Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

نموذج استئصال الزائدة الدودية Murine من التهاب القولون المزمن المرتبطة سرطان القولون والمستقيم عن طريق توطين دقيق من التصحيح Caecal

doi: 10.3791/59921 Published: August 24, 2019

Summary

يصف البروتوكول المعروض إزالة جراحية سهلة للتذييل (تصحيح caecal) في فأر يتبعه تحريض سرطان القولون والمستقيم المرتبط بمرض الأمعاء الالتهابي. هذا النموذج استئصال الزائدة الدودية murine تمكن من التحقيق في الدور البيولوجي للتذييل في مسببات الأمراض من أمراض الجهاز الهضمي البشري.

Abstract

وقد تورط التذييل البشري مؤخرا للعب أدوار بيولوجية هامة في مسببات الأمراض من مختلف الأمراض المعقدة، مثل سرطان القولون والمستقيم، وأمراض الأمعاء الالتهابية، ومرض باركنسون. لدراسة وظيفة التذييل، تم إنشاء نموذج استئصال الزائدة الدودية المورين المرتبطة بأمراض الأمعاء ويرد وصف بروتوكوله خطوة بخطوة هنا. يقدم هذا التقرير بروتوكول سهل لإزالة التصحيح القحيفي في الفئران متبوعاً بالحث الكيميائي لسرطان القولون والمستقيم المزمن المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم باستخدام مزيج من كبريتات الدإكستران الصوديوم (DSS) وأزوكسيميثان (AOM). تم تخفيض الخلايا المحددة IgA وتركيز IgA بشكل كبير عند إزالة التصحيح caecal في الفئران C57BL/6 الذكور مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة الشام. في وقت واحد إدارة 2٪ DSS وAOM أدى إلى ما يقرب من 80٪ بقاء الفئران في كل من مجموعات الشام واستئصال الزائدة الدودية دون فقدان كبير لوزن الجسم. أكدت النتائج النسيجية التهاب القولون ودرجات مختلفة من سرطان الغدة الدرقية. ويمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الدور الوظيفي للتذييل في الحفاظ على الأمعاء المجهرية التوازن ومسببات الأمراض من التهاب القولون الأمعاء والأورام الخبيثة، وكذلك لتطوير محتمل للعلاجات استهداف المخدرات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

استئصال الزائدة الدودية السريرية هو إجراء جراحي قياسي ينطوي على إزالة التذييل في الغالب بسبب التهاب (على سبيل المثال، التهاب الزائدة الدودية)1،2،3. ومع ذلك، فإن الوظيفة البيولوجية للتذييل البشري vermiform لا تزال مثيرة للجدل4،5،6. وقد اعتبر التذييل كبقايا دهليزية إسقاط من cecum في الأمعاء الغليظة. وحتى وقت قريب، أشارت الدراسات التطورية والمناعية والمورفولوجية والميكروبيولوجية إلى أن التذييل قد يكون له وظائف متميزة. وتشمل هذه الأدوار إنتاج الغلوبين المناعي (على سبيل المثال، IgA وIgG)، ومجموعة متنوعة من الخلايا B والخلايا T الحرجة للاستجابات المناعية التكيفية داخل الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأمعاء (GALTs)، وتجديد الأمعاء الغليظة مع ميكروبيوتا كومينسال 6 , 7 , 8 , 9 , 10 سنوات , 11 , 12.

كما كشفت الدراسات الوبائية السريرية للمرضى الذين يعانون من استئصال الزائدة الدودية السابقة أو التهاب الزائدة الدودية الحاد أدوارها المحتملة في مسببات الأمراض البشرية، مثل مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، وسرطان القولون والمستقيم، وغير الجهاز الهضمي اضطرابات (على سبيل المثال، مرض باركنسون وأمراض القلب والأوعية الدموية)13،14،15،16،17،18. على سبيل المثال، أظهرت دراسة أترابية كبيرة للسكان الآسيويين مع 75,979 مريض استئصال الزائدة الدودية مؤخرا وجود ارتباط كبير بين استئصال الزائدة الدودية والتطور اللاحق لسرطان القولون والمستقيم، واحدة من الأورام الخبيثة الأكثر شيوعا مع ارتفاع معدل الإصابة و 14،19. وبناء على ذلك، فإن إنشاء نموذج مناسب لاستئصال الزائدة الدودية الحيوانية يشبه الإنسان سيكون مفيدا ً في التحقيق في الوظائف البيولوجية والآليات الجزيئية للتذييل في مسببات الأمراض.

تمتلك العديد من الثدييات جهازًا يشبه التذييل أو التذييل، بما في ذلك الرئيسيات، واللاغومورفي (مثل الأرانب)، وبعض القوارض، وmarsupials20. للالحيوانات المختبرية الصغيرة والشائعة الاستخدام، والأرنب تمتلك التذييل vermiform تشبه بشكل شكلي الإنسان21،22، ولكن GALT في الأرنب كبيرة للغاية بالمقارنة مع ذلك في البشر ، منذ غالبية كما توجد الأنسجة اللمفاوية في بقع باير الموجودة في كل من الأمعاء الصغيرة والغليظة21. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الأرنب بنية مختلفة من الحويصلات اللمفاوية، وتوزيع الخلايا T، وكثافة الغلوبولين المناعي من الإنسان، مما يجعل دراسة التذييلات غير مناسبة21.

الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر استخداما لدراسة الفيزيولوجيا المرضية البشرية واختبار مختلف الثيرابويتكس الموجودة والجديدة23،24،25. ويعتقد أن كتلة لمفية بيضاء واحدة كبيرة في قمة caecum في الفئران، والمعروفة باسم التصحيح caecal، لأداء وظائف مماثلة للتذييل البشري26،27،28. ومع ذلك، فإنه من الصعب عمليا لفصل التصحيح caecal من caecum في الفئران. حتى الآن، الإجراءات الجراحية الشائعة لتحريض التهاب الزائدة الدودية في نموذج الماوس تنطوي على شق كبير نسبيا (على سبيل المثال، 1-2 سم) من خلال جدار البطن للوصول إلى caecum كله (الجدولالتكميلي1)29، 30،31،32،33،34،35،36.

هنا، لتوليد نموذج استئصال الزائدة الدودية المرتبطة بأمراض الجهاز الهضمي، يقدم هذا التقرير بروتوكول الجراحية سهل لإزالة التصحيح caecal في الفئران. ويلي ذلك الإدارة المشتركة للعامل السامة للجينوية AOM والوكيل المؤيد للالتهابات DSS للحث على سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون والقولون والمستقيم مماثلة لتلك التي ينظر إليها في البشر. وقد ثبت أن IBD عامل خطر الإصابة بسرطان الأمعاء37،38. وقد تم تأسيس مزيج من AOM / DSS الناجمة عن سرطان القولون والمستقيم المزمن المرتبطة التهاب القولون والمستقيم ، ويمكن للقراء الرجوع إلى Neufert وآخرون ، وThaker وآخرون للإجراءات التفصيلية39،40. يمكن استخدام هذا النموذج القابل للتكرار والسريع لاستئصال الزائدة الدودية لدراسة التهاب الأمعاء المُعدَّل بالتذييل وميكروبيوتا القولون، وخاصة في تطور وتطور سرطان القولون والمستقيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة شيان جياوتونغ (رقم XJTULAC2019-1023).

1- استئصال الزائدة الدودية على الفئران

  1. منزل 8-10 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور في بيئة معتمدة محددة مسببات الأمراض (SPF) لمدة أسبوع واحد قبل الجراحة.
  2. إعداد الأدوات الجراحية العقيمة التالية: زوج واحد من مقص صغير، زوج واحد من ملقط الصغيرة، حجمين (4-0 و 8-0) من الغرز المعقمة غير القابلة للامتصاص، وقلم تخثر كهربائي مع حامل إبرة، 75٪ الكحول الطبية، فرك اليود القائم ( على سبيل المثال، الإنتويودين)، ومجموعة من مسحات القطن المعقمة.
  3. ملء حقنة 10 مل مع قبل تسخينها 0.9٪ المالحة الفسيولوجية لتدفق البطن والترطيب أثناء الجراحة.
  4. التخدير الماوس غير الصيام داخل اقابي (i.p.) مع 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 100 ملغ / كغ. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لردود الفعل دواسة.
    ملاحظة: يتم إعطاء جرعة مخدرة واحدة لضمان تأثير مهدئ كامل في الماوس. وفي ظل ظروف الإجراءات القصيرة، قد يكون 50 ملغم/كغم من البنتوباربيتال الصوديوم كافياً.
  5. حلاقة شعر البطن بلطف مع حلاقة كهربائية.
  6. وضع الماوس على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
  7. تأمين الماوس على منصة في موقف supine عن طريق وضع أربعة شرائط من شريط لاصق الطبية عبر الأطراف لمنع الحركة الوضعية أثناء الجراحة.
  8. لمس بلطف البطن كله للعثور على الشعور عثرة.
    ملاحظة: في معظم الحالات، يشير الشعور بعثرة دائماً إلى الموضع الدقيق للcaecum. لتجنب الأضرار المحتملة لبقية الأمعاء، هذا تحديد موقع مسبق من caecum قبل شق البطن مهم.
  9. تغطية مع الستائر المعقمة وتطهير منطقة حلق البطن عن طريق تطبيق الدعك الجراحية بالتناوب من الحل القائم على اليود والكحول 75٪. كرر العملية 2x.
  10. قم بعمل شق طولي يتراوح بين 0.5-1.0 سم عند خط الوسط من البطن.
  11. وفقا للموقع المحدد مسبقا من caecum، والوصول إلى caecum والخارجية بلطف (~ 1 سم) لتحديد التصحيح caecal. استخدم محلول ملحي معقم ومسبق الإحماء من درجة الحموضة الفسيولوجية لترطيب الأمعاء.
    ملاحظة: التصحيح caecal من الماوس هو جزء من caecum ويتميز بوجود بصيلات بيضاء فارغة على السطح.
  12. لمنع المضاعفات المحتملة للنزيف بعد العملية الجراحية والعدوى، يُرسل الأوعية الدموية في الcaecum باستخدام 8-0 خياطه. يرطب الككوم مع محلول ملحي معقم.
  13. وضع علامة على منطقة الاستئصال باستخدام خياطة 4-0 مع حلقة مفتوحة بالقرب من قمة caecum في القولون القريب.
    ملاحظة: وضع علامة على caecum مع حلقة مفتوحة يمنع أيضا تسرب محتوى caecal من القطع.
  14. قطع التصحيح caecal تحت استئصال ملحوظ باستخدام مقص صغير والقضاء على المحتوى caecal المتبقية مع مسحات القطن الطبية. ثم، تطهير الجذع من caecum مع فرك اليود القائم.
  15. إغلاق الجذع مع خياطة قيد التشغيل باستخدام 8-0 خياطه.
  16. إزالة بعناية حلقة الموضوع 4-0 المستخدمة سابقاً لوضع علامة على استئصال في الجذع من caecum.
  17. تعقيم الموقف خياطة مع فرك اليود القائم. إعادة ترطيب الموقع الجراحي مع المالحة مرة أخرى.
  18. أغلق طبقة العضلات باستخدام خياطة قيد التشغيل باستخدام 8-0 خياطة الموضوع.
  19. أغلق طبقات الجلد باستخدام الغرز المتقطعة مع خيط خياطة 4-0.
  20. تطهير قطع الجراحية 2X مع فرك اليود القائم، ثم إزالة اليود باستخدام الكحول الطبية 75٪.
  21. الوجه بلطف الماوس مرة أخرى، تحت الجلد (s.c.) حقن 0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم من البوبرينورفين و 0.4 مل من المالحة الفسيولوجية والسماح للماوس بقية على وسادة الحرارة حتى يعود إلى الوعي.
  22. وضع الماوس مرة أخرى إلى القفص المعقم ومراقبة عن كثب لعلامات الألم لمدة 3 أيام بعد الجراحة لضمان الشفاء.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تطبيق ما بعد الجراحة من 0.05 ملغ / كغ البوبرينورفين لتخفيف الألم من الماوس الفردية. السماح للفئران للتعافي لمدة 7 أيام بعد الجراحة لمزيد من الحث على سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم.

2. تحريض سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم المزمن مع AOM و DSS

ملاحظة: تنفيذ هذا الإجراء 7 أيام بعد استئصال الزائدة الدودية.

  1. إعداد محلول الأسهم AOM عن طريق حل 25 ملغ من AOM في 2.5 مل من 0.9٪ محلول ملحي معقمة بتركيز 10 ملغ / مل.
    ملاحظة: AOM حساسة للضوء.
    1. Aliquot 2.5 مل من إعداد AOM حل الأسهم في أنابيب زجاجية 5 مل ملفوفة مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية في كل مرة عند الاستخدام.
    2. إذابة aliquot واحد من AOM مرة واحدة والتخفيف من ذلك إلى تركيز 1 ملغ / مل مع 0.9٪ محلول ملحي معقمة (نسبة 1: 10).
      تحذير: AOM مسرطنللغاية; وبالتالي، قم بإجراء التحضير بأكمله في غطاء الدخان.
  2. حل 4 غرام من مسحوق DSS في 200 مل من المياه الأوتوكلاف لإعداد 2٪ (ث / الخامس) محلول DSS.
    ملاحظة: قد يختلف تركيز DSS تبعاً لإجهاد الماوس والجنس ودورة الحث؛ يمكن استخدام 3% DSS لسلالات الفئران الأخرى.
  3. في نفس الوقت إدارة AOM / DSS أعدت حديثا إلى الفئران. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.
    1. حقن داخل الصفاق 0.01 مل / ز من حل العمل AOM أعدت حديثا لكل ماوس واستبدال المياه الأوتوكلاف مع 2٪ DSS الحل لمدة 5 أيام ad libitum.
      ملاحظة: يحتوي كل قفص على خمسة فئران; فحص بانتظام زجاجة الشرب DSS لضمان عدم حدوث أي تسارع خلال فترة العلاج.
    2. الوزن ومراقبة عن كثب كل ماوس كل يوم.
      ملاحظة: خلال الإدارة، قتل الفئران مع ما يصل إلى 20٪ فقدان الوزن مقارنة مع وزنه الأولي أو علامات التجمع، الحول، انخفاض حرارة الجسم، وضعف النشاط.
  4. توفير زجاجة جديدة من المياه الأوتوكلاف في اليوم 6 بعد AOM / DSS الإدارة حتى اليوم 21 (الشكل1B).
    ملاحظة: هذه دورة كاملة واحدة تتألف من 21 يوما.
  5. كرر الخطوات 2.3-2.4 لدورتين إضافيتين والتضحية الفئران في اليوم 70.

3. تقييم التهاب القولون والورم (70 يوما بعد إدارة AOM)

  1. التضحية الفئران عن طريق استنشاق CO2 بمعدل ملء 10٪ في غرفة القتل الرحيم تليها خلع عنق الرحم.
  2. حصاد القولون بأكمله من فوق تقاطع المغص الليو إلى فتحة الشرج.
  3. كشف جانب التجويف عن طريق فتح القولون طوليا. قطع القولون كله إلى قطع طويلة 10 سم وإصلاح أنسجة القولون في 10٪ فورفورمين لمدة 72 ساعة لهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إنشاء نموذج استئصال الزائدة الدودية murine

يمكن إنشاء نموذج استئصال الزائدة الدودية هذا من التهاب القولون المزمن المرتبط بسرطان القولون والمستقيم باتباع الخطوات الجراحية والتعريفية المتسلسلة كما هو موضح في الشكل 1. المواقف الأكثر شيوعا من caecum هي في اليسار واليمين الفوسا الحرقفيتليهاالخط الأوسط من البطن (الشكل 2). معدل النجاح في ما قبل توطين caecum قبل شق البطن باستخدام طريقة الجس هو ما يقرب من 70٪ (معلوماتتكميلية، الجدول S2). وتتألف إجراءات استئصال الزائدة الدوديةأساسا من ست خطوات هامة (الشكل 3). خلال جراحة استئصال الزائدة الدودية، شق خط الوسط صغيرة مثل 0.5-1.0 سم في الطول أمر بالغ الأهمية للحد من الصدمة الجراحية (الشكل3A). في حالة التسرب داخل اقابية، ربط السفن mesangial وإغلاق الجذع من caecum ضرورية، وذلك باستخدام الغرز تشغيل بدلا من الربط بسيطة (الشكل3B، C، D،E).

تقييم IgA كعلامة حيوية في الفئران استئصال الزائدة الدودية

لتأكيد استئصال الزائدة الدودية، تم حصاد الأمعاء الغليظة من الفئران ومحتوى البراز بعد الجراحة لتحديد مستويات خلايا البلازما الخاصة IgA وتركيزات IgA (sIgA) السرية. وأظهرت الفئران استئصال الزائدة الدودية انخفاضا كبيرا في النسبة المئوية لخلايا البلازما محددة B220-IgA + مقارنة مع مجموعة الشام (الشكل4ألف،باء). وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع حالتها الأولية الخاصة قبل الجراحة، حافظت الفئران الشام على تركيز sIgA البراز على مدى 14 يوما بعد الجراحة، في حين أظهرت مجموعة استئصال الزائدة الدودية انخفاضا كبيرا slgA في اليوم 14 (الشكل4C).

التحقق من صحة سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم في الفئران استئصال الزائدة الدودية

بالمقارنة مع 3٪ DSS، والتي أظهرت معظم الفئران في مجموعة استئصال الزائدة الدودية مضاعفات شديدة وفقدان كبير لوزن الجسم (الشكل5A)،2٪ DSS في تركيبة مع AOM قدمت 80٪ من معدل البقاء على قيد الحياة في كل من الشام واستئصال الزائدة الدودية، مع تغييرات معقولة في وزن الجسم (الشكل5E). في نهاية ثلاث دورات من العلاج ، تم حصاد الأمعاء الغليظة كاملة الطول للتقييم المرضي. أظهر الفحص البصري وتلطيخ H&E الأورام القولونية مع التهاب القولون ودرجات مختلفة من سرطان الغدة الدرقية (سرطان الغدة الدرقية بشكل جيد ومعتدل وضعيفالتفريق) في الفئران المعالجة مع 2٪ AOM / DSS (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: توضيح تخطيطي لإنشاء نموذج استئصال الزائدة الدودية من المورين لسرطان القولون والمستقيم المزمن المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم.
(أ) مخطط تدفق يُخطى الخطوات الجراحية الرئيسية (الثلاثة الأولى حرجة) من إجراء استئصال الزائدة الدودية. (ب) تحريض سرطان القولون والمستقيم. بعد سبعة أيام من استئصال الزائدة الدودية، تم إعطاء AOM وDSS في وقت واحد. تم تسجيل أوزان الفئران في أوقات مختلفة (المثلث الأحمر). في اليوم 70 بعد الجراحة، تم التضحية الفئران، وتم حصاد الأنسجة المعوية لمزيد من التقييمات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحديد المسبق لموقع التصحيح القاهي في الفئران قبل شق البطن.
(أ) ملخص لاحتمال العثور على موقف caecum. الصور التشريحية من ثلاثة مواقف الأكثر شيوعا منcaecum في ( B) انخفاض اليمين ، (C) الأوسط ، و (د) انخفاض البطن الأيسر للماوس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الخطوات الحرجة لاستئصال الزائدة الدودية من المورين.
(أ) شق صغير مرتب 0.5-1.0 سم؛ (B) سحب الجزء الدقيق من التصحيح caecal بعد ما قبل الموقف من caecum. (C) ربط السفن mesenteric المرافقة للcaecum. (د) بمناسبة منطقة القطع من caecum مع خياطة 4-0. (E) إغلاق الجذع مع الغرز تشغيل باستخدام 8-0 خياطه. (F) إغلاق طبقة العضلات مع الغرز توقف باستخدام 8-0 خياطه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التحديد الكمي لخلايا البلازما الخاصة بـ IgA وتركيز sIgA البرازي بعد استئصال الزائدة الدودية.
(أ) قطع نقطة تمثيلية للخلايا الملطخة بمكافحة IgA و B220 في الأمعاء الغليظة الكاملة من الفئران الشام ية واستئصال الزائدة الدودية 1 يوم و 14 يوما بعد الجراحة. تم إعداد الخلايا الليمفاوية في بروبريا لامينا طازجة وملطخة مع IGA المضادة للماوس FITC، PE المضادة للماوس CD45R/B220 لتدفق قياس الخلايا. وتشير الأرقام داخل قطع الأراضي إلى النسب المئوية للخلايا في المناطق المعنية؛ (ب) التحديد الكمي لخلايا البلازما المحددة IgA في مجموعات وهمية واستئصال الزائدة الدودية. البيانات تمثل يعني ± SD؛ n = 5-8 فئران؛ *p < 0.05, **p < 0.01, و ***p < 0.001. (ج) تركيزات البراز sIgA قبل وبعد الجراحة. تم جمع محتويات البراز في نقاط زمنية معينة، وتم اختبار مستويات sIgA من قبل ELISA. تمثل كل نقطة لون نفس الماوس على مدى فترة 14 يومًا. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t-غير مُزوّر، مع اعتبار p < 0.05 مهمًا إحصائيًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: حالة بقاء الحيوان على قيد الحياة من سرطان القولون والمستقيم المزمن المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم نموذج المورين الناجم عن الجمع بين AOM/DSS بعد استئصال الزائدة الدودية.
(أ) منحنى البقاء على قيد الحياة التي تم الحصول عليها باستخدام 3٪ DSS لتحريض التهاب القولون في مجموعات الشام واستئصال الزائدة الدودية. المضاعفات الشديدة للتدلي الشرجي (B) والخراج الجداري تشير إلى نقطة النهاية للحيواني (C). (د) منحنى البقاء على قيد الحياة التي تم الحصول عليها باستخدام 2٪ DSS لتحريض التهاب القولون في مجموعات الشام واستئصال الزائدة الدودية؛ (E) متوسط تغير وزن الجسم من الفئران على مدى 70 يوما. البيانات تمثل يعني ± SD، ن = 6 الفئران. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: صور أورام القولون والمستقيم المزمنة المرتبطة بالتهاب القولون والمستقيم الناجمة عن الجمع بين العلاج من 2٪ DSS و 10 ملغ / كغ AOM.
صور القولون تشريح مع الأورام تحت (أ) التفتيش البصري و (ب) مجهر عملية الحيوان. H & E تلطيخ الصور من الأنسجة القولونية تظهر (C) التهاب القولون ، (د ) المتمايزة جيدا الغدة الدرقية ، (E ) المتمايزة بشكل معتدل سرطان الغدة الدرقية ، و (و) ) مرض سرطان الغدة المتمايزة للغاية. السهم الأسود يشير إلى قرحة الغشاء المخاطي، رأس السهم الأسود يشير إلى سرطان الغدة الدرقية، والسهم الأبيض يشير إلى تسلل العدلات بين الغدد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: ملخص أدبي للأساليب الجراحية المستخدمة في تحريض التهاب الزائدة الدودية في سلالات الفئران الشائعة الاستخدام. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: مواقع الcaecum في الفئران بعد استئصال البطن. يشير الجهاز المكشوف بعد الشق إلى العضو الموجود مباشرة في الوضع السابق بعد استئصال البطن. يظهر موضع الcaecum موقع caecum نسبة إلى منطقة البطن / موقف caecum نسبة إلى الأمعاء. يتعرض يشير إلى أن caecum كان تحت الطبقة العضلية من البطن وفوق أجزاء أخرى من الأمعاء. جزءا لا يتجزأ من يشير إلى أن caecum كانت مغطاة من قبل الأمعاء. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم الحصول على نموذج استئصال الزائدة الدودية murine من سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون والمستقيم المرتبط ة بالتهاب القولون والأمعاء باستخدام الخطوات الجراحية مع ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة في الفئران. وفي معظم الحالات، بما أن الcaecum كان متمركزًا تحت جدار البطن (الجدولالتكميلي 1، الجدول التكميلي2، والشكل 2)،كان من الصعب الحكم مسبقاً على موقعه دون استئصال البطن. في هذا البروتوكول الجراحي، تم إدخال خطوة سهلة من لمس عثرة، كما تم توفير التقييم الكمي لموقع cecumكتوجيه لزيادة الدقة قبل توطين cecum (الشكل 2). استغلال الميزات التشريحية لإزالة التصحيح caecal يقلل من تعطيل أجزاء غير مقصودة من الأمعاء، وبالتالي تقليل معدل المضاعفات المحتملة لاستئصال الزائدة الدودية والعدوى في تجويف البطن.

وتشارك في هذا النموذج ثلاث خطوات حاسمة. أولا، الفحص البصري والجس قبل استئصال البطن يمكن أن تكون مفيدة لتحديد الموقع العام للcaecum. على الرغم من حقيقة أن caecum هو على الأرجح موجودة في المنطقة الحرقفية اليسرى من البطن، والتصحيح caecal جاحظ من قمة caecum غالبا ما تكون منفصلة (أي، التحرك أو جزءا لا يتجزأ) وأكثر احتمالا أن تكون موجودة تحت العبامع الأوسط ( الشكل2). ثانيا، يفضل شق صغير في الخط الأوسط من البطن والتعرض الدقيق للرقعة caecal. ويرجع ذلك إلى وجود بقعة رقيقة في الخط الأوسط من البطن، والتي قطع في هذا الموقف قد يقلل من الإصابة المحتملة للطبقة العضلية البطن. وبالإضافة إلى ذلك ، لتجنب الفرج عند استئصال الزائدة الدودية ، وهو ما يضر بالفئران ، يقلل التعرض الدقيق للرقعة الكهالة من اضطراب الأمعاء غير المقصود ، مما يقلل من خطر حدوث الفرج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يضمن الحد الأدنى من التعرض لتجويف البطن أن تظل الأمعاء غير ملوثة ودافئة ورطبة. خلاف ذلك، التعرض المفرط قد يسبب فقدان الحرارة كبيرة وتجفيف الأنسجة41.

ثالثا، التطهير وإغلاق الجذع caecal مع الغرز تشغيل بدلا من ربط بسيط ضرورية لمنع النزيف المحتمل ة وتطهير محتويات caecal من الجذع. يتم تخفيض مستوى خلايا البلازما الخاصة IgA والبراز sIgA في الأمعاء الغليظة من الفئران بشكل كبير عن طريق استئصال الزائدة الدودية ، مما يشير إلى أن التصحيح caecal هو الموقع الرئيسي لإنتاج IgA على الأقل في الفترة الأولية33. في الأمعاء الغليظة، وظيفة sIgA كمدافع صحي الغشاء المخاطي من خلال تثبيت الاستعمار الطبيعي للنباتات commensal والتصدي للميكروبات المسببة للأمراض42. إزالة التذييل يقلل من إنتاج IgA ويمكن أن تعطل التوازن المخاطي.

لوحظ ارتفاع معدل الوفيات والعلامات السريرية للتحريض المفرط التهاب القولون (أي البراز الدموي الشديد، هبوط الشرج، وخراج البطن43،44)في الفئران المعالجة مع 3٪ DSS (الشكل5). ومع ذلك، 2٪ DSS التعريفي بعد ثلاث دورات تسبب أيا من هذه المضاعفات، والحفاظ على معدل البقاء على قيد الحياة فوق 80٪. وهذا يشير إلى أنه ينبغي التحقق من الاستخدام المشترك لـ DSS وAOM، لأن عدم سلامة GALTs قد يقلل، إلى حد ما، من تحمل الفئران إلى تركيبة AOM وDSS. وتشير الدراسات الملاحظة من الأدلة السريرية إلى أن التذييل يرتبط ارتباطا قويا مع تطور سرطان القولون والمستقيم14،45،46. ومع ذلك، لا تزال الوظائف البيولوجية والآليات الأساسية للتذييل في مسببات الأمراض المزمنة في الأمعاء غير واضحة. ويبدو أن التذييل بمثابة جزء مهم من GALTs وكخزان للنباتات commensal الأمعاء لتنظيم الصحة أو الدول المريضة17،18،31. يمكن استخدام إنشاء هذا النموذج القابل ة للتكرار والفعالة من حيث التكلفة استئصال الزائدة الدودية لدراسة أدوار التذييل في سرطان القولون والمستقيم في سياق التوازن المجهري، والوقاية من السرطان، والعلاج المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل جزئيا صناديق البحوث الأساسية للجامعة المركزية (G2018KY0302)، وصندوق تطوير البحوث الأساسية الجامعية (KT00062)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81870380)، وجائزة البحوث السريرية من أول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ في الصين (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). يشكر المؤلفون الدكتور تشنغشين شي على اقتراحاته التقنية خلال مرحلة الاستكشاف المبكرة لنموذج استئصال الزائدة الدودية، وكذلك عالم الأمراض الدكتور شي ليو لتقييم نتائج تلطيخ H&E من التهاب القولون وأورام القولون والمستقيم. أجرى Y.L. عرض الجراحة، وقام بتحليل البيانات، وكتب مسودة المخطوطة. شارك كل من جي إل، وجي إل، وزد بي، وي. م. في التحضير الجراحي، ومجموعات الأنسجة، وإنتاج الفيديو. M.Z. أداء قياس التدفق وELISA; وقدم كل من Q.W. وH.X. الدعم التقني لتوليد نموذج من المورين ذي الصلة سريرياً؛ قام R.X.Z. بتصميم الدراسة، والإشراف على البحث، وكتب وثبت المخطوطة؛ راجع ج. س. المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azoxymethane(AOM) Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250, (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313, (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. Appendicitis. at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
  4. On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14, (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186, (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9, (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88, (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249, (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10, (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53, (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20, (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10, (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199, (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68, (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12, (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24, (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22, (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60, (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118, (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184, (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37, (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185, (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118, (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101, (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165, (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175, (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35, (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103, (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15, (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2, (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10, (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5, (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28, (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99, (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97, (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50, (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13, (3), 309-318 (2018).
نموذج استئصال الزائدة الدودية Murine من التهاب القولون المزمن المرتبطة سرطان القولون والمستقيم عن طريق توطين دقيق من التصحيح Caecal
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).More

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter