Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

מורנה הנדנדקטומיה מודל של קוליטיס כרונית הקשורים סרטן המעי הגס על ידי לוקליזציה מדויקת של תיקון Caecal

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/59921

Summary

הפרוטוקול המוצג מתאר הסרה כירורגית נתיישב של התוספתן (טלאי caecal) בעכבר ואחריו אינדוקציה של מחלת המעי הגס מחלות הקיבה הקשורים סרטן. המודל להסרת התוספתן של murine מאפשר חקירה של התפקיד הביולוגי של התוספתן בפתוגנזה של מחלת העיכול האנושית.

Abstract

התוספתן האנושי היה מעורב לאחרונה לשחק תפקידים ביולוגיים חשובים בפתוגנזה של מחלות מורכבות שונות, כגון סרטן המעי הגס, מחלות מעי דלקתיות, מחלת פרקינסון. כדי ללמוד את התפקוד של הנספח, מודל מושפע מחלת התוספתן הקשורים murine הוקמה והפרוטוקול צעד אחר צעד שלה מתואר כאן. דו ח זה מציג פרוטוקול נתיישב להסרת תיקון caecal בעכברים ואחריו אינדוקציה כימית של סרטן המעי הגס כרונית הקשורים באמצעות שילוב של דטרן סולפט נתרן (DSS) ו האזובתאן (aom). IgA התאים הספציפיים ריכוז IgA הופחת באופן משמעותי עם הסרת התיקון caecal בזכר C57BL/6 עכברים לעומת אלה בקבוצה המזויף. במקביל ניהול 2% DSS ו AOM הביא כמעט 80% עכברים הישרדות הן התחזות ו לנדקטומיה קבוצות ללא ירידה משמעותית במשקל הגוף. תוצאות היסטולוגית אישר דלקת חוקן ודרגות שונות של אדנוקרצינומה. מודל זה יכול לשמש למחקר של התפקיד הפונקציונלי של הנספח בשמירה על המעיים microbiota המעי הפתוגנזה של הבטן קוליטיס וממאירות, כמו גם עבור פיתוח פוטנציאלי של תרופות לפילוח טיפולים.

Introduction

ניתוח התוספתן הקליני הוא הליך כירורגי סטנדרטי מעורבים הסרת התוספתן בעיקר בשל דלקת (למשל, התוספתן)1,2,3. עם זאת, הפונקציה הביולוגית של התוספתן האנושי תוספתן נשאר שנוי במחלוקת4,5,6. התוספתן נחשב כשריד שריד הקרנת מתוך המעי הגס במעיים גדולים. עד לאחרונה, מחקרים אבולוציוניים, אימונולוגיים, מורפולוגיים ומיקרוביולוגית הציעו כי הנספח עשוי להחזיק בפונקציות שונות. תפקידים אלה כוללים את הייצור של החיסוני (g., IgA ו IgG), מגוון של תאים B ו-T תאים קריטיים עבור תגובות החיסונית אדפטיבית בתוך רקמות הלימפה הקשורות המעיים (GALTs), ואת חידוש של המעי הגס עם microsal מיקרוביוטים מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , מיכל בן 10 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , . שתיים עשרה

מחקרים אפידמיולוגיים קליני של חולים עם ניתוח להסרת תוספתן מראש או חריפה גם חשף את תפקידה הפוטנציאלי בפתוגנזה של מחלות האדם, כגון מחלת המעי הגס (IBD), סרטן המעי הגס, ולא מערכת העיכול הפרעות (למשל, מחלת פרקינסון ומחלות לב וכלי דם)13,14,15,16,17,18. לדוגמה, אוכלוסיה אסיאתית גדולה מחקר עם 75,979 לאחרונה הראו הקשר משמעותי בין התוספתן והתפתחות הבאים של סרטן המעי הגס, אחד ממאירות הנפוצות ביותר עם שכיחות גבוהה ו תמותה14,19. בהתאם לכך, הקמת מודל מתאים להסרת תוספתן בעלי חיים הדומה לאדם יסייע לחקור את התפקודים הביולוגיים ואת המנגנונים המולקולריים של הנספח בפתוגנזה המחלה.

יונקים רבים מחזיקים בנספח או בעוגב דומה, כולל פרימטים, לאגמורים (למשל, ארנבים), כמה מכרסמים וחיות כיס20. עבור בעלי חיים קטנים ונפוצים במעבדה, הארנב בעל נספח תוספתן מורפולוגית הדומה לאדם21,22, אבל גולט בארנב הוא גדול מאוד לעומת זה בבני אדם, מאז רוב רקמות הלימפה נמצאים גם הטלאים של Peyer ממוקם במעיים קטנים וגדולים21. בנוסף, הארנב מראה מבנה פוליקולרית הלימפה שונים, התפלגות תא T, וצפיפות חיסוני האדם, מה שהופך את הלמידה של הנספחים שלהם הולם21.

עכברים הם המודל החי הנפוץ ביותר כדי ללמוד פתופסיולוגיה האדם ולבדוק את הטיפול הקיימים והחדשניים שונים23,24,25. האשכול הלימפה הגדול הלבן בקודקוד caecum בעכברים, המכונה טלאי caecum, הוא חשב לבצע פונקציות דומה נספח האדם26,27,28. עדיין, זה כמעט קשה להפריד את התיקון caecal מן caecal בעכברים. עד כה, הליכים כירורגי נפוצות לגרימת דלקת התוספתן במודל העכבר כרוך חתך גדול יחסית (למשל, 1 – 2 ס מ) דרך הקיר הבטן כדי לקבל גישה caecum כולו (שולחן משלים 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

להלן, כדי ליצור מודל להסרת תוספתן הקשורים למחלת העיכול, דו ח זה מציג פרוטוקול ניתוח להסרת התיקון caecal בעכברים. זה ואחריו המינהל המשולב של הסוכן הגנומי AOM ו-pro-דלקתיות סוכן DSS עבור אינדוקציה של סרטן המעי הגס הקשורים בדומה לזה שנראה אצל בני אדם. Ibd הוכח להיות גורם סיכון של סרטן המעי37,38. השילוב של aom/DSS-המושרה קוליטיס כרונית סרטן המעי הגס הקשורים כבר היטב, והקוראים יכולים להפנות אל מנופרט אל, ואת הפרטים על הליכים מפורטים39,40. זה מודל הנדנדקטומיה מהיר ומהירה להסרת התוספתן ניתן להשתמש כדי ללמוד נספח-מאופנן דלקת המעי הגס microbiota קולון, במיוחד בפיתוח והתקדמות של סרטן IBD ו המעי הגס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של שיאן Jiaotong אוניברסיטת (No. XJTULAC2019-1023).

1. הנדקטומיה של עכברים

  1. בית 8 – 10-שבוע בן C57BL/6 עכברים גברים בסביבה מוסמכת מוסמך הפתוגן חינם (SPF) למשך שבוע אחד לפני הניתוח.
  2. להכין את הכלים הבאים סטרילי כירורגי: זוג אחד של מיקרו מספריים, זוג אחד של מיקרו מלקחיים, שני גדלים (4-0 ו 8-0) של התפרים נספג ללא ספיגה, עט קרישת חשמלי עם מחזיק מחט, 75% אלכוהול רפואי, שטיפת יוד מבוססי ( לדוגמה, entoiodine), וחבילה של מטליות כותנה סטרילי.
  3. מילוי מזרק 10 מ ל עם הקדם מחומם 0.9% מלוחים פיזיולוגיים עבור סומק הבטן ומחות במהלך הניתוח.
  4. הintraperitoneally (כיתה) עם 1% נתרן פנטוברביטל במינון של 100 מ"ג/ק"ג. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לרפלקסים פדלים.
    הערה: מנת הרדמה אחת ניתנת להבטחת אפקט הרגעה מלא בעכבר. תחת הנסיבות של נהלים קצרים, 50 mg/kg של נתרן פנטוברביטל כותר עשוי להספיק.
  5. גלח בעדינות את שיער הבטן בעזרת מכונת גילוח חשמלית.
  6. הנח את העכבר על משטח החימום כדי למנוע היפותרמיה.
  7. לאבטח את העכבר על הפלטפורמה במצב פרקדן על ידי הצבת ארבע רצועות של דבק רפואי דבק על פני הגפיים כדי למנוע את התנועה הפוסט במהלך הניתוח.
  8. גע בעדינות בכל הבטן כדי למצוא תחושה של בליטה.
    הערה: ברוב המקרים, תחושת הגבשושיות מצביעה תמיד על המיקום המדויק של הקאקיום. כדי למנוע נזק אפשרי לשאר המעי, זה מראש איתור של caecum לפני חתך הבטן הוא חשוב.
  9. לכסות עם כיסוי סטרילי לחטא את האזור מגולח של הבטן על ידי החלת כירורגי מתחלפים של הפתרון מבוסס יוד ו 75% אלכוהול. חזור על התהליך 2x.
  10. לעשות חתך האורך הנע בין 0.5 – 1.0 ס מ על קו האמצע של הבטן.
  11. על פי המיקום שנקבע מראש caecum, להגיע caecum והחוצה בעדינות (~ 1 ס מ) כדי לזהות את התיקון caecum. השתמש בתמיסה סטרילית, מלחמתית מראש של pH פיזיולוגי כדי לחמם את המעי.
    הערה: טלאי caecal של העכבר הוא חלק caecal ומאופיין על ידי נוכחות של זקיקי האוריק לבן על פני השטח.
  12. כדי למנוע סיבוכים פוטנציאליים של דימום לאחר הניתוח וזיהום, להאריך את כלי הדם מצע של caecum באמצעות 8-0 תפר. מייבשים את הקאום. עם תמיסת מלח סטרילית
  13. סמן את אזור הריתה באמצעות תפר 4-0 עם לולאה פתוחה ליד קודקוד caecum על המעי הגס הקרוב.
    הערה: סימון caecum עם לולאה פתוחה גם מונע דליפה של תוכן caecum מן החתך.
  14. לנתק את התיקון caecal מתחת החיתוך המסומן באמצעות מיקרו מספריים ולמחוק את התוכן caecal שיורית עם משקעי כותנה רפואית. לאחר מכן, לחטא את הגדם של caecum עם יוד מבוסס לשפשף.
  15. לסגור את הגדם עם תפר ריצה באמצעות 8-0 תפר.
  16. הסר בזהירות את הלולאה 4-0 האשכול שימש בעבר לסימון ההסרה על הגדם של caecum.
  17. חטא את התנוחה הסודאני באמצעות שקרצף מבוסס יוד. מייבשים שוב את האתר הכירורגי. עם תמיסת מלח
  18. סגרו את שכבת השרירים עם תפר הריצה באמצעות 8-0 תפר החוט.
  19. סגרו את שכבות העור בעזרת תפרים מקוטע עם חוט תפר 4-0.
  20. לחטא את החתך כירורגי 2x עם יוד מבוסס סקראב, ולאחר מכן להסיר יוד באמצעות 75% אלכוהול רפואי.
  21. בעדינות להפוך את העכבר בחזרה, תת-עורי (ספורטינג ראגה) להזריק 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של בופרנורפין ו 0.4 mL של תמיסת מלח פיזיולוגית ולתת את משענת העכבר על משטח החום עד חזרה לתודעה.
  22. לשים את העכבר בחזרה לכלוב סטרילי ולעקוב הדוק אחר סימנים של כאב 3 ימים לאחר הניתוח כדי להבטיח התאוששות.
    הערה: היישום שלאחר הניתוח של 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין עשוי להיות נחוץ להקלה על הכאב של העכבר הבודד. לאפשר לעכברים להתאושש 7 ימים לאחר הניתוח עבור אינדוקציה נוספת של סרטן המעי הגס הקשורים קוליטיס.

2. אינדוקציה של סרטן המעי הגס כרונית הקשורים עם AOM ו-DSS

הערה: בצע הליך זה 7 ימים לאחר הניתוח.

  1. הכן פתרון מניות AOM על ידי המסת 25 מ"ג של AOM ב 2.5 mL של 0.9% תמיסת מלח סטרילי בריכוז של 10 מ"ג/mL.
    הערה: AOM הוא רגיש לאור.
    1. מ2.5 mL של פתרון מניות AOM מוכן ל 5 מ ל צינורות זכוכית עטופים עם רדיד אלומיניום וחנות ב-20 ° c בכל פעם על השימוש.
    2. הפשרה אחת סדרת מחלקים של aom פעם אחת ולדלל אותו לריכוז של 1 מ"ג/mL עם 0.9% תמיסת מלח סטרילי (יחס 1:10).
      התראה: AOM הוא מסרטן מאוד; לפיכך, בצע את כל הליך ההכנה בתוך מכסה המנוע.
  2. התמוססות 4 גרם של אבקת DSS ב 200 מ ל של מים אוטוקלתיים כדי להכין 2% (w/v) פתרון DSS.
    הערה: הריכוז של DSS עשוי להשתנות בהתאם למתח העכבר, מין, ומחזור אינדוקציה; 3% DSS ניתן להשתמש עבור זנים עכברים אחרים.
  3. במקביל לנהל את הטריים המוכנים AOM/DSS לעכברים. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.
    1. Intraperitoneally להזריק 0.01 mL/g של מוכן טרי בפתרון העבודה AOM עבור כל עכבר ולהחליף את המים אוטוקלבד עם 2% DSS פתרון עבור 5 ימים ad libitum.
      הערה: כל כלוב מכיל חמישה עכברים; באופן קבוע לבדוק את בקבוק שתיית DSS כדי להבטיח שאין מזרז מתרחשת במהלך תקופת הטיפול.
    2. משקל ולעקוב מקרוב כל עכבר כל יום.
      הערה: במהלך הממשל, המתת חסד עם עד 20% ירידה במשקל לעומת המשקל הראשוני או הסימנים של ההתגודדות, הפזילה, ההיפותרמיה ופעילות ירודה.
  4. מספקים בקבוק טרי של מים אוטוקלתיים ביום 6 לאחר הממשל/DSS עד יום 21 (איור 1ב).
    הערה: זהו מחזור אחד שלם המורכב 21 ימים.
  5. חזור על שלבים 2.3 – 2.4 לשני מחזורים נוספים ולהקריב את העכברים ביום 70.

3. הערכה של דלקת במעי הגס והגידול (70 ימים מינהל post-AOM)

  1. להקריב את העכברים על ידי CO2 שאיפת בשיעור מילוי של 10% בחדר המתת החסד ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  2. לקצור את כל המעי הגס ממעל הצומת ileo-קוליק אל פי הטבעת.
  3. לחשוף את הצד לומן על ידי פתיחת longitudinally המעי הגס. חותכים את כל המעי הגס לחתיכות 10 ס מ ארוך לתקן את רקמת המעי הגס 10% פורמלין עבור 72 h עבור המטאוקסילין ו אאוזין (h & E) כתמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקמת מודל להסרת תוספתן

זה מודל מורנדקטומיה המודל של קוליטיס כרונית הקשורים סרטן המעי הגס יכול להיווצר על ידי ביצוע צעדים כירורגיים רציפים האינדוקציה מומחש באיור 1. המקומות התכופים ביותר של caecum הם בתוך השמאל והימין פוסה ואחריו קו האמצע של הבטן (איור 2). השיעור המוצלח של טרום לוקליזציה של caecum לפני חתך הבטן באמצעות שיטת מישוש הוא כמעט 70% (מידע משלים, לוח S2). תהליכי הניתוח להסרת תוספתן מהווים בעיקר שישה צעדים חשובים (איור 3). במהלך ניתוח להסרת תוספתן, חתך באמצע קו קטן ככל 0.5 – 1.0 ס מ אורך הוא קריטי כדי למזער את הטראומה כירורגית (איור 3א). במקרה של דליפה תוך הצפק, ליגטינג כלי mesangial וסגירת הגדם של caecum הם נחוצים, באמצעות תפרים הפעלה במקום הפרשה פשוטה (איור 3B, C, D, E).

הערכה של IgA כמו ביואריקר בעכברים להסרת תוספתן

כדי לאשר את התוספתן, המעי הגדול של העכברים ותוכן צואה נקצרו לאחר ניתוח כדי לקבוע את הרמות של IgA בתאי פלזמה ספציפיים ו הפרשה IgA (sIgA) ריכוזי. העכברים להסרת תוספתן הציגו ירידה משמעותית באחוז של B220-IgA + תאי פלזמה ספציפיים לעומת הקבוצה המזויף (איור 4א, ב). יתר על כן, לעומת המדינה הראשונית שלהם לפני הניתוח, עכברים מזויפים שמרו על הריכוז sIgA לאורך 14 ימים לאחר הניתוח, ואילו קבוצת הנדנדקטומיה הראו הפחתת slgA משמעותית ביום 14 (איור 4ג).

ואלידציה של סרטן המעי הגס הקשורות קוליטיס בעכברים להסרת תוספתן

לעומת 3% DSS, שבו רוב העכברים בקבוצת התוספתן הראו סיבוכים חמורים אובדן משקל הגוף משמעותי (איור 5A), 2% DSS בשילוב עם aom סיפק 80% של שיעור ההישרדות הן בלוף והן בקבוצות התוספתן, עם שינויים סבירים במשקל הגוף (איור 5E). בסוף שלושה מחזורי טיפול, המעי הגדול באורך מלא נקצרו להערכה פתולוגית. בדיקה חזותית וכתמים H & E הראו את גידולים במעי הגס עם דלקת המעי הגס ודרגות שונות של אדנוקרצינומות (טוב-, בינוני-, ו אדנוקרצינומות הבדיל גרוע) בעכברים שטופלו 2% AOM/DSS (איור 6).

Figure 1
איור 1: המחשה סכמטית של הקמת מודל הנדנדקטומיה מורכין של סרטן כרוני קוליטיס הקשורים המעי הגס.
(א) תרשים זרימה של הצעדים הכירורגית העיקריים (שלושת הראשונים הם קריטיים) של ניתוח להסרת תוספתן. (ב) אינדוקציה של סרטן המעי הגס. שבעה ימים לאחר ניתוח התוספתן, AOM ו-DSS היו מנוהלים בו. משקולות עכברים נרשמו בזמנים שונים (משולש אדום). ביום 70 לאחר הניתוח, עכברים הוקרבו, ורקמות המעיים נקצרו לצורך הערכות נוספות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הגדרה מראש של מיקום התיקון caecal בעכברים לפני חיתוך הבטן.
(א) סיכום הסבירות של מציאת מיקום caecum. התמונות האנטומיים של שלוש התנוחות הנפוצות ביותר של caecum ב (ב) נמוך הזכות, (ג) האמצעית, ו (ד) הבטן השמאלית הנמוכה של העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צעדים קריטיים של ניתוח להסרת תוספתן מוריין.
(א) חתך קטן מאורגן 0.5 – 1.0 ס מ; (ב) מוציאה את החלק המדויק של תיקון caecal לאחר מיקום מראש של caecal. (ג) הארכה של כלי קיבול המלווה את caecum. (ד) מסמן את אזור החיתוך של caecum עם תפר 4-0. (ה) סגירת הגדם באמצעות תפרים זורמים באמצעות 8-0 תפר. (ו) סגירת שכבת השרירים עם תפרים מקוטע באמצעות 8-0 תפר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קוונפיקציה של התאים הספציפיים של IgA וצואה סיגא ריכוז לאחר התוספתן.
(א) מגרשים מייצגים עבור תאים מוכתם נגד IgA ו B220 במעי הגדול כולו של עכברים התחזות והתוספתן 1 יום 14 ימים לאחר הניתוח. לימפוציטים ב לאמינה קינתא היו טרי מוכן ומוכתם עם FITC אנטי עכבר IgA, PE נגד עכבר CD45R/B220 לזרימה cy try. מספרים בתוך מגרשים מציינים אחוזים של תאים באזורים המתאימים; (ב) הגדרה כמותית של תאי פלזמה מסוימים של IgA בקבוצות התחזות וניתוח להסרת תוספתן. הנתונים מייצגים ממוצע ± SD; n = 5 – 8 עכברים; * p < 0.05, * * p < 0.01, ו * * * p < 0.001. (ג) הצואה הסיגה ריכוזים לפני ואחרי הניתוח. תוכן צואה נאספו בנקודות זמן ייעודי, ורמות של sIgA נבדקו על ידי אליסה. כל נקודה בצבע מייצגת את אותו העכבר על פני תקופה של 14 ימים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tמזווג, עם p < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מעמד ההישרדות של בעלי חיים של קוליטיס כרונית הקשורים סרטן המעי הגס מודל מורטין הנגרמת על ידי AOM/DSS שילוב לאחר התוספתן.
(א) עקומת ההישרדות השיגה באמצעות 3% DSS עבור האינדוקציה קוליטיס בתוך התחזות וקבוצות להסרת תוספתן. סיבוכים חמורים של צניחה אנאלי (ב) ומורסה הציור הצביעו על נקודת הקצה של בעל החיים (C). (ד) עקומת ההישרדות השיגה באמצעות 2% DSS עבור האינדוקציה קוליטיס בתוך התחזות קבוצות להסרת תוספתן; (ה) לשנות את משקל הגוף הממוצע של עכברים מעל 70 ימים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SD, n = 6 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות של קוליטיס כרונית הקשורים גידולים המעי הגס הנגרמת על ידי טיפול שילוב של 2% DSS ו 10 מ"ג/ק"ג AOM.
צילומים של המעי הגס גזור עם גידולים תחת (א) בדיקה חזותית (ב) מיקרוסקופ מבצע בעלי חיים. H & E צביעת תמונות של רקמות חוקן מראה (ג) דלקת במעי הגס, (ד) היטב-הבדיל אדנוקרצינומה, (ה) אדנוקרצינומה הבדיל במתינות, ו (F) אדנוקרצינומה הבדיל מאוד. חץ שחור מצביע על כיב מוקיבה, ראש חץ שחור מציין אדנוקרצינומה, החץ הלבן מציין נויטרופילים הסתננות בין בלוטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הטבלה המשלים 1: סיכום ספרות של שיטות כירורגי המשמשים התוספתן השראה זנים עכברים נפוץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: מיקומי הcaecum בעכברים לאחר כריתת האונה. איבר חשוף לאחר החתך מציין את האיבר נמצא ישירות במצב מראש ממוקם לאחר לאחר הניתוח. המיקום של caecum מראה את המיקום caecum ביחס לאזור הבטן/caecum מיקום ביחס למעי. נחשף מציין כי caecum היה מתחת לשכבת השרירים של הבטן ומעל חלקים אחרים של המעי. מוטבע מציין כי caecum היה מכוסה על ידי המעי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל להסרת תוספתן מורבית של סרטן המעי הגס הקשורים קוליטיס הושגה באמצעות שלבים כירורגיים עם שיעור הישרדות גבוהה בעכברים. ברוב המקרים, כיוון שהcaecum הוצב תחת קיר הבטן (שולחן משלים 1, הטבלה השלמה 2, ואיור 2), היה קשה לשפוט את מיקומו ללא כריתת אונה. בפרוטוקול כירורגי זה, צעד קל של נגיעה הבליטה הוצגה, והערכה כמותית של מיקום מעי סופק גם כהנחיה כדי להגדיל את הדיוק ללוקליזציה מראש של מעי (איור 2). ניצול של תכונות אנטומיים להסיר את תיקון caecal ממוזער שיבוש חלקים לא מכוונים של המעי, ובכך להקטין את שיעור הסיבוכים הפוטנציאליים של הסרת התוספתן וזיהום של חלל הבטן.

שלושה צעדים קריטיים מעורבים במודל זה. ראשית, בדיקה חזותית ומישוש לפני הניתוח יכול להיות מועיל כדי לקבוע את המיקום הכללי של caecum. למרות העובדה caecum הוא כנראה נוכח באזור כסל השמאלי של הבטן, תיקון caecum בולט מקודקוד caecum הוא לעתים קרובות ניתוק (כלומר, לנוע מסביב או מוטבע) והוא צפוי יותר להימצא מתחת צפק האמצעית ( איור 2). שנית, חתך קטן בשורה האמצעית של הבטן וחשיפה מדויקת של תיקון caecal הוא המועדף. זה בגלל שיש נקודה דקה בשורה האמצעית של הבטן, שבו חיתוך למצב זה עלול להקטין את הפציעה הפוטנציאלית של שכבת השרירים הבטני. בנוסף, כדי למנוע את המעיים על התוספתן, אשר מזיקה לעכברים, חשיפה מדויקת של תיקון caecal ממזער את ההפרעה לא מכוונת של המעי, הפחתת הסיכון של מתרחשות המעיים. יתר על כן, חשיפה מינימלית של חלל הבטן יכול להבטיח כי המעי נשאר מזוהם, חם, לח; אחרת, חשיפה מוגזמת עלולה לגרום לאובדן חום משמעותי וייבוש של רקמות41.

שלישית, חיטוי וסגירה של גדם caecal עם תפרים ריצה במקום הקשר פשוט נחוצים כדי למנוע דימום פוטנציאלי וחיטוי של תוכן caecal של הגדם. רמת בתאי פלזמה ספציפיים IgA ובצואה sIgA במעי גדול של עכברים מופחת באופן משמעותי על ידי ניתוח להסרת תוספתן, הרומז כי תיקון caecal הוא האתר הראשי לייצור של IgA לפחות בתקופה הראשונית33. במעי גדול, siga פונקציה כמו מגן בריאות רירית על ידי ייצוב הקולוניזציה הנורמלית של המיסאל פלורה ו משחק נגד חיידקים פתוגניים42. הסרת התוספתן מפחיתה את הייצור של IgA והיא עלולה לשבש את הומאוסטזיס.

שיעור התמותה הגבוהה וסימנים קליניים של האינדוקציה קוליטיס מוגזמת (כלומר, שרפרף דמים חמור, הצניחה אנאלי, ואת הבטן מורסה43,44) נצפו עכברים שטופלו 3% DSS (איור 5). עם זאת, 2% DSS אינדוקציה לאחר שלושה מחזורים שנגרמו אף אחד מסיבוכים אלה, ואת שיעור ההישרדות נשמר מעל 80%. הדבר מצביע על כך שהשימוש המשולב ב-DSS ו-AOM צריך להיות מאומת, שכן חוסר השלמות של GALTs עשוי, במידה מסוימת, להקטין את הסובלנות של עכברים לשילוב AOM ו-DSS. לימודי תצפית מן הראיות המבוססות על הקליני מצביעים על כך שהנספח משויך באופן מאוד להתפתחות של סרטן המעי הגס ו-14,45,46. עם זאת, התפקודים הביולוגיים והמנגנונים הבסיסיים של הנספח בפתוגנזה של מחלות בטן כרוניות עדיין לא ברורים. נראה כי הנספח משמש כחלק חשוב של הגטים וכמאגר של המעיים כדי להסדיר בריאות או מדינות חולות17,18,31. הקמת המודל להסרת התוספתן מורטין וחסכוני זה יכול לשמש לחקר התפקידים של נספח ב-IBD וסרטן המעי הגס בהקשר של microbiota הומאוסטזיס, מניעת סרטן, וטיפול חיסוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטה המרכזית (G2018KY0302), האוניברסיטה הבסיסית לפיתוח מחקר באוניברסיטת (KT00062), הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81870380), ואת פרס המחקר הקליני של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן Jiaotong בסין (לא. XJTU1AF-2015-029). המחברים מודים ד ר Chengxin Shi עבור הצעות טכניות שלו במהלך השלב הקודם של המחקר של המודל להסרת תוספתן murine, כמו גם הפתולוג ד ר. Xi Liu עבור הערכה של H & E כתמים תוצאות של גידולים קוליטיס המעי הגס. י ביצעה את הפגנת הניתוח, עשתה ניתוח נתונים וכתב את טיוטת כתב היד; J.L., G.L., Z.P., ו Y.M. נטלו חלק בהכנה כירורגית, אוספי רקמות והפקת וידאו; M.Z. ביצע את הזרימה cy try ו-אליסה; Q.W. ו H.X. סיפק את התמיכה הטכנית של יצירת מודל מורטין רלוונטי קלינית; R.X.Z. עיצב את המחקר, הפיקוח על המחקר, וכתב והוא הלחין את כתב היד; י. ס. בחנה את כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azoxymethane(AOM) Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. Appendicitis. , at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
  4. On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. , at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

רפואה סוגיה 150 מודל murine נספח טלאי caecal אנטומיה של מערכת העיכול המעי הגס גידול IgA אזובמתאן הנתרן של דקטרן סולפט IBD
מורנה הנדנדקטומיה מודל של קוליטיס כרונית הקשורים סרטן המעי הגס על ידי לוקליזציה מדויקת של תיקון Caecal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z.,More

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter