Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Murine appendectomy model af kronisk colitis associeret kolorektal cancer ved præcis lokalisering af Caecal patch

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/59921
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 2,3, 1, 4, 1,5, 1,6, 1,2, 1
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine, Xi'an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center, University of Health Network, 6Department of Pathology, Nanjing Medical University

Summary

Den præsenterede protokol beskriver en facile kirurgisk fjernelse af tillægget (caecal patch) i en mus efterfulgt af induktion af inflammatorisk tarmsygdom-associeret kolorektal cancer. Denne murine appendectomy model muliggør undersøgelse af den biologiske rolle af tillægget i patogenesen af menneskelig gastrointestinal sygdom.

Abstract

Den menneskelige tillægget er for nylig blevet impliceret til at spille vigtige biologiske roller i patogenesen af forskellige komplekse sygdomme, såsom kolorektal cancer, inflammatorisk tarmsygdom, og Parkinsons sygdom. For at studere funktionen af tillægget, en Gut sygdom-associeret murine appendectomy model er blevet etableret og dens trin-for-trin protokol er beskrevet her. Denne rapport introducerer en facile protokol for caecalis relativt patch fjernelse i mus efterfulgt af den kemiske induktion af kronisk colitis-associeret kolorektal cancer ved hjælp af en kombination af dextran sulfat natrium (DSS) og azoxymethane (AOM). IgA-specifikke celler og IgA-koncentration blev signifikant reduceret ved fjernelse af caecalis relativt-plasteret i mandlige C57BL/6-mus sammenlignet med dem i Sham-gruppen. Samtidig administration af 2% DSS og AOM resulterede i næsten 80% mus overlevelse i både Sham og appendectomy grupper uden signifikant legemsvægt tab. Histologiske resultater bekræftet Colon inflammation og forskellige grader af adenocarcinoma. Denne model kan anvendes til undersøgelse af den funktionelle rolle af tillægget i opretholdelsen af Gut mikrobiota homøostase og patogenese af tarm colitis og maligniteter, samt for den potentielle udvikling af Drug målretning behandlingsformer.

Introduction

Den kliniske appendectomy er en standard kirurgisk procedure, der involverer fjernelse af tillægget hovedsagelig på grund af betændelse (f. eks, blindtarmsbetændelse)1,2,3. Men den biologiske funktion af vermiform menneskelige appendiks forbliver kontroversiel4,5,6. Tillægget er blevet betragtet som en vestigial rest projicering fra cecum i tyktarmen. Indtil for nylig har evolutionære, immunologiske, morfologiske og mikrobiologiske undersøgelser antydet, at tillægget kan have særskilte funktioner. Disse roller omfatter produktion af immunoglobiner (f. eks. IgA og IgG), en række B-celler og T-celler, der er kritiske for adaptive immunresponser inden for tarm-associerede lymfoide væv (Galts), og genopfyldning af tyktarmen med kommensal mikrobiotas 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Kliniske epidemiologiske undersøgelser af patienter med tidligere appendectomy eller akut blindtarmsbetændelse har også afsløret dets potentielle roller i patogenesen af sygdomme hos mennesker, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD), kolorektal cancer og ikke-gastrointestinale sygdomme (f. eks. Parkinsons sygdom og Kardiovaskulær sygdom)13,14,15,16,17,18. For eksempel, en stor asiatisk population kohorteundersøgelse med 75.979 appendectomy patienter for nylig viste en signifikant sammenslutning mellem appendectomy og efterfølgende udvikling af kolorektal cancer, en af de mest almindelige maligniteter med en høj incidens og dødelighed14,19. Derfor, etablering af et egnet dyr appendectomy model, der ligner et menneske vil være nyttigt at undersøge de biologiske funktioner og molekylære mekanismer i tillægget i sygdoms patogenesen.

Mange pattedyr besidder et appendiks eller et appendiks lignende organ, herunder primater, lagomorfer (f. eks. kaniner), nogle gnavere og pungdyr20. For små og almindeligt anvendte forsøgsdyr, kaninen besidder vermiform appendiks morfologisk ligner den menneskelige21,22, men galt i kanin er ekstremt stor i forhold til, at i mennesker, da de fleste af lymfoide væv findes også i Peyers patches placeret i både små og store tarme21. Desuden kanin viser en anden lymfoide follikulært struktur, T celle fordeling, og immunglobulin tæthed fra det menneskelige, hvilket gør studiet af deres tillæg upassende21.

Mus er den mest almindeligt anvendte dyremodel til at studere menneskelig Patofysiologi og teste de forskellige eksisterende og nye terapeuuetics23,24,25. Den enkelt hvide store lymfoide klynge i spidsen af coecum i mus, kendt som caecalis relativt patch, menes at udføre funktioner svarende til den menneskelige tillæg26,27,28. Alligevel er det praktisk talt vanskeligt at adskille caecalis relativt patch fra coecum i mus. Hidtil, de fælles kirurgiske procedurer for inducerende blindtarmsbetændelse i en musemodel indebærer et relativt stort snit (f. eks, 1 – 2 cm) gennem bugvæggen for at få adgang til hele coecum (supplerende tabel 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Heri, at generere en appendectomy model forbundet med gastrointestinal sygdom, denne rapport præsenterer en facile kirurgisk protokol til caecalis relativt patch fjernelse i mus. Dette efterfølges af den kombinerede administration af det genotoksiske middel AOM og pro-inflammatoriske agent DSS for induktion af colitis-associeret kolorektal cancer svarende til den, der ses hos mennesker. IBD har vist sig at være en risikofaktor for tarmkræft37,38. Kombinationen af AOM/DSS-induceret kronisk colitis associeret kolorektal cancer har været veletableret, og læsere kan henvise til neufert et al., og Thaker et al. for detaljerede procedurer39,40. Denne reproducerbare og hurtig murine appendectomy model kan bruges til at studere appendiks-moduleret tarmbetændelse og tyktarms mikrobiota, især i udviklingen og progression af IBD og kolorektal cancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr procedurer blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg af Xi'an Jiaotong University (nr. XJTULAC2019-1023).

1. mus appendectomy

  1. House 8 – 10 uger gamle C57BL/6 hanmus i et certificeret specifikt patogen frit (SPF) miljø i 1 uge før operationen.
  2. Forbered følgende sterile kirurgiske instrumenter: et par mikro-saks, et par mikro-pincet, to størrelser (4-0 og 8-0) af steriliserede ikke-absorberbare suturer, en elektrisk koagulations kuglepen med kanyle holder, 75% medicinsk alkohol, jod-baseret scrub ( f. eks. entoiodin) og en pakke med sterile vatpinde.
  3. Fyld en 10 mL sprøjte med forvarmet 0,9% fysiologisk saltvand til abdominal flush og hydrering under operationen.
  4. Anesthetize en ikke-fastet mus intraperitonealt (IP) med 1% natriumpentobarbital i en dosis på 100 mg/kg. Check for dybden af anæstesi ved manglende respons på pedal reflekser.
    Bemærk: en enkelt anæstesi dosis administreres for at sikre en fuld sedativ effekt i musen. Under omstændigheder af korte procedurer, 50 mg/kg natriumpentobarbital IP kan være tilstrækkelig.
  5. Barberer forsigtigt mave håret med en elektrisk barbermaskine.
  6. Læg musen på varmepuden for at forhindre hypotermi.
  7. Fastgør musen på en platform i liggende position ved at placere fire strimler af medicinsk klæbende tape på tværs af lemmer for at forhindre postural bevægelse under operationen.
  8. Rør forsigtigt hele maven for at finde følelsen af et bump.
    Bemærk: i de fleste tilfælde indikerer følelsen af et bump altid den nøjagtige placering af Caecum. For at undgå mulige skader på resten af tarmen, denne præ-lokalisering af coecum forud for abdominal indsnit er vigtig.
  9. Dæk med en steril drapere og desinficere det barberede område af maven ved at anvende vekslende kirurgiske scrubs af jod-baserede løsning og 75% alkohol. Gentag processen 2x.
  10. Lav en langsgående indsnit spænder fra 0,5-1,0 cm på midterlinjen af maven.
  11. Ifølge den forudbestemte placering af coecum, nå coecum og forsigtigt exteriorize (~ 1 cm) for at identificere caecalis relativt patch. Brug en steril, forvarmet saltvandsopløsning af fysiologisk pH til at Hydrere tarmen.
    Bemærk: den caecalis relativt patch af en mus er en del af coecum og karakteriseret ved tilstedeværelsen af hvide ægformede follikler på overfladen.
  12. For at forebygge potentielle komplikationer af post-operative blødning og infektion, ligere de mesenteriske blodkar i coecum ved hjælp af 8-0 Sutur. Fugte coecum med sterilt saltvand.
  13. Marker resektion området ved hjælp af 4-0 sutur med en åben sløjfe nær spidsen af coecum ved det proximale kolon.
    Bemærk: mærkning af coecum med en åben sløjfe forhindrer også lækage af caecalis relativt indhold fra snittet.
  14. Afskåret caecalis relativt patch under den markerede resektion ved hjælp af mikro-saks og udslette det resterende caecalis relativt indhold med medicinske vatpinde. Derefter desinficere stump af coecum med jod-baserede krat.
  15. Luk stump med den løbende sutur ved hjælp af 8-0 Sutur.
  16. Fjern forsigtigt 4-0-tråds sløjfen, der tidligere blev brugt til at markere resektion ved stubbe af Caecum.
  17. Steriliser den suturerede position med jod-baseret krat. Rehydrere operationsstedet med saltvand igen.
  18. Luk muskulatur-laget med den løbende sutur ved hjælp af 8-0 sutur tråd.
  19. Luk hudlagene ved hjælp af afbrudte suturer med 4-0 sutur tråd.
  20. Desinficer det kirurgiske snit 2x med jod-baseret krat, fjern derefter jod ved hjælp af 75% medicinsk alkohol.
  21. Vend forsigtigt musen tilbage, subkutant (s.c.) Injicer 0,1 mg/kg legemsvægt af buprenorphin og 0,4 mL fysiologisk saltvand og lad musen hvile på varmepuden, indtil du vender tilbage til bevidstheden.
  22. Sæt musen tilbage til det sterile bur og nøje overvåge for tegn på smerte i 3 dage efter operationen for at sikre genopretning.
    Bemærk: der kan være behov for en post operativ anvendelse af 0,05 mg/kg buprenorphin til smertelindring af den enkelte mus. Lad mus til at komme sig i 7 dage efter operationen for yderligere induktion af colitis-associeret kolorektal cancer.

2. induktion af kronisk colitis-associeret kolorektal cancer med AOM og DSS

Bemærk: Udfør denne procedure 7 dage efter appendectomy.

  1. Forbered AOM stamopløsning ved at opløse 25 mg AOM i 2,5 mL 0,9% sterilt saltvand i en koncentration på 10 mg/mL.
    Bemærk: AOM er lysfølsom.
    1. Aliquot 2,5 mL tilberedt AOM stamopløsning i 5 mL glasrør indpakket med aluminiumsfolie og opbevares ved-20 °C hver gang ved brug.
    2. Tø én af AOM en gang, og fortynd den til en koncentration på 1 mg/mL med 0,9% sterilt saltvand (ratio 1:10).
      Forsigtig: AOM er yderst kræftfremkaldende; derfor udføre hele forberedelses proceduren i en røg hætte.
  2. 4 g DSS pulver opløses i 200 ml autoklaveres-vand for at tilberede 2% (w/v) DSS-opløsning.
    Bemærk: koncentrationen af DSS kan variere afhængigt af musens stamme, køn og induktionscyklus; 3% DSS kan anvendes til andre mus stammer.
  3. Samtidig administrere den frisklavede AOM/DSS til musene. Det gør du ved at følge nedenstående trin.
    1. Intraperitonealt injicerer 0,01 ml/g frisk tilberedt AOM-arbejdsopløsning for hver mus og erstatter autoklaveres-vandet med 2% DSS-opløsning i 5 dage ad libitum.
      Bemærk: hvert bur indeholder fem mus; Kontrollér regelmæssigt DSS-drikke flasken for at sikre, at der ikke opstår bundfald i behandlingsperioden.
    2. Vægt og nøje overvåge hver mus hver dag.
      Bemærk: under administrationen, aflive mus med op til 20% vægttab i forhold til dens oprindelige vægt eller tegn på Huddle, Squint, hypotermi, og dårlig aktivitet.
  4. Giv en frisk flaske autoklaveret vand på dagen 6 post-AOM/DSS administration indtil dag 21 (figur 1B).
    Bemærk: Dette er en komplet cyklus bestående af 21 dage.
  5. Gentag trin 2.3 – 2.4 for yderligere to cyklusser, og ofrer musene på dag 70.

3. vurdering af Colon betændelse og tumor (70 dage post-AOM administration)

  1. Ofrer musene ved CO2 indånding ved en påfyldningshastighed på 10% i eutanasi-kammeret efterfulgt af livmoderhals dislokation.
  2. Høst hele tyktarmen fra over den ileo-kolik krydset til anus.
  3. Eksponere lumen side ved at åbne tyktarmen længderetningen. Skær hele tyktarmen i 10 cm lange stykker og fastgør tyktarms vævet i 10% formalin for 72 h for hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering af murine appendectomy model

Denne murine appendectomy model af kronisk colitis associeret kolorektal cancer kan genereres ved at følge de sekventielle kirurgiske og induktions trin som illustreret i figur 1. De hyppigste positioner af coecum er i venstre og højre bækkenbens fossa efterfulgt af den midterste linje af maven (figur 2). Den vellykkede hastighed af præ-lokalisering af coecum forud for maven indsnit ved hjælp af palpering metode er næsten 70% (supplerende oplysninger, tabel S2). Appendectomy-procedurerne består hovedsageligt af seks vigtige trin (figur 3). I løbet af appendectomy kirurgi, en mellemlinie indsnit så lille som 0,5-1,0 cm i længden er afgørende for at minimere kirurgiske traumer (figur 3a). I tilfælde af intraperitoneal lækage, ligating mesangial fartøjer og lukke stump af coecum er nødvendige, ved hjælp af rindende suturer i stedet for simpel ligering (figur 3B, C, D, E).

Evaluering af IgA som en biomarkør i appendectomy mus

For at bekræfte appendectomy blev tyktarmen af mus og fækal indhold høstet efter operationen for at bestemme niveauerne af IgA specifikke plasmaceller og sekretoriske IgA (sIgA) koncentrationer. Appendectomy-musene udviste en signifikant reduktion i procentdelen af B220-IgA + specifikke plasmaceller sammenlignet med Sham-gruppen (figur 4a, B). Desuden, sammenlignet med deres egen oprindelige tilstand forud for kirurgi, Sham mus vedligeholdt fækal siga koncentrationen over 14 dage efter operationen, hvorimod appendectomy gruppe viste en signifikant slga reduktion på dag 14 (figur 4C).

Validering af colitis-associeret kolorektal cancer i appendectomy mus

Sammenlignet med 3% DSS, hvor de fleste mus i appendectomy-gruppen viste alvorlige komplikationer og signifikant vægttab (figur 5A), gav 2% DSS i kombination med AOM 80% af overlevelsesraten i både Sham-og appendectomy-grupperne, med ændringer i legemsvægten (figur 5E). I slutningen af tre behandlingscyklusser blev tyktarmen i fuld længde høstet til patologisk vurdering. Visuel inspektion og H & E farvning viste de koloniske tumorer med tyktarmsbetændelse og forskellige grader af adenokarcinomer (godt, moderat og dårligt differentierede adenokarcinomer) hos mus behandlet med 2% AOM/DSS (figur 6).

Figure 1
Figur 1: skematisk illustration af at etablere murine appendectomy model af kronisk colitis-associeret kolorektal cancer.
(A) et flowdiagram af de vigtigste kirurgiske trin (de første tre er kritiske) af appendectomy procedure. B) induktion af kolorektal cancer. Syv dage efter appendectomy blev AOM og DSS administreret samtidigt. Mus vægte blev indspillet på forskellige tidspunkter (rød trekant). På dag 70 post-kirurgi, mus blev ofret, og tarm væv blev høstet til yderligere vurderinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Præbestemmelse af caecalis relativt patch placering i mus før abdominal incision.
A) sammenfatning af sandsynligheden for at finde en coecum-position. Anatomiske billeder af tre mest almindelige positioner af coecum på (B) lav højre, (C) midterste, og (D) lav venstre mave af musen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kritiske trin af murine appendectomy.
(A) lille snit anbragt 0,5 – 1,0 cm; B) at trække den nøjagtige del af caecalis relativt-plasteret ud efter et af caecums præposition. C) ligering af mesenteriske fartøjer, der ledsager Caecum. D) mærkning af skæreområdet i coecum med 4-0 sutur. E) lukning af stump med løbe suturer ved hjælp af 8-0 Sutur. F) lukning af muskulære lag med afbrudte suturer ved hjælp af 8-0 Sutur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: kvantificering af IgA specifikke plasmaer celler og fækal siga koncentration efter appendectomy.
(A) repræsentative dot plots for celler farvet med anti-IgA og B220 i hele tyktarmen af Sham og appendectomy mus 1 dag og 14 dage efter operationen. Lymfocytter i lamina propria var frisklavede og farvede med FITC anti-Mouse IgA, PE anti-mus CD45R/B220 til flow cytometri. Tal inden for observationsområderne angiver procentdele af cellerne i de respektive områder. B) kvantitativ bestemmelse af IgA-specifikke plasmaceller i Sham-og appendectomy-grupper. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD; n = 5 – 8 mus; * p < 0,05, * * p < 0,01 og * * * p < 0,001. C) fækale siga-koncentrationer før og efter operationen. Fækal indholdet blev indsamlet på udpegede tidspunkter, og niveauerne af sIgA blev testet af ELISA. Hver farve prik repræsenterer den samme mus over en periode på 14 dage. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en ikke-parret t-test, hvor p < 0,05 blev anset for statistisk signifikant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: dyrs overlevelse status af kronisk colitis-associeret kolorektal cancer murine model induceret af AOM/DSS kombination efter appendectomy.
(A) overlevelses kurven opnået ved hjælp af 3% DSS for colitis induktion i Sham og appendectomy grupper. Alvorlige komplikationer af anal prolaps (B) og vægmaleri byld indikerede endepunktet af dyret (C). D) overlevelses kurven opnået ved hjælp af 2% DSS for colitis induktion i Sham-og appendectomy-grupper (E) gennemsnitlig kropsvægt ændring af mus over 70 dage. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD, n = 6 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: billeder af kronisk colitis-associerede kolorektal tumorer induceret ved kombinationsbehandling af 2% DSS og 10 mg/kg AOM.
Fotografier af det dissekeret kolon med tumorer under (A) visuel inspektion og (B) Animal operation mikroskop. H & E farvning billeder af Colon væv viser (C) Colon inflammation, (D) veldifferentieret adenokarcinom, (E) moderat differentieret adenokarcinom, og (F) meget differentieret adenokarcinom. Sort pil indikerer slimhinde sår, sort pilespids indikerer adenocarcinoma, Hvid pil indikerer neutrofilinfiltration mellem kirtler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: litteratur Resumé af kirurgiske metoder, der anvendes til blindtarmsbetændelse induktion i almindeligt anvendte mus stammer. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: placering af coecum i mus efter laparotomi. Eksponerede organ efter indsnit indikerer organ fundet direkte ved den præ-placeret position efter laparotomi. Placeringen af coecum viser coecum placering i forhold til maveregionen/coecum position i forhold til tarmen. Eksponeret indikerer, at coecum var under det muskuløse lag af maven og over andre dele af tarmen. Indlejret indikerer, at coecum var dækket af tarmen. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En murine appendectomy model af colitis-associeret kolorektal cancer blev opnået ved hjælp af kirurgiske trin med en høj overlevelsesrate i mus. I de fleste tilfælde, da coecum var placeret under bugvæggen (supplerende tabel 1, supplerende tabel 2, og figur 2), var det vanskeligt at foregribe dets placering uden laparotomi. I denne kirurgiske protokol blev der indført et let trin med berøring af bump, og den kvantitative evaluering af cecum-placeringen blev også givet som vejledning til at øge præcisionen for præ-lokalisering af cecum (figur 2). Udnyttelsen af anatomiske funktioner til at fjerne caecalis relativt patch minimeret afbrydelse af utilsigtede dele af tarmen, og derved nedsætte hastigheden af potentielle komplikationer af appendectomy og infektion i bughulen.

Tre kritiske trin er involveret i denne model. Første, visuel undersøgelse og palpering forud for laparotomi kan være nyttigt at bestemme den generelle placering af Caecum. Trods det faktum, at coecum er mest sandsynligt til stede på venstre bækkenbens region af maven, den caecalis relativt patch fremspringende fra spidsen af coecum er ofte dissociative (dvs. flytte rundt eller indlejret) og er mere tilbøjelige til at blive fundet under den midterste bughinden ( Figur 2). For det andet, et lille snit på den midterste linje i maven og nøjagtig eksponering af caecalis relativt patch foretrækkes. Dette skyldes, at der er en tynd plet på den midterste linje i maven, hvor opskæring i denne position kan mindske potentiel skade af abdominal muskulatur lag. Desuden for at undgå Tarmslyng på appendectomy, som er skadelig for mus, nøjagtig eksponering af caecalis relativt patch minimerer utilsigtet forstyrrelse af tarmen, reducere risikoen for tarm forekomst. Desuden kan minimal eksponering af bughulen sikre, at tarmen forbliver uforurenet, varm og fugtig; ellers kan overdreven eksponering forårsage betydelige varmetab og tørring af væv41.

For det tredje er desinfektion og lukning af den caecalis relativt stump med rindende suturer i stedet for simpel ligering nødvendig for at forhindre potentiel blødning og desinfektion af caecalis relativt indholdet af stump. Niveauet af IgA-specifikke plasmaceller og fækal sIgA i tyktarmen af mus er væsentligt reduceret ved en appendectomy, tyder på, at caecalis relativt patch er det vigtigste sted for produktion af IgA i det mindste i den indledende periode33. I tyktarmen, siga fungere som en slimhinde sundhed forsvarer ved at stabilisere den normale kolonisering af kommensal flora og modvirkende patogene mikrober42. Fjernelse af tillægget reducerer produktionen af IgA og kan forstyrre slimhinde homøostase.

Den høje dødelighed og kliniske tegn på overdreven colitis induktion (dvs. svær blodig afføring, anal prolaps, og abdominal byld43,44) blev observeret hos mus behandlet med 3% DSS (figur 5). Men, 2% DSS induktion efter tre cyklusser forårsagede ingen af disse komplikationer, og overlevelsesraten blev opretholdt over 80%. Dette indikerer, at den kombinerede brug af DSS og AOM bør valideres, da den manglende integritet GALTs kan til en vis grad reducere tolerancen af mus til AOM og DSS kombination. Observationsmæssige undersøgelser fra klinisk evidens tyder på, at tillægget er stærkt forbundet med udviklingen af IBD og kolorektal cancer14,45,46. Men de biologiske funktioner og underliggende mekanismer i tillægget i patogenesen af kroniske tarmsygdomme er stadig uklart. Det fremgår, at tillægget fungerer som en vigtig del af Galts og som et reservoir for Gut kommensal flora til at regulere sundhed eller syge stater17,18,31. Oprettelse af denne gentagelig og omkostningseffektiv murine appendectomy model kan bruges til at studere rollerne i tillægget i IBD og kolorektal cancer i forbindelse med mikrobiota homøostase, Kræftforebyggelse, og immunterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er delvist understøttet af grundlæggende forskningsmidler til central University (G2018KY0302), University grundlæggende forskning Udviklingsfond (KT00062), National Natural Science Foundation i Kina (81870380), og klinisk forskning tildeling af Første tilknyttet Hospital i Xi'an Jiaotong University i Kina (nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). Forfatterne takke Dr. Chengxin Shi for hans tekniske forslag i den tidlige udforskning fase af murine appendectomy model, samt patolog Dr. XI Liu for evaluering af H & E farvning resultater af colitis og kolorektal tumorer. Y.L. udførte kirurgi demonstration, gjorde dataanalyse, og skrev udkastet til manuskriptet; J.L., G.L., Z.P. og Y.M. deltog i den kirurgiske forberedelse, vævs samlinger og video produktion; M.Z. udførte flowcytometri og ELISA; Q.W. og H.X. leverede teknisk støtte til at generere en klinisk relevant murine model; R.X.Z. designede studiet, overvågede forskningen og skrev og sikrede manuskriptet; J.S. gennemgik manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azoxymethane(AOM) Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. Appendicitis. , at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
  4. On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. , at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

Medicin murine model appendiks caecalis relativt patch gastrointestinal anatomi tyktarm tumor IgA azoxymethane dextran sulfat natrium IBD
Murine appendectomy model af kronisk colitis associeret kolorektal cancer ved præcis lokalisering af Caecal patch
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z.,… More

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter