Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kaekal Patch Kesin Lokalizasyonu ile Kronik Kolit İlişkili Kolorektal Kanser Murine Apendektomi Modeli

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/59921
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 2,3, 1, 4, 1,5, 1,6, 1,2, 1
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine, Xi'an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center, University of Health Network, 6Department of Pathology, Nanjing Medical University

Summary

Sunulan protokol, inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkili kolorektal kanserin indüksiyonu takip eden bir farede apandisin (kaekal yama) kolay bir cerrahi olarak çıkarılmasını açıklar. Bu murine apendektomi modeli insan gastrointestinal hastalığın patogenezinde apandisin biyolojik rolünün araştırılmasını sağlar.

Abstract

İnsan apandisi son zamanlarda kolorektal kanser, inflamatuar barsak hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi çeşitli karmaşık hastalıkların patogenezinde önemli biyolojik roller oynamaktadır. Apandisin işlevini incelemek için bağırsak hastalığı ile ilişkili bir murine apendektomi modeli oluşturulmuş ve adım adım protokolü burada tanımlanmıştır. Bu rapor, dekstran sülfat sodyum (DSS) ve azoksimetan (AOM) kombinasyonunu kullanarak kronik kolit ilişkili kolorektal kanserin kimyasal indüksiyonu takip farelerde kaekal yama kaldırma için bir kolay protokol tanımaktadır. Erkek C57BL/6 farelerinde kaekal yamanın çıkarılmasıyla igA spesifik hücreler ve IgA konsantrasyonu önemli ölçüde azaldı. Aynı anda % 2 DSS ve AOM uygulanması önemli vücut ağırlığı kaybı olmadan hem sham hem de apendektomi gruplarında yaklaşık% 80 fareler in sağkalım sonuçlandı. Histolojik sonuçlar kolon iltihabı ve farklı derecelerde adenokarsinom olduğunu doğruladı. Bu model bağırsak mikrobiyota homeostazve bağırsak kolit ve malignite patogenezi bakımında ek fonksiyonel rolü çalışma için kullanılabilir, yanı sıra ilaç hedefleme tedavilerin potansiyel gelişimi için.

Introduction

Klinik apendektomi çoğunlukla inflamasyon nedeniyle apandisit çıkarılması içeren standart bir cerrahi işlemdir (örneğin, apandisit)1,2,3. Ancak, vermiform insan apandisbiyolojik işlevi tartışmalıkalır 4,5,6. Apandis, kalın bağırsaktaki çekumdan yansıtılan bir kalıntı olarak kabul edilmiştir. Yakın zamana kadar, evrimsel, immünolojik, morfolojik ve mikrobiyolojik çalışmalar apandisin farklı işlevlere sahip olabileceğini ileri sürmüştür. Bu roller immünglobinlerin üretimi (örneğin, IgA ve IgG), bağırsakilişkili lenfoid dokularda adaptif immün yanıtlar için kritik olan çeşitli B hücreleri ve T hücreleri (GALTs) ve kalın bağırsağın kommensal mikrobiyotalarla doldurulmasıdır. 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11.11.20 , 12. Yıl.

Daha önce apendektomi veya akut apandisit olan hastaların klinik epidemiyolojik çalışmaları da inflamatuar barsak hastalığı (IBD), kolorektal kanser ve non-gastrointestinal gibi insan hastalıklarının patogenezinde potansiyel rollerini ortaya koymuştur. bozuklukları (örneğin, Parkinson hastalığı ve kardiyovasküler hastalık)13,14,15,16,17,18. Örneğin, 75.979 apendektomi hastası olan büyük bir Asya popülasyon kohort çalışması, yakın zamanda apendektomi ile kolorektal kanserin sonraki gelişimi arasında anlamlı bir ilişki olduğunu gösterdi. mortalite14,19. Buna göre, bir insana benzeyen uygun bir hayvan apendektomi modelinin oluşturulması, hastalık patogenezinde apandisin biyolojik fonksiyonlarını ve moleküler mekanizmalarını araştırmak için yararlı olacaktır.

Birçok memeli primatlar, lagomorphs (örneğin, tavşan), bazı kemirgenler ve keseli20dahil olmak üzere bir apandis veya apandis benzeri organ, sahip. Küçük ve yaygın olarak kullanılan laboratuvar hayvanları için, tavşan vermiform apendiks morfolojik insan 21 benzeyen sahiptir 21,22, ama tavşan GALT son derece büyük insanlarda göre, çoğunluğu beri lenfoid dokular da Peyer's yamalar hem ince hem de kalın bağırsaklarda bulunan bulunur21. Ayrıca, tavşan farklı bir lenfoid foliküler yapı gösterir, T hücre dağılımı, ve insan dan immünglobulin yoğunluğu, hangi onların ekleri uygun olmayan çalışma yapar21.

Fareler insan patofizyolojisi çalışma ve çeşitli mevcut ve roman therapuetics23,24,25test etmek için en yaygın olarak kullanılan hayvan modelidir. Farelerde caecum apeks tek beyaz büyük lenfoid küme, kaekal yama olarak bilinen, insan apandis26 benzer işlevleri gerçekleştirmek için düşünülmektedir26,27,28. Ancak, farelerde caecum caecal yama ayırmak için pratik olarak zordur. Şimdiye kadar, bir fare modeliapit indükleme için ortak cerrahi prosedürler nispeten büyük bir kesi içerir (örneğin, 1-2 cm) karın duvarı üzerinden tüm caecum erişim elde etmek için (Ek Tablo 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Burada, gastrointestinal hastalık ile ilişkili bir apendektomi modeli oluşturmak için, Bu rapor farelerde kaecal yama çıkarılması için kolay bir cerrahi protokol sunuyor. Bu insanlarda görülen benzer kolit ilişkili kolorektal kanser indüksiyon uyğun için genotoksik ajan AOM ve pro-inflamatuar ajan DSS kombine uygulaması tarafından takip edilir. IBD bağırsak kanseri bir risk faktörü olduğu gösterilmiştir37,38. AOM / DSS kaynaklı kronik kolit ilişkili kolorektal kanser kombinasyonu iyi kurulmuş olmuştur, ve okuyucular Neufert ve ark başvurabilirsiniz, ve Thaker ve ark ayrıntılı prosedürler için39,40. Bu tekrarlanabilir ve hızlı murine apendektomi modeli apandis-modüle bağırsak iltihabı ve kolon mikrobiyota çalışma için kullanılabilir, özellikle gelişimi ve İBTorital kanser ilerlemesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri Xi'an Jiaotong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (No. XJTULAC2019-1023).

1. Fareler apendektomi

  1. House 8-10 haftalık C57BL/6 erkek fareler ameliyattan önce 1 hafta boyunca sertifikalı spesifik patojensiz (SPF) bir ortamda.
  2. Aşağıdaki steril cerrahi aletleri hazırlayın: bir çift mikro makas, bir çift mikro-forceps, iki boy (4-0 ve 8-0) sterilize edilebilen emilemeyen dikişler, iğne tutuculu elektrikli pıhtılaşma kalemi, %75 tıbbi alkol, iyot bazlı scrub ( örneğin, entoiyo) ve steril pamuk lu bir paket.
  3. Ameliyat sırasında karın dalması ve hidrasyonu için önceden ısıtılmış %0.9 fizyolojik tuzlu ile 10 mL'lik bir şırınga doldurun.
  4. 100 mg/kg dozda %1 sodyum pentobarbital ile oruç tutamayan fareyi intraperitoneal (yani) anestezi edin. Pedal reflekslerine yanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.
    NOT: Farede tam sakinleştirici etki sağlamak için tek bir anestezik doz uygulanır. Kısa prosedürler altında 50 mg/kg sodyum pentobarbital i.p. yeterli olabilir.
  5. Hafifçe bir elektrikli tıraş makinesi ile karın saç tıraş.
  6. Hipotermiyi önlemek için fareyi ısıtma yastığına yerleştirin.
  7. Ameliyat sırasında postural hareketi önlemek için ekstremiteler arasında tıbbi yapışkan bant dört şeritler yerleştirerek bir supine pozisyonda bir platform üzerinde fare güvenli.
  8. Yavaşça bir yumru hissi bulmak için tüm karın dokunun.
    NOT: Çoğu durumda, bir yumru hissi her zaman kaecum tam konumunu gösterir. Bağırsak geri kalanında olası hasarı önlemek için, karın insizyonu öncesinde kaecum bu ön bulma önemlidir.
  9. Steril bir perde ile kaplayın ve iyot bazlı çözelti ve% 75 alkol alternatif cerrahi scrubs uygulayarak karın tıraş alanı dezenfekte. İşlemi 2x tekrarlayın.
  10. Karın orta hattında 0.5-1.0 cm arasında değişen uzunlamasına bir kesi yapın.
  11. Kaecum önceden belirlenmiş konumuna göre, kaecum ulaşmak ve yavaşça dışlaştırmak (~ 1 cm) kaecal yama tanımlamak için. Bağırsak nemlendirmek için fizyolojik pH steril, önceden ısıtılmış tuzlu çözelti kullanın.
    NOT: Farenin kaekal yaması kaecumun bir parçasıdır ve yüzeyde beyaz oval foliküllerin varlığı ile karakterizedir.
  12. Postoperatif kanama ve enfeksiyonun olası komplikasyonlarını önlemek için, 8-0 kullanarak kaecummezenterik kan damarları ligate Dikiş. Kaecum'u steril salinle nemlendirin.
  13. Proksimal kolonda caecum apeks yakın açık bir döngü ile 4-0 sütür kullanarak rezeksiyon bölgesi işaretleyin.
    NOT: Caecum'u açık bir döngüyle işaretlemek, caecal içeriğinin kesimden sızmasını da önler.
  14. Mikro makas kullanarak işaretli rezeksiyonun altındaki kaekal yamasını kesin ve tıbbi pamuklu bezlerle kalan kaecal içeriğini silin. Sonra, iyot bazlı scrub ile kaecum kütüğü dezenfekte.
  15. 8-0'ı kullanarak kütüğü çalışan dikişle kapatın Dikiş.
  16. Daha önce kaecum kütüğünde rezeksiyon işaretleme için kullanılan 4-0 iplik döngü dikkatle kaldırın.
  17. İyot bazlı fırçalama ile dikişli konumu sterilize edin. Tekrar tuzlu ile cerrahi site rehydrate.
  18. 8-0 kullanarak çalışan dikiş ile kas tabakasını kapatın dikiş iplik.
  19. 4-0 dikiş ipliği ile kesilen dikişleri kullanarak cilt tabakalarını kapatın.
  20. İyot bazlı scrub ile cerrahi kesim 2x dezenfekte, sonra% 75 tıbbi alkol kullanarak iyot çıkarın.
  21. Fareyi hafifçe geriye çevirin, deri altına (s.c.) 0,1 mg/kg vücut ağırlığı ve 0,4 mL fizyolojik tuzlu su enjekte edin ve farenin bilinçliliğe dönene kadar ısı yastığıüzerinde dinlenmesine izin verin.
  22. Fareyi steril kafese geri koyun ve iyileşmeyi sağlamak için ameliyat sonrası 3 gün boyunca ağrı belirtilerini yakından izleyin.
    NOT: Farenin ağrı kesici siması için 0.05 mg/kg buprenorfin in operatif uygulaması gerekebilir. Kolit ilişkili kolorektal kanserin daha fazla indüksiyon için ameliyattan sonra 7 gün boyunca fareler kurtarmak için izin verin.

2. AOM ve DSS ile kronik kolit ilişkili kolorektal kanser indüksiyonu

NOT: Bu işlemi apendektomi sonrası 7 gün yapın.

  1. 10 mg/mL konsantrasyonda 25 mg AOM'yi %0,9 steril salin de 2,5 mL eriterek AOM stok çözeltisini hazırlayın.
    NOT: AOM ışığa duyarlıdır.
    1. Aliquot 2.5 mL hazırlanmış AOM stok çözeltisi alüminyum folyo ile sarılmış 5 mL cam tüpler içine ve kullanımda her zaman -20 °C'de saklayın.
    2. Bir kez AOM bir aliquot eritin ve 1 mg / mL konsantrasyonuna seyreltin 0.9% steril salin (oran 1:10).
      DİkKAT: AOM son derece kanserojendir; bu nedenle, bir duman başlık içinde tüm hazırlık prosedürü gerçekleştirmek.
  2. %2 (w/v) DSS çözeltisi hazırlamak için 200 mL otoklavlı suda 4 g DSS tozunu çözün.
    NOT: DSS konsantrasyonu fare zorlanma, cinsiyet ve indüksiyon döngüsüne bağlı olarak değişebilir; Diğer fare suşları için %3 DSS kullanılabilir.
  3. Aynı anda farelere yeni hazırlanmış AOM/DSS'yi uygulayın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. İntraperitoneal her fare için taze hazırlanmış AOM çalışma çözeltisi 0,01 mL/g enjekte edin ve 5 gün boyunca otoklavlı suyu %2 DSS çözeltisi ile değiştirin.
      NOT: Her kafeste beş fare; tedavi süresi boyunca herhangi bir çöküntün oluşmadığından emin olmak için DSS içme şişesini düzenli olarak kontrol edin.
    2. Ağırlık ve yakından her gün her fareyi izleyin.
      NOT: Uygulama sırasında, ilk ağırlığı veya huddle, şaşı, hipotermi ve kötü aktivite belirtileri ile karşılaştırıldığında% 20'ye kadar kilo kaybı ile fareler ötenazi.
  4. Gün 6 post-AOM/DSS yönetimi gün 21 (Şekil1B) kadar otoklavlı su taze bir şişe sağlayın.
    NOT: Bu 21 günlük tam bir döngüdür.
  5. Ek iki döngü için 2.3-2.4 adımlarını tekrarlayın ve 70.

3. Kolon iltihabı ve tümörün değerlendirilmesi (AOM sonrası 70 gün)

  1. Ötanazi odasında %10 dolgu oranında CO2 inhalasyonu ile fareleri kurban edin ve ardından servikal çıkığı.
  2. Ileo-kolik kavşak tan anüs için tüm kolon hasat.
  3. Kolonu uzunlamasına açarak lümen tarafını ortaya çıkar. 10 cm uzunluğunda parçalar halinde tüm kolon kesin ve hematoksilin ve eozin (H & E) boyama için 72 h için% 10 formalin kolon dokusu düzeltmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Murine apendektomi modelinin kurulması

Kronik kolit ilişkili kolorektal kanserin bu murine apendektomi modeli Şekil1'de gösterildiği gibi sıralı cerrahi ve indüksiyon adımlarını izleyerek oluşturulabilir. Kaecumun en sık pozisyonları sol ve sağ iliak fossa ve ardından karın orta hattındadır (Şekil 2). Palpasyon yöntemi ile karın kesiği nden önce kaecumun ön lokalizasyonunun başarılı oranı yaklaşık %70 'dir (EkBilgiler, Tablo S2). Apendektomi prosedürleri esas olarak altı önemliadımdan oluşur (Şekil 3). Apendektomi ameliyatı sırasında, cerrahi travmayı en aza indirmek için 0,5-1,0 cm uzunluğunda bir orta hat kesisi önemlidir (Şekil3A). İntraperitoneal sızıntı durumunda, mesangiyal damarların bağlanması ve kaecumun kütüğünün kapatılması, basit ligasyon yerine çalışan dikişler kullanılması gerekmektedir (Şekil3B,C,D,E).

Apendektomi farelerde IgA'nın biyomarker olarak değerlendirilmesi

Apendektomi onaylamak için, farelerin kalın bağırsak ve dışkı içeriği IgA spesifik plazma hücreleri ve salgı IgA (sIgA) konsantrasyonlarının düzeylerini belirlemek için ameliyat sonrası hasat edildi. Apendektomi fareleri, sahte gruba göre B220-IgA+ spesifik plazma hücrelerinin yüzdesinde önemli bir azalma göstermiştir (Şekil4A,B). Ayrıca, ameliyat öncesi kendi ilk durumuna göre, sahte fareler ameliyat sonrası 14 gün boyunca dışkı sIgA konsantrasyonu muhafaza, apendektomi grubu gün 14 önemli bir slgA azalma gösterdi ise (Şekil4C).

Apendektomi farelerde kolit ilişkili kolorektal kanserin doğrulanması

Apendektomi grubundaki farelerin çoğunun ciddi komplikasyonlar ve önemli vücut kilo kaybı gösterdiği %3 DSS ile karşılaştırıldığında (Şekil5A),AOM ile birlikte %2 DSS hem sham hem de apendektomi gruplarında sağkalım oranının %80'ini makul vücut ağırlığı değişiklikleri (Şekil 5E). Tedavinin üç döngü sonunda, tam uzunlukta kalın bağırsak patolojik değerlendirme için hasat edildi. Görsel muayene ve H & E boyama kolon iltihabı ve adenokarsinomfarklı derecelerde kolon tümörleri gösterdi (iyi- orta, ve kötü diferansiye adenokarsinomlar) farelerde 2% AOM / DSS (Şekil6).

Figure 1
Şekil 1: Kronik kolit ilişkili kolorektal kanserin murine apendektomi modelinin oluşturulmasının şematik illüstrasyonu.
(A) Apendektomi işleminin ana cerrahi adımlarının (ilk üçü kritiktir) akış şeması. (B) Kolorektal kanserin indüksiyonu. Apendektomiden yedi gün sonra aOM ve DSS aynı anda uygulandı. Fare ağırlıkları çeşitli zamanlarda (kırmızı üçgen) kaydedildi. Ameliyat sonrası 70 gün sonra fareler kurban edildi ve daha fazla değerlendirme için bağırsak dokuları hasat edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Karın kesiği öncesinde farelerde kaekal yama yerinin önceden belirlenmesi.
(A) Kaecum pozisyonunu bulma olasılığının özeti. (B) sağ, (C ) orta ve (D)farenin sol alt karın da kaecum üç en yaygın pozisyonları anatomik görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Murine apendektominin kritik adımları.
(A) Küçük kesi düzenlenmiş 0.5-1.0 cm; (B) Kaecumun ön pozisyonundan sonra kaekal yamanın tam kısmını çıkarmak. (C) Caecum'a eşlik eden mezenterik damarların ligasyonu. (D) 4-0 sütür ile caecum kesme bölgesi işaretleme. (E) 8-0'ı kullanarak kütüğü çalışan dikişlerle kapatmak Dikiş. (F) 8-0 kullanarak kesitli dikişlerle kas tabakasının kapatılması Dikiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Apendektomi sonrası IgA spesifik plazma hücrelerinin ve dışkı sIgA konsantrasyonunun nicelleştirilmesi.
(A) Sahte ve apendektomi farelerin tüm kalın bağırsağında ameliyat sonrası 1 gün 14 gün boyunca anti-IgA ve B220 ile boyanmış hücreler için temsili nokta çizimleri. Lamina propria lenfositler taze hazırlanmış ve fitc anti-fare IgA, PE anti-fare CD45R/B220 akış sitometri sitometri ile boyanmış. Çizimler içindeki sayılar, ilgili alanlardaki hücrelerin yüzdelerini gösterir; (B) Sham ve apendektomi gruplarında IgA spesifik plazma hücrelerinin kantitatif tayini. Veriler ortalama ± SD'yi temsil eder; n = 5-8 fare; *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. (C) Ameliyat öncesi ve sonrası dışkı sIgA konsantrasyonları. Dışkı içeriği belirlenen zaman noktalarında toplandı ve sIgA düzeyleri ELISA tarafından test edildi. Her renk nokta 14 günlük bir süre içinde aynı fareyi temsil eder. İstatistiksel analiz, p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilen eşleşmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Apendektomi sonrası AOM/DSS kombinasyonu ile indüklenen kronik kolit ilişkili kolorektal kanser murine modelinin hayvan sağkalım durumu.
(A) Sham ve apendektomi gruplarında kolit indüksiyonu için %3 DSS kullanılarak elde edilen sağkalım eğrisi. Anal prolapsusun ciddikomplikasyonları (B ) ve duvar apsesi hayvanın bitiş noktasını (C) göstermiştir. (D) Sham ve apendektomi gruplarında kolit indüksiyonu için %2 DSS kullanılarak elde edilen sağkalım eğrisi; (E) Farelerin 70 gün içinde ortalama vücut ağırlığı değişimi. Veriler ± SD, n = 6 fare ortalamasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: %2 DSS ve 10 mg/kg AOM kombinasyonu nun tedavisi ile indüklenen kronik kolit ilişkili kolorektal tümörlerin görüntüleri.
(A) görsel muayene ve (B) hayvan operasyon mikroskobu altında tümörler ile diseksiyon kolon fotoğrafları. Kolon dokularının H&E boyama görüntüleri gösteren (C) kolon iltihabı, (D) iyi diferansiye adenokarsinom, (E) orta derecede farklılaşmış adenokarsinom, ve (F) yüksek diferansiye adenokarsinom. Siyah ok mukozal ülseri, siyah ok ucu adenokarsinom gösterir, beyaz ok bezleri arasında nötrofil infiltrasyonu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Yaygın olarak kullanılan fare suşlarında apandisit indüksiyonu için kullanılan cerrahi yöntemlerin literatür özeti. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Tablo 2: Laparotomi sonrası farelerde kaecum yerleri. Kesi den sonra maruz kalan organ laparotomi sonrası doğrudan önceden yerleştirilmiş pozisyonda bulunan organı gösterir. Kaecum pozisyonu karın bölgesine göre caecum konumunu gösterir / bağırsak göre caecum pozisyonu. Maruz kaecum karın kas tabakasının altında ve bağırsak diğer bölümleri üzerinde olduğunu gösterir. Gömülü kaecum bağırsak tarafından kaplı olduğunu gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kolit ilişkili kolorektal kanserin bir murine apendektomi modeli farelerde yüksek sağkalım oranı ile cerrahi adımlar kullanılarak elde edildi. Çoğu durumda, kaecum karın duvarının altına yerleştirildiğinden (EkTablo 1, Ek Tablo 2, ve Şekil 2), laparotomi olmadan yerini önceden değerlendirmek zordu. Bu cerrahi protokolde, tümsek dokunmadan kolay bir adım getirilmiş ve çekum un ön lokalizasyonu için hassasiyeti artırmak içinçekum yerinin nicel değerlendirmesi de sağlanmıştır (Şekil 2). Kaekal yama kaldırmak için anatomik özelliklerin sömürülmesi bağırsak istenmeyen parçaların bozulmasını en aza indirmek, bu nedenle apendektomi ve karın boşluğuenfeksiyon potansiyel komplikasyonların oranını azaltarak.

Bu modelde üç kritik adım yer almaktadır. İlk olarak, laparotomi öncesi görsel muayene ve palpasyon kaecum genel yerini belirlemek için yararlı olabilir. Kabın büyük olasılıkla karın sol iliak bölgesinde mevcut olmasına rağmen, kaecum apeksinden çıkıntılı kaekal yama genellikle dissosiyatiftir (yani, hareket veya gömülü) ve orta peritonun altında bulunma olasılığı daha yüksektir ( Şekil 2). İkinci olarak, karın orta hattında küçük bir kesi ve kaekal yama doğru maruz tercih edilir. Bunun nedeni karın orta hattında ince bir nokta olmasıdır, bu pozisyonda kesme karın kas tabakasının potansiyel yaralanma azaltabilir. Buna ek olarak, apendektomi üzerine volvulus önlemek için, hangi fareler için zararlıdır, kaekal yama doğru maruz kalma bağırsak istenmeyen bozukluğu en aza indirir, volvulus oluşumu riskini azaltır. Ayrıca, karın boşluğunun minimal maruz kalma bağırsak kontamine olmayan kalmasını sağlayabilir, sıcak, ve nemli; aksi takdirde, aşırı maruz kalma önemli ısı kaybına ve dokuların kurutulmaya neden olabilir41.

Üçüncü olarak, kaekal kütüğün basit ligasyon yerine çalışan dikişlerle dezenfeksiyonu ve kapatılması, kütüğün kaekal içeriğinin olası kanamave dezenfeksiyonuönlemek için gereklidir. Farelerin kalın bağırsağında IgA'ya özgü plazma hücreleri ve dışkı sIgA düzeyi apendektomi ile önemli ölçüde azalır, bu da kaekal yamanın en azından ilk dönemde IgA üretimi için ana bölge olduğunu düşündürmektedir33. Kalın bağırsakta, kommensal floranın normal kolonizasyonunu stabilize ederek ve patojenik mikroplara karşı koyarak mukozal sağlık savunucusu olarak sIgA işlevi42. Apandisin çıkarılması IgA üretimini azaltır ve mukozal homeostaz bozabilir.

%3 DSS ile tedavi edilen farelerde aşırı kolit indüksiyonunun yüksek mortalite oranı ve klinik bulguları (yani şiddetli kanlı dışkı, anal prolapsus ve abdominal apse43,44) gözlendi (Şekil 5). Ancak üç döngüden sonra %2 DSS indüksiyonu bu komplikasyonların hiçbirine neden olmadı ve sağkalım oranı %80'in üzerinde tutuldu. Bu, GALT'lerin bütünlüğünün olmaması farelerin AOM ve DSS kombinasyonuna karşı toleransını bir dereceye kadar azaltabileceğinden, DSS ve AOM'nin birlikte kullanımının doğrulanması gerektiğini gösterir. Klinik temelli kanıtlardan yapılan gözlemsel çalışmalar, apandisin IBD ve kolorektal kanser gelişimi ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermektedir14,45,46. Ancak, kronik bağırsak hastalıklarının patogenezinde apandisin biyolojik fonksiyonları ve altta yatan mekanizmaları hala belirsizdir. Bu apandis GALTs önemli bir parçası olarak ve bağırsak kommensal flora sağlık veya hastalıklı devletler17,18,31düzenlemek için bir rezervuar olarak hareket görünür . Bu tekrarlanabilir ve uygun maliyetli murine apendektomi modelinin oluşturulması mikrobiyota homeostaz, kanser önleme ve immünoterapi bağlamında IBD ve kolorektal kanser ekinin rollerini incelemek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Merkez Üniversitesi Temel Araştırma Fonları (G2018KY0302), Üniversite Temel Araştırma Geliştirme Fonu (KT00062), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81870380) ve Klinik Araştırma Ödülü tarafından desteklenmiştir. Çin'deki Xi'an Jiaotong Üniversitesi'nin Ilk Bağlı Hastanesi (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Yazarlar murine apendektomi modelinin erken keşif aşamasında yaptığı teknik öneriler için Dr Chengxin Shi teşekkür, yanı sıra kolit ve kolorektal tümörlerin H & E boyama sonuçlarının değerlendirilmesi için patolog Dr Xi Liu. Y.L. ameliyat gösterisini yaptı, veri analizi yaptı ve taslağı yazdı; J.L., G.L., Z.P., ve Y.M. cerrahi hazırlık, doku koleksiyonları ve video prodüksiyonu nda yer aldılar; M.Z. akış sitometrisi ve ELISA'yı; Q.W. ve H.X. klinik olarak ilgili bir murine modeli nin üretilmesi için teknik destek sağladılar; R.X.Z. çalışmayı tasarladı, araştırmayı denetledi ve el yazını yazdı ve ispat etti; J.S. taslağı inceledi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azoxymethane(AOM) Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. Appendicitis. , at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
  4. On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. , at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

Tıp Sayı 150 mürin modeli apandis kaekal yama gastrointestinal anatomi kalın barsak tümör IgA azoksitant dekstran sülfat sodyum IBD
Kaekal Patch Kesin Lokalizasyonu ile Kronik Kolit İlişkili Kolorektal Kanser Murine Apendektomi Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z.,… More

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter