Summary
提出的协议描述了在小鼠中插入附录（caecal贴片）的方便手术去除，然后是炎症性肠病相关结肠直肠癌的诱导。这种鼠尾切除术模型能够研究附录在人类胃肠道疾病发病机制中的生物学作用。
Abstract
人类附录最近被牵连到在各种复杂疾病的发病机制中起着重要的生物学作用，如结肠直肠癌、炎症性肠病和帕金森病。为了研究附录的功能，建立了肠道疾病相关鼠尾切除术模型，并描述了其分步方案。本报告介绍了小鼠的caecal贴片去除的易制方案，然后使用硫酸盐钠（DSS）和气氧甲烷（AOM）的组合，对慢性结肠炎相关结肠直肠癌进行化学诱导。与假组小鼠相比，在雄性C57BL/6小鼠去除caecal贴片后，IgA特异性细胞和IgA浓度显著降低。同时施用2%的DSS和AOM，导致近80%的小鼠在假和切除组存活，没有显著的体重损失。组织学结果证实结肠炎和不同程度的腺癌。该模型可用于研究附录在维持肠道微生物群落平衡和肠道结肠炎和恶性肿瘤的发病机制中的作用，以及药物靶向疗法的潜在开发。
Introduction
临床切除术是一个标准的外科手术，涉及切除主要由于炎症（例如，附录炎）1，2，3的附录。然而，生物形态人类附录的生物功能仍然有争议的4，5，6。附录已被视为从大肠的cecum中残留的残余物。直到最近，进化、免疫学、形态学和微生物学研究表明，附录可能具有不同的功能。这些作用包括生产免疫球蛋白（例如IgA和IgG），对肠道相关淋巴组织（GALTs）内的适应性免疫反应至关重要的各种B细胞和T细胞，以及用共生微生物补充大肠6,7,8,9,10,11,12.
对先前切除或急性尾炎患者的临床流行病学研究也揭示了其在人类疾病发病机制中的潜在作用，如炎症性肠病（IBD）、结肠直肠癌和非胃肠道疾病疾病（如帕金森病和心血管疾病）13，14，15，16，17，18 。例如，最近一项由75，979名切除术患者组成的大型亚洲人群队列研究表明，结肠直肠癌的切除术与随后的发展之间存在显著联系，而结肠直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率较高，死亡率14，19.因此，建立一个类似于人类的合适的动物切除模型将有助于研究疾病发病机制中附录的生物功能和分子机制。
许多哺乳动物拥有附录或类似附录的器官，包括灵长类动物、拉戈形态动物（如兔子）、一些啮齿动物和20只鼠。对于小型和常用的实验动物，兔子拥有与人类21、22相似的生物形态附录，但兔子中的GALT与人类相比非常大，因为大多数淋巴组织也发现在佩耶的补丁位于小肠和大肠21。此外，兔子表现出不同的淋巴卵泡结构，T细胞分布，和免疫球蛋白密度从人类，这使得研究他们的附录不合适21。
老鼠是研究人类病理生理学和测试各种现存和新颖的植物模型，研究人类病理生理学，研究23、24、25。单白色大淋巴簇在小鼠的caecum的顶点，被称为caecal补丁，被认为执行类似于人类附录26，27，28的功能。然而，在小鼠中，很难将caecal补丁与小鼠的caecum分离开来。到目前为止，在小鼠模型中诱导尾炎的常见外科手术涉及一个相对较大的切口（例如，1⁄2厘米）通过腹壁，以进入整个腹腔（补充表1）29。 30，31，32，33，34，35，36。
本文旨在生成与胃肠道疾病相关的切除模型，本报告提出了小鼠切除cacal斑块的实用手术方案。随后，联合给基因毒性剂AOM和亲炎剂DSS，用于诱导结肠炎相关结肠直肠癌，类似于在人类身上。IBD已被证明是肠癌的危险因素37，38。AOM/DSS诱发慢性结肠直肠癌的组合已经确立，读者可以参考Neufert等人和Thaker等人进行详细程序39，40。这种可重复的快速鼠尾切除术模型可用于研究附录调节的肠炎症和结肠微生物群，特别是在IBD和结肠直肠癌的发展和进展中。
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Protocol
所有动物程序均经西安交通大学动物护理使用委员会批准（No.XJTULAC2019-1023）。
1. 小鼠切除术
- 在手术前1周内，在经认证的无特定病原体（SPF）环境中，将8-10周老的C57BL/6雄性小鼠。
- 准备以下无菌手术器械：一对微剪刀，一对微钳，两种大小（4-0和8-0）的灭菌性非吸收缝合线，带针架的电凝固笔，75%医用酒精，碘基磨砂（）。例如，碘），和一包无菌棉签。
- 在手术期间，用预热的0.9%生理盐水填充10 mL注射器，用于腹部冲洗和水合。
- 用1%的五巴比妥钠在100mg/kg的剂量下麻醉非禁食小鼠。检查麻醉的深度，因为对踏板反射缺乏反应。
注：施用单一麻醉剂，以确保小鼠具有完全镇静作用。在短程序的情况下，50毫克/千克的五巴比妥钠可能就足够了。 - 用电动护发机轻轻洗去腹部的头发。
- 将鼠标放在加热垫上，以防止体温过低。
- 通过在四肢上放置四条医用胶带，防止手术期间的姿势运动，将鼠标固定在平台上。
- 轻轻触摸整个腹部，找到颠簸的感觉。
注： 在大多数情况下，凹凸的感觉始终指示卡库姆的确切位置。为了避免对肠道其余部分的可能损害，在腹部切口之前预先定位腹腔非常重要。 - 用无菌窗帘盖住，通过交替手术擦洗碘溶液和75%酒精来消毒腹部的刮伤区域。重复此过程 2 次。
- 在腹部中线进行从0.5~1.0厘米的纵向切口。
- 根据 caecum 的预先确定的位置，到达 caecum 并轻轻地外在 （±1 厘米） 以识别 caecal 贴片。使用生理pH的无菌、预热的盐水溶液来滋润肠道。
注： 小鼠的caecal贴片是caecum的一部分，其特征是表面存在白色卵泡。 - 为了防止术后出血和感染的潜在并发症，使用8-0对卡库姆的血管进行抽射缝合。用无菌盐水将水合。
- 使用 4-0 缝合线标记切除区域，并在近端结肠的 caecum 顶点附近有一个开环。
注： 使用开环标记 caecum 还可防止从切口泄漏 caecal 内容。 - 使用微剪刀切断标记切除下方的caecal贴片，并用医用棉签擦去残留的Caecal含量。然后，用碘质磨砂消毒卡库姆的树桩。
- 使用 8-0 使用运行缝合线关闭树桩缝合。
- 小心地拆下先前用于标记卡库姆树桩处切除的 4-0 螺纹循环。
- 用碘基磨砂消毒缝合位置。再次用盐水补充手术部位。
- 使用 8-0 使用运行缝合线关闭肌肉层缝合线。
- 使用 4-0 缝合线使用中断的缝合线关闭皮肤层。
- 用碘基磨砂消毒手术切口2倍，然后用75%的医疗酒精去除碘。
- 轻轻地翻转鼠标回来，皮下 （s.c.） 注射 0.1 毫克/千克体重的丁丙诺啡和 0.4 mL 的生理盐水，让鼠标停留在热垫上，直到恢复意识。
- 将鼠标放回无菌笼子，并密切监测手术后3天的疼痛迹象，以确保恢复。
注：术后应用0.05毫克/千克丁丙诺啡可用于缓解单个小鼠的疼痛。让小鼠在手术后7天恢复，以进一步诱导结肠炎相关的结肠直肠癌。
2. 慢性结肠炎相关结肠直肠癌与AOM和DSS的诱导
注：在切除后7天执行此过程。
- 在浓度为10mg/mL的2.5 mL中溶解2.5mg 0.9%无菌盐水，制备AOM库存溶液。
注： AOM 是光敏的。- 将制备的 AOM 库存溶液加成 5 mL 玻璃管，用铝箔包裹，每次使用时储存在 -20°C。
- 解冻AOM的一个等分，将其稀释至浓度为1mg/mL，无育盐水为0.9%（比1：10）。
注意：AOM极有致癌性;因此，在烟罩中执行整个准备过程。
- 在200 mL的高压灭水中溶解4克DSS粉末，制备2%（w/v）DSS溶液。
注：DSS的浓度可能因小鼠菌株、性别和诱导周期而异;3% DSS 可用于其他小鼠菌株。 - 同时给小鼠施用新鲜制备的AOM/DSS。为此，请按照以下步骤操作。
- 每只小鼠注射0.01 mL/g新制备的AOM工作溶液，用2%DSS溶液代替高压灭水5天。
注：每个笼子包含五只老鼠;定期检查DSS饮料瓶，以确保在治疗期间不会发生沉淀。 - 重量和密切监测每只鼠标每天。
注：在管理期间，与小鼠最初体重或拥挤、斜视、体温过低和活动不良的迹象相比，对小鼠的体重减轻高达20%。
- 每只小鼠注射0.01 mL/g新制备的AOM工作溶液，用2%DSS溶液代替高压灭水5天。
- 在 AOM/DSS 管理后的第 6 天提供一瓶新鲜的灭武水，直到第 21 天（图 1B）。
注：这是一个完整的周期，包括21天。 - 重复步骤2.3~2.4，增加两个周期，并在第70天牺牲小鼠。
3. 结肠炎和肿瘤评估（AOM后70天）
- 在安乐死室中，以10%的填充率吸入CO2吸入，然后宫颈脱位，牺牲小鼠。
- 从卵绞线上方收获整个结肠到尾数。
- 纵向打开结肠，露出流明侧。将整个结肠切成10厘米长的片断，将结肠组织固定在10%的形式素中，为72小时进行血氧林和欧辛（H&E）染色。
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Representative Results
鼠尾切除术模型的建立
这种慢性结肠炎相关结肠直肠癌的切除模型可以通过遵循连续的手术和诱导步骤生成，如图1所示。卡库姆最常见的位置是左和右的iliac fossa后跟腹部的中间线（图2）。使用触觉法在腹部切口前预定位的成功率接近70%（补充信息，表S2）。切除程序主要包括六个重要步骤（图3）。在切除手术期间，长度小至0.5~1.0厘米的中线切口对于尽量减少手术创伤至关重要（图3A）。在腹内渗漏的情况下，使用跑步缝合线代替简单的结扎（图3B、C、D、E），有必要对血管进行连接并关闭牙套的树桩。
IgA作为附录切除术小鼠生物标志物的评价
为了确认切除术，在手术后采集小鼠的大肠和粪便含量，以确定IgA特异性血浆细胞和分泌IgA（sIgA）浓度的水平。与假组相比，切除小鼠的B220-IgA®特异性血浆细胞的百分比显著下降（图4A，B）。此外，与手术前的初始状态相比，假小鼠在手术后14天内维持粪便sIgA浓度，而切除组在第14天表现出显著的slgA减少（图4C）。
尾性小鼠结肠炎相关结肠直肠癌的验证
与3%的DSS相比，在尾切手术组的大多数小鼠表现出严重的并发症和显著的体重减轻（图5A），2%的DSS与AOM相结合，在假和切除组提供了80%的存活率，合理的体重变化 （图 5E）。在三个治疗周期结束时，收获了全长大肠进行病理评估。目视检查和H&E染色显示，在用2%AOM/DSS治疗的小鼠中，结肠肿瘤具有结肠炎和不同程度的腺癌（良好、中度和分化差的腺癌）。图6。
图1：建立慢性结肠炎相关结肠直肠癌的鼠尾切除术模型的原理图。
（A） 切除手术的主要手术步骤（前三个至关重要）的流程图.（B） 结肠直肠癌的诱导.在切除术后七天，同时施用AOM和DSS。在不同时间记录小鼠重量（红色三角形）。在手术后70天，老鼠被牺牲，肠道组织被采集进一步评估。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：腹部切口前小鼠的caecal贴片位置的预确定。
（A） 找到卡库姆位置的可能性的摘要.在小鼠的左下部 （B） 中 ， 和 （D） 左下腹部的三个最常见的位置的解剖图像.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：鼠尾切除术的关键步骤。
（A） 小切口布置 0.5~1.0 厘米;（B） 在预置卡库姆后拉出卡卡片的精确部分。（C） 伴有卡库姆的美感船只的结扎。（D） 用 4-0 缝合标记卡库姆的切割区域。（E） 使用 8-0 的跑步缝合线关闭树桩缝合。（F） 使用 8-0 关闭带中断缝合的肌肉层缝合。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：尾切切除术后IgA特异性血浆细胞和粪便sIgA浓度的定量。
（A） 在假鼠和切除小鼠的整个大肠中，有1天和14天被染上抗IgA和B220的细胞的代表性点图。拉米纳普里亚淋巴细胞是新鲜准备的，并沾染了FITC抗小鼠IgA，PE抗小鼠CD45R/B220流动细胞测定。图内的数字表示各自区域中单元格的百分比;（B） 假和附属组IgA特异性血浆细胞的定量测定。数据表示均值 = SD;n = 5~8只小鼠;*p < 0.05、#p < 0.01 和 +p < 0.001。（C） 手术前后的粪便 sIgA 浓度.在指定时间点收集粪便含量，并通过ELISA测试sIgA水平。每个颜色点表示 14 天内的同一鼠标。使用未配对的t-test 执行统计分析，p < 0.05 被认为具有统计显著性。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：尾切切除术后AOM/DSS组合诱导的慢性结肠炎相关结肠直肠癌小鼠模型的动物生存状态。
（A） 在假和附属切除组使用3%DSS诱导结肠炎获得的生存曲线。肛门脱垂 （B） 和壁画脓肿的严重并发症表明动物 （C. ） 的终点（D） 在假和附属切除术组中，使用2%DSS诱导结肠炎获得的生存曲线;（E） 小鼠平均体重变化超过70天。数据表示均值 = SD，n = 6 个鼠标。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：2%DSS和10mg/kg AOM联合治疗诱导的慢性结肠炎相关结肠直肠肿瘤的图像。
在 （A） 目视检查和 （B） 动物手术显微镜下解剖结肠与肿瘤的照片.结肠组织显示 （C） 结肠炎症的 H&E 染色图像， （D） 分化良好的腺癌， （E） 中度分化腺癌， 和 （F） 高度分化腺癌.黑色箭头表示粘膜溃疡，黑色箭头表示腺癌，白色箭头表示腺体之间的中性粒细胞渗透。请点击此处查看此图的较大版本。
补充表1：常用小鼠菌株用于尾炎诱导的手术方法的文献综述。请点击此处下载此文件。
补充表2：腹腔切除术后小鼠的腹腔位置。切口后暴露的器官表示腹腔切除术后直接位于预置位置的器官。caecum 的位置显示相对于腹部区域/相对于肠道的卡库姆位置。暴露表明，腹肌低于腹部的肌肉层和肠道的其他部分。嵌入表示肠被覆盖。请点击此处下载此文件。
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Discussion
利用手术步骤，在小鼠中获得与结肠炎相关的结肠直肠癌的鼠尾切除术模型。在大多数情况下，由于腹壁位于腹壁下（补充表1，补充表2和图2），如果没有腹腔切除术，很难预先判断其位置。在手术方案中，引入了一个容易接触凸起的步骤，并给出了对cecum位置的定量评估，作为提高cecum预定位精度的指导（图2）。利用解剖特征去除肠的意外部位，最大限度地减少了肠的意外部位的中断，从而降低了切除和腹腔感染的潜在并发症率。
此模型涉及三个关键步骤。首先，腹腔切除术前的目视检查和触觉有助于确定腹腔的一般位置。尽管事实上，caecum 最有可能存在于腹部的左腹膜区域，但从腹膜顶点突出的caecal斑块往往是分离的（即，移动或嵌入），并且更有可能在中间腹膜下被发现（图 2.其次，腹部中间线处的小切口和准确暴露的腹肌斑是首选。这是因为腹部中间线有一个薄点，切入此位置可能会减少腹部肌肉层的潜在损伤。此外，为了避免在切除后出现对小鼠有害的伏脱，准确接触caecal贴片可最大限度地减少肠道意外的干扰，降低伏脱发生的风险。此外，腹腔的最小暴露可以确保肠道保持无污染、温暖和潮湿;否则，过度接触可能导致严重的热损失和组织干燥41。
第三，消毒和关闭用运行缝合线，而不是简单的结扎是必要的，以防止潜在的出血和消毒的卡卡内容树桩。小鼠大肠中IgA特异性血浆细胞和粪便sIgA的水平通过切除术显著降低，这表明，至少在第33期，caecal斑块是生产IgA的主要部位。在大肠中，sIgA通过稳定粘膜菌群的正常殖民化和对抗致病微生物42，充当粘膜健康防御者。去除附录会减少IgA的生产，并可能破坏粘膜平衡。
在用3%DSS治疗的小鼠中观察到高死亡率和过度结肠炎诱导的临床症状（即严重出血性大便、肛门脱垂和腹部脓肿43，44）。然而，三个周期后的2%DSS诱导没有造成这些并发症，存活率保持在80%以上。这表明，应验证DSS和AOM的组合使用，因为GALT缺乏完整性，可能在一定程度上降低小鼠对AOM和DSS组合的容差。来自临床证据的观察性研究表明，该附录与IBD和结肠直肠癌14、45、46的发展密切相关。然而，慢性肠道疾病发病机制中附录的生物功能和基本机制仍不清楚。看来，附录作为GALT的重要组成部分，并作为肠道共体菌的水库，以调节健康或疾病状态17，18，31。建立这种可重复且具有成本效益的鼠尾切除术模型可用于研究附录在IBD和结肠直肠癌在微生物平衡、癌症预防和免疫治疗中的作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到中央大学基础研究基金（G2018KY0302）、大学基础研究发展基金（KT00062）、中国国家自然科学基金（81870380）和临床研究奖的支持。西安交通大学第一附属医院XJTU1AF-CRF-2015-029）。作者感谢史成新博士在鼠尾细胞切除模型早期探索阶段提出的技术建议，以及病理学家刘希博士对结肠炎和结肠直肠肿瘤的H&E染色结果的评价。Y.L.进行了手术演示，做了数据分析，并撰写了手稿草稿;J.L.、G.L.、Z.P.和Y.M.参与了外科准备、组织收集以及视频制作;M.Z. 执行流式细胞学和 ELISA;Q.W.和H.X.为生成临床相关鼠种模型提供了技术支持;R.X.Z.设计研究，监督研究，编写和证明手稿;J.S.审阅了手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane(AOM) | Sigma-Aldrich,Inc. | A5486 | |
| Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) | MP Biomedicals,Inc. | 160110 | |
| Entoiodine | Shanghai likon high technology disinfection co. LTD | 310102 | |
| digital caliper | Ningbo yuanneng trading co. LTD | 4859263 | |
| 4-0 Silk Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| 8-0 Prolene Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| Electric coagulation pen | Chuang mei medical equipment co. LTD | 28221777292 | |
| disposable syringe 1ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| disposable syringe 10ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| 75% Medicinal alcohol | Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD | 371402AAJ008 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich,Inc. | 57-33-0 | |
| Physiological Saline | Shandong qidu pharmaceutical co. LTD | H37020766 | |
| Absorbent Cotton Swab | Henan ruike medical co., LTD | RK051 | |
| Surgical Instruments-Ophthalmic | Jinzhong Shanghai co.LTD | WA3050 |
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