sett fastställa det potentiella målet för test föreningarna, till exempel de icke-infekterade värdcellerna (förbehandlings analys), viruspartiklarna eller dess interaktioner med värdcellens yta (analys av ) eller den virusinfekterade värdcellen under den virala replikativa fasen (efter infektions analys). Detta test ensamt kan bestämma metoden för interaktion från föreningarna (t. ex., Co-addition) som leder till efterföljande analyser som beskrivs i detta protokoll (t. ex. viral inaktivering assay och bindande analys). Tvätta steg är avgörande för att säkerställa att den behandlade behandlingsmetoden är specifik för den analyserade. Användningen av den flödescytometribaserade bindnings analysen hjälper till att bedöma påverkan av föreningarna specifikt på virus bindning till värdcellen. Att bibehålla temperaturen i experimentet vid 4 ° c är viktigt för den slutliga upptäckten av virionerna på cellytan, eftersom denna temperatur tillåter viral bindning men inte inträde. Den "viral inaktivering assay" kan hjälpa till att avgöra potentiell fysisk interaktion av drogen föreningar med cell-fria viruspartiklar. Det kritiska steget är utspädning för titrering ut läkemedels föreningarna efter inkubering med viral inoculum, eftersom detta är nödvändigt för att förhindra någon meningsfull interaktion av läkemedlen med värdcellytan i den efterföljande infektionen steg12.
Eftersom viral inträde är en multi-Step händelse, en viral inträde inhibitor klass av antivirala medel kan möjligen utöva flera typer av mekanismer, inklusive: (1) modulerande cell ytan inträde faktorer/receptorer eller dess associerade signalering vägar; (2) påverkar cellmembranet smidighet eller integritet; (3) inriktning på elektrostatiska eller van der Waals interaktioner mellan viruspartiklar och värdcellyta. (4) inducera fysiska förändringar av virionerna såsom partikel brott eller aggregering; (5) bindning till virala glykoproteiner eller kapsid proteiner och förhindra deras funktioner eller kon Formations förändringar; (6) blockering av fusions associerade mekanismer. och (7) förhindra frisättning av viral genomet inuti värdcellen. De analyser som beskrivs i denna rapport kan därför bidra till att peka på de ovan listade tänkbara handlingssätten som kan verifieras ytterligare genom ytterligare experiment. Slutligen, den "molekylära docknings analys" som beskrivs här är avgörande för att förutsäga potentiella interaktions regioner mellan läkemedels föreningarna och viruspartiklarna, och som sådan kan hjälpa till att identifiera kandidat virus kapsid eller glykoproteinbindemedel och den riktade rester på viruspartiklarna. Men dessa förutsägelser är beroende av dockningsprogram varan, och upplösning och noggrannhet av viral protein kristallstrukturer. Det är viktigt att notera att den valfria slutna docknings metoden i steg 5.3.2 lades till eftersom ofta vid användning av virala strukturella proteiner som "receptor molekyl", kan ligand möjligen binda till regioner som normalt inte är åtkomliga eller exponerade på ytan ( t. ex. under ytan av spjälkat virus kapsid som vetter mot insidan av spjälkat virus, transmembranområden av kuvert glykoproteiner, etc.). Begränsa sökrutan tillåter endast tillgängliga regioner i viral protein som ska riktas och regler ut alla orealistiska interaktioner. Molekylär dockning är beroende av kristalliserade strukturer, men de senaste framstegen inom homologi modellering har möjliggjort analys av icke-kristalliserade strukturer genom att montera sin aminosyra sekvens på en nära besläktad kristalliserad struktur15. Detta har gjort det möjligt att analysera fler strukturer och den information som erhållits kan vara användbar för ytterligare studier, inklusive mutationella analyser som kan hjälpa till att validera de förväntade interaktionerna.
Sammanfattningsvis, de analyser och protokoll som beskrivs i denna rapport är särskilt tillgodoses för att identifiera kandidat antivirala medel som riktar viral inresa, och ge information om vilket steg i viral Entry process test agent mål till, om de interagera med gratis viruspartiklar, och förutsäga möjliga läkemedelsinteraktioner webbplatser på virionerna. Dessa typer av analyser kan upprepas på andra icke-höljeförsedda virus eller anpassas till höljeförsedda virus som en metod för screening av antivirala läkemedel föreningar för eventuella hämmare av viral inträde. Att använda en sådan mekaniseringsindriven metod för att identifiera antivirala kandidater kan bidra till att påskynda läkemedelsutvecklingsprocessen och utvidga omfattningen av antivirala Therapeutics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Dr Joshua Beckham vid University of Texas i Austin för teknisk support med molekylär dockning. Denna studie stöddes delvis av finansiering från Taiwans vetenskaps-och teknik ministerium (MOST107-2320-B-037-002 till C.-J.L. och L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 och MOST107-2320-B-038-034-MY3 nätters till L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
- Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
- Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
- Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
- Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
- Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
- Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
- Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).
- Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
- Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
- Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).
