Summary
Het gepresenteerde protocol beschrijft een facile chirurgische verwijdering van de appendix (caecal patch) in een muis gevolgd door de inductie van inflammatoire darmziekte-geassocieerde colorectale kanker. Dit Murine appendectomie model maakt onderzoek mogelijk naar de biologische rol van de appendix in de pathogenese van menselijke gastro-intestinale aandoeningen.
Abstract
De humane appendix is recentelijk betrokken bij het spelen van belangrijke biologische rollen in de pathogenese van verschillende complexe ziekten, zoals colorectale kanker, inflammatoire darmziekte, en de ziekte van Parkinson. Om de functie van het aanhangsel te bestuderen, is een met darmziekte geassocieerd muriene appendectomie-model vastgesteld en wordt het stapsgewijze protocol hier beschreven. Dit rapport introduceert een facile protocol voor het verwijderen van ileocaecale patch in muizen, gevolgd door de chemische inductie van chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker met behulp van een combinatie van dextran sulfaat natrium (DSS) en azoxymethaan (AOM). IgA-specifieke cellen en IgA-concentratie werden significant verlaagd bij het verwijderen van de ileocaecale-pleister bij mannelijke C57BL/6-muizen in vergelijking met die in de Sham-groep. Gelijktijdige toediening van 2% DSS en AOM resulteerde in bijna 80% overleving van muizen in zowel Sham-als appendectomie groepen zonder significant lichaamsgewicht verlies. Histologische resultaten bevestigden Colon ontsteking en verschillende gradaties van adenocarcinoom. Dit model kan worden gebruikt voor de studie van de functionele rol van de Appendix bij het handhaven van gut microbiota homeostase en pathogenese van gut colitis en maligniteiten, evenals voor de potentiële ontwikkeling van drug targeting therapieën.
Introduction
De klinische appendectomie is een standaard chirurgische ingreep waarbij het aanhangsel wordt verwijderd, voornamelijk als gevolg van een ontsteking (bijv. appendicitis)1,2,3. De biologische functie van het wormvormig humane aanhangsel blijft echter controversieel4,5,6. De appendix wordt beschouwd als een overblijfsel van de blindedarm die uitstekt uit de blindedarm in de dikke darmen. Tot voor kort hebben evolutionaire, immunologische, morfologische en microbiologische studies gesuggereerd dat de appendix verschillende functies kan bezitten. Deze rollen omvatten de productie van bloed (bijv. Iga en IgG), een verscheidenheid aan B-cellen en T-cellen die kritisch zijn voor adaptieve immuunresponsen binnen de met de darm geassocieerde lymfoïde weefsels (galts), en de aanvulling van de dikke darm met commensale microbiotas 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.
Klinisch epidemiologisch onderzoek bij patiënten met een voorafgaande appendectomie of acute blindedarmontsteking heeft ook zijn potentiële rol in de pathogenese van menselijke ziekten onthuld, zoals ontstekingsdarmziekte (IBD), colorectale kanker en niet-gastro-intestinale aandoeningen (bijv. de ziekte van Parkinson en hart-en vaatziekten)13,14,15,16,17,18. Bijvoorbeeld, een grote Aziatische populatie cohortstudie met 75.979 appendectomie patiënten toonde onlangs een significante associatie tussen appendectomie en latere ontwikkeling van colorectale kanker, een van de meest voorkomende maligniteiten met een hoge incidentie en sterfte14,19. Dienovereenkomstig zal het vaststellen van een geschikt dier appendectomie-model dat lijkt op een mens nuttig zijn om de biologische functies en moleculaire mechanismen van het aanhangsel bij de pathogenese van de ziekte te onderzoeken.
Veel zoogdieren bezitten een aanhangsel of aanhangsel-achtige orgel, met inbegrip van primaten, lagomorfen (bijvoorbeeld konijnen), sommige knaagdieren, en marsupien20. Voor kleine en veelgebruikte proefdieren bezit het konijn de vermiforme Appendix morfologisch gelijkend op de menselijke21,22, maar Galt in het konijn is extreem groot in vergelijking met die bij mensen, aangezien de meerderheid van lymfoïde weefsels zijn ook te vinden in Peyer's patches gelegen in zowel kleine als grote darmen21. Daarnaast vertoont het konijn een verschillende lymfoïde Folliculaire structuur, T-celverdeling en immunoglobulindichtheid van de mens, wat het bestuderen van hun aanhangsels ongepast maakt21.
Muizen zijn het meest gebruikte diermodel om menselijke pathofysiologie te bestuderen en de verschillende bestaande en nieuwe therapuetics te testen23,24,25. De enkele witte grote lymfoïde cluster aan de Apex van het caecum in muizen, bekend als de ileocaecale patch, wordt verondersteld functies uit te voeren die vergelijkbaar zijn met de humane Appendix26,27,28. Toch is het praktisch moeilijk om de ileocaecale-pleister van caecum in muizen te scheiden. Tot nu toe hebben de gemeenschappelijke chirurgische procedures voor het induceren van blindedarmontsteking in een muismodel een relatief grote incisie (bijv. 1 – 2 cm) door de buikwand om toegang te krijgen tot het gehele caecum (aanvullende tabel 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.
Hierin, voor het genereren van een appendectomie model geassocieerd met gastro-intestinale ziekten, dit verslag presenteert een faciele chirurgische protocol voor ileocaecale patch verwijdering in muizen. Dit wordt gevolgd door de gecombineerde toediening van de genotoxische agent AOM en pro-inflammatoire agent DSS voor de inductie van colitis-geassocieerde colorectale kanker vergelijkbaar met die gezien bij de mens. Er is aangetoond dat IBD een risicofactor is van darmkanker37,38. De combinatie van AOM/DSS-geïnduceerde chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker is goed vastgesteld, en lezers kunnen verwijzen naar neufert et al., en thaker et al. voor gedetailleerde procedures39,40. Dit reproduceerbare en snelle Murine appendectomie model kan worden gebruikt voor de studie van aanhangsel-gemoduleerde darmontsteking en Colon microbiota, vooral in de ontwikkeling en progressie van IBD en colorectale kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Xi'an Jiaotong (nr. XJTULAC2019-1023).
1. muizen appendectomie
- Huis 8 – 10 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen in een gecertificeerde specifieke-pathogeen vrije (SPF) omgeving voor 1 week voorafgaand aan de operatie.
- Bereid de volgende steriele chirurgische instrumenten voor: één paar micro-schaar, één paar micro-Tang, twee maten (4-0 en 8-0) van gesteriliseerde niet-absorbabele hechtingen, een elektrische coagulatie pen met naald houder, 75% medische alcohol, scrub op basis van jodium ( bijvoorbeeld, entojodium), en een pakket van steriele wattenstaafjes.
- Vul een injectiespuit van 10 mL met voorverwarmde 0,9% fysiologische zoutoplossing voor de abdominale spoeling en hydratatie tijdens de operatie.
- Anesthetiseer een niet-gefaalde muis intraperitoneaal (i.p.) met 1% natriumpentobarbital in een dosis van 100 mg/kg. Controleer op de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op pedaal reflexen.
Opmerking: een enkelvoudige verdovings dosis wordt toegediend om een volledig kalmerend effect in de muis te garanderen. Onder de omstandigheid van korte procedures kan 50 mg/kg natrium pentobarbital i.p. voldoende zijn. - Scheer het buikhaar voorzichtig met een elektrisch scheerapparaat.
- Leg de muis op het verwarmingspaneel om hypothermie te voorkomen.
- Bevestig de muis op een platform in rugligging door vier stroken medische plakband over de ledematen te plaatsen om de postale beweging tijdens de operatie te voorkomen.
- Raak de hele buik zachtjes aan om het gevoel van een hobbel te vinden.
Opmerking: in de meeste gevallen geeft het gevoel van een hobbel altijd de exacte positie van het caecum aan. Om mogelijke schade aan de rest van de darm te voorkomen, is deze pre-lokaliseren van het caecum voorafgaand aan de buik incisie belangrijk. - Bedek met een steriele draperen en Desinfecteer het geschoren gebied van de buik door het aanbrengen van alternerende chirurgische Scrubs van jodium gebaseerde oplossing en 75% alcohol. Herhaal het proces 2x.
- Maak een longitudinale incisie variërend van 0,5 – 1,0 cm bij de middenlijn van de buik.
- Volgens de vooraf bepaalde locatie van het caecum, bereik het caecum en voorzichtig exteriorize (~ 1 cm) om de ileocaecale patch te identificeren. Gebruik een steriele, voorverwarmde zoutoplossing van fysiologische pH om de darm te hydrateren.
Opmerking: de ileocaecale patch van een muis maakt deel uit van het caecum en wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van witte eivormige follikels op het oppervlak. - Om mogelijke complicaties van de postoperatieve bloeding en infectie te voorkomen, ligeren de mesenterische bloedvaten van het caecum met behulp van de 8-0 hecht. Hydrateer het caecum met steriele zoutoplossing.
- Markeer de resectie regio met behulp van de 4-0 hechtmiddel met een open lus in de buurt van de Apex van het caecum aan de proximale Colon.
Opmerking: het markeren van het caecum met een open lus voorkomt ook lekkage van caecale inhoud van de snede. - Knip de ileocaecale patch af onder de gemarkeerde resectie met behulp van micro-schaar en veeg het resterende caecale gehalte uit met medische wattenstaafjes. Desinfecteer vervolgens de stronk van caecum met scrub op basis van jodium.
- Sluit de stomp met de actieve hechting met behulp van de 8-0 hecht.
- Verwijder voorzichtig de 4-0 schroefdraad lus die eerder werd gebruikt voor het markeren van de resectie bij de stronk van het caecum.
- Steriliseer de gehecht positie met scrub op basis van jodium. Opnieuw hydrateren de operatieplaats met zoutoplossing.
- Sluit de spieren-laag met de actieve hechting met behulp van 8-0 hechtdraad.
- Sluit de huidlagen met onderbroken hechtingen met 4-0 hechtdraad.
- Desinfecteer de chirurgische snede 2x met scrub op basis van jodium en verwijder vervolgens jodium met 75% medische alcohol.
- Draai de muis voorzichtig terug, subcutaan (s.c.) Injecteer 0,1 mg/kg lichaamsgewicht van buprenorfine en 0,4 mL fysiologische zoutoplossing en laat de muis rusten op de warmte pad tot het bewustzijn terugkeert.
- Plaats de muis terug in de steriele kooi en bewaak nauwgezet de tekenen van pijn gedurende 3 dagen na de operatie om herstel te garanderen.
Opmerking: na de operatieve toepassing van 0,05 mg/kg buprenorfine kan nodig zijn voor pijnverlichting van de individuele muis. Laat muizen 7 dagen na de operatie herstellen voor verdere inductie van colitis-geassocieerde colorectale kanker.
2. inductie van chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker met AOM en DSS
Opmerking: Voer deze procedure uit 7 dagen na appendectomie.
- Bereid AOM-stamoplossing voor door 25 mg AOM te lossen in 2,5 mL 0,9% steriele zoutpan met een concentratie van 10 mg/mL.
Opmerking: AOM is lichtgevoelig.- Aliquot 2,5 mL bereide AOM-stamoplossing in glazen buisjes van 5 mL, verpakt met aluminiumfolie en bij-20 °C bewaren bij gebruik.
- Ontdooi één aliquot van AOM eenmaal en Verdun het tot een concentratie van 1 mg/mL met 0,9% steriele zoutoplossing (ratio 1:10).
Let op: AOM is uiterst kankerverwekkend; Voer daarom de hele voorbereidingsprocedure uit in een rook afzuigkap.
- Los 4 g DSS poeder op in 200 mL geautoclaveerd water om 2% (w/v) DSS oplossing te bereiden.
Opmerking: de concentratie van DSS kan variëren afhankelijk van de muis stam, geslacht en inductie cyclus; voor andere muizenstammen kan 3% DSS worden gebruikt. - Dien de vers bereide AOM/DSS gelijktijdig toe aan de muizen. Hiertoe volgt u de onderstaande stappen.
- Intraperitoneaal injecteert 0,01 mL/g vers bereide AOM-werkoplossing voor elke muis en vervangt het geautoclaveerd water met 2% DSS oplossing gedurende 5 dagen ad libitum.
Opmerking: elke kooi bevat vijf muizen; Controleer regelmatig de DSS drinkfles om er zeker van te zijn dat er geen precipitaat optreedt tijdens de behandelperiode. - Gewicht en nauwlettend bewaken elke muis elke dag.
Opmerking: tijdens de toediening worden muizen met maximaal 20% gewichtsverlies geëerd in vergelijking met het aanvankelijke gewicht of de verschijnselen van de Huddle, squint, hypothermie en slechte activiteit.
- Intraperitoneaal injecteert 0,01 mL/g vers bereide AOM-werkoplossing voor elke muis en vervangt het geautoclaveerd water met 2% DSS oplossing gedurende 5 dagen ad libitum.
- Zorg voor een verse fles geautoclaveerd water op dag 6 post-AOM/DSS administratie tot dag 21 (Figuur 1B).
Let op: dit is een complete cyclus bestaande uit 21 dagen. - Herhaal stap 2.3 – 2.4 voor nog eens twee cycli en offer de muizen op dag 70.
3. beoordeling van de Colon ontsteking en tumor (70 dagen na AOM toediening)
- Opofferen van de muizen door co2 inademing met een vullingsgraad van 10% in de euthanasie kamer gevolgd door cervicale dislocatie.
- Oogst de gehele dikke darm van boven de ileo-koliek kruising met de anus.
- Stel de lumen zijde bloot door de dikke darm longitudinaal te openen. Snijd de hele dikke darm in 10 cm lange stukken en bevestig het Colon weefsel in 10% formaline voor 72 h voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprichting van een Murine appendectomie model
Dit Murine appendectomie model van chronische colitis geassocieerde colorectale kanker kan worden gegenereerd door het volgen van de sequentiële chirurgische en inductie stappen zoals geïllustreerd in Figuur 1. De meest frequente posities van caecum zijn in de linker en rechter iliacale Fossa gevolgd door de middelste lijn van de buik (Figuur 2). Het succesvolle tarief van pre-lokalisatie van caecum voorafgaand aan de incisie van de buik met behulp van de palpatie methode is bijna 70% (aanvullende informatie, tabel S2). De appendectomie-procedures bestaan hoofdzakelijk uit zes belangrijke stappen (Figuur 3). Tijdens de appendectomie chirurgie is een middellijn incisie zo klein als 0,5 – 1,0 cm in lengte essentieel om chirurgisch trauma te minimaliseren (Figuur 3a). In het geval van intraperitoneale lekkage zijn ligende mesangiale vaten en het sluiten van de stomp van het caecum noodzakelijk, met behulp van hechtingen in plaats van eenvoudige ligatie (Figuur 3B, C, D, E).
Evaluatie van IgA als biomarker in aanhangdodectomie muizen
Om de appendectomie te bevestigen, werd de dikke darm van muizen en fecale inhoud na de operatie geoogst om de niveaus van IgA specifieke plasmacellen en secretoire IgA (sIgA) concentraties te bepalen. De appendectomie muizen vertoonden een significante afname van het percentage van B220-IgA + specifieke plasmacellen in vergelijking met de Sham-groep (Figuur 4a, B). Bovendien, in vergelijking met hun eigen initiële toestand voorafgaand aan de operatie, bleef Sham muizen de fecale sIgA-concentratie gedurende 14 dagen na de operatie onderhouden, terwijl de appendectomie-groep een significante slgA-reductie toonde op dag 14 (Figuur 4C).
Validatie van colitis-geassocieerde colorectale kanker in appendectomie muizen
Vergeleken met 3% DSS, waarbij de meeste muizen in de appendectomie groep ernstige complicaties en significant gewichtsverlies vertoonden (Figuur 5A), bedroeg 2% DSS in combinatie met AOM 80% van het overlevingspercentage in zowel Sham-als appendectomie groepen, met redelijke veranderingen in het lichaamsgewicht (Figuur 5E). Aan het einde van drie behandelingscycli werd de grote darm over de hele lengte geoogst voor pathologische beoordeling. Visuele inspectie en H & E kleuring toonde de Colon tumoren met darmontsteking en verschillende gradaties van adenocarcinomen (goed-, matig-, en slecht gedifferentieerde adenocarcinomen) bij muizen behandeld met 2% AOM/DSS (Figuur 6).
Figuur 1: Schematische illustratie van het tot stand brengen van Murine appendectomie model van chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker.
A) eenstroomschema van de belangrijkste chirurgische stappen (eerste drie zijn kritisch) van de appendectomie-procedure. B) inductie van colorectale kanker. Zeven dagen na de appendectomie werden AOM en DSS gelijktijdig toegediend. Muizen gewichten werden op verschillende tijdstippen opgenomen (rode driehoek). Op dag 70 na de operatie werden muizen geofferd en werden darm weefsels geoogst voor verdere evaluaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: voor bepaling van de locatie van de ileocaecale pleister in muizen voorafgaand aan de buik incisie.
A) samenvatting van de waarschijnlijkheid van het vinden van een caecum positie. Anatomische beelden van drie meest voorkomende posities van het caecum aan de (B) laag rechts, (C) midden, en (D) laag linker onderbuik van de muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: kritische stappen van Murine appendectomie.
A) kleine incisie, gerangschikt 0.5 – 1,0 cm; (B) het exacte gedeelte van de ileocaecale-pleister uittrekken na de voor positie van het caecum. C) ligatie van mesenterische vaartuigen die het caecum vergezellen. D) het snijgebied van het caecum markeren met de 4-0 hechtdraad. E) sluiten van de stronk met draaiende hechtingen met gebruikmaking van de 8-0 hecht. F) de gespierde laag met onderbroken hechtingen sluiten met behulp van de 8-0 hecht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kwantificering van IgA-specifieke plasma's-cellen en fecale sIgA-concentratie na appendectomie.
A) representatieve punt plots voor cellen die zijn gekleurd met anti-Iga en B220 in de hele dikke darm van Sham en appendectomie muizen 1 dag en 14 dagen na de operatie. Lymfocyten in lamina propria werden vers bereid en gekleurd met FITC anti-muis IgA, PE anti-muis CD45R/B220 voor flow cytometrie. Getallen in percelen geven percentages van cellen in de respectieve gebieden aan; B) kwantitatieve bepaling van IgA-specifieke plasmacellen in de Sham-en appendectomie-groepen. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD; n = 5 – 8 muizen; * p < 0,05, * * p < 0,01, en * * * p < 0,001. C) fecale SIGA-concentraties voor en na de operatie. Fecale gehalten werden verzameld op aangewezen tijdstippen, en de niveaus van sIgA werden getest door ELISA. Elke kleur stip vertegenwoordigt dezelfde muis gedurende een periode van 14 dagen. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde t-toets, waarbij p < 0,05 statistisch significant werd geacht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: dierlijke overlevings status van chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker Murine model geïnduceerd door AOM/DSS combinatie na appendectomie.
A) de overlevings curve die is verkregen met 3% DSS voor de inductie van colitis in de placebo-en appendectomie groepen. Ernstige complicaties van anale verzakking (B) en muurschildering abces aangegeven het eindpunt van het dier (C). D) de overlevings curve die is verkregen met 2% DSS voor de inductie van colitis in de Sham-en appendectomie-groepen; E) gemiddelde verandering in lichaamsgewicht van muizen gedurende 70 dagen. De gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD, n = 6 muizen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: beelden van chronische colitis-geassocieerde colorectale tumoren geïnduceerd door combinatiebehandeling van 2% DSS en 10 mg/kg AOM.
Foto's van de ontleed Colon met tumoren onder (a) visuele inspectie en (B) dier operatie Microscoop. H & E kleurings beelden van Colon weefsels met (C) Colon ontsteking, (D) goed gedifferentieerd adenocarcinoom, (E) matig gedifferentieerd adenocarcinoom en (F) sterk gedifferentieerde adenocarcinoom. Zwarte pijl geeft de mucosale Ulcus aan, zwarte pijlpunt geeft adenocarcinoom aan, wit pijltje geeft neutrofiele infiltratie tussen klieren aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende tabel 1: literatuuroverzicht van chirurgische methoden die worden gebruikt voor de inductie van blindedarmontsteking in veelgebruikte muizenstammen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: locaties van het caecum in muizen na laparotomie. Blootgesteld orgel na incisie geeft het orgel direct gevonden op de vooraf gelegen positie na laparotomie. De positie van het caecum toont de caecum locatie ten opzichte van de buikstreek/de caecum positie ten opzichte van de darm. Blootstelling geeft aan dat het caecum onder de gespierde laag van de buik en boven andere delen van de darm lag. Embedded geeft aan dat het caecum werd bedekt door de darm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een Murine appendectomie model van colitis-geassocieerde colorectale kanker werd verkregen met behulp van chirurgische stappen met een hoog overlevingspercentage bij muizen. In de meeste gevallen, omdat het caecum onder de buikwand werd geplaatst (aanvullende tabel 1, aanvullende tabel 2, en Figuur 2), was het moeilijk om de locatie te prebeoordelen zonder laparotomie. In dit chirurgische protocol werd een eenvoudige stap van het aanraken van de hobbel geïntroduceerd, en de kwantitatieve evaluatie van de blindedarm-locatie was ook bedoeld als leidraad om de precisie voor de voor lokalisatie van de blindedarm te verhogen (Figuur 2). De exploitatie van anatomische functies om de ileocaecale patch geminimaliseerd verstoring van onbedoelde delen van de darm te verwijderen, waardoor de snelheid van mogelijke complicaties van appendectomie en infectie van de buikholte te verminderen.
Er zijn drie kritieke stappen bij dit model betrokken. Eerst kan visueel onderzoek en palpatie voorafgaand aan laparotomie nuttig zijn om de algemene locatie van het caecum te bepalen. Ondanks het feit dat het caecum hoogstwaarschijnlijk aanwezig is op het linker iliacale gebied van de buik, is de ileocaecale-patch die uitsteekt van de Apex van het caecum vaak dissociatief (d.w.z. verplaatsen of ingebed) en is meer kans om te worden gevonden onder het middelste peritoneum ( Figuur 2). Ten tweede, een kleine incisie op de middelste lijn van de buik en nauwkeurige blootstelling van ileocaecale patch heeft de voorkeur. Dit is omdat er een dunne vlek op de middelste lijn van de buik, waarbij het snijden in deze positie kan het potentiële letsel van de abdominale spieren laag verminderen. Bovendien, om te voorkomen dat de volvulus op appendectomie, die schadelijk is voor muizen, nauwkeurige blootstelling van de ileocaecale pleister minimaliseert de onbedoelde verstoring van de darm, vermindering van het risico van volvulus optreden. Bovendien kan een minimale blootstelling van de buikholte ervoor zorgen dat de darm onbesmet, warm en vochtig blijft; anders kan overmatige blootstelling leiden tot significant warmteverlies en drogen van weefsels41.
Ten derde, desinfectie en sluiting van de ileocaecale stomp met lopende hechtingen in plaats van eenvoudige ligatie zijn nodig om te voorkomen dat potentiële bloeden en ontsmetting van de caecale inhoud van de stomp. Het niveau van IgA-specifieke plasmacellen en fecale sIgA in de dikke darm van muizen zijn aanzienlijk verminderd door een appendectomie, wat suggereert dat de ileocaecale patch is de belangrijkste plaats voor de productie van IgA ten minste in de eerste periode33. In de dikke darm, sIgA functie als een mucosale gezondheid verdediger door het stabiliseren van de normale kolonisatie van commensale flora en tegenwerken pathogene microben42. Verwijdering van de appendix vermindert de productie van IgA en kan de mucosale homeostase verstoren.
De hoge sterftecijfers en klinische verschijnselen van overmatige colitis inductie (d.w.z. ernstige bloederige ontlasting, anale verzakking en abdominale abces43,44) werden waargenomen bij muizen behandeld met 3% DSS (Figuur 5). Echter, 2% DSS inductie na drie cycli veroorzaakt geen van deze complicaties, en de overlevingskans werd gehandhaafd boven 80%. Dit geeft aan dat het gecombineerde gebruik van DSS en AOM moet worden gevalideerd, omdat het gebrek aan integriteit van GALTs tot op zekere hoogte de tolerantie van muizen tot de AOM-en DSS-combinatie kan verminderen. De observationele studies van klinisch gebaseerd bewijs wijzen erop dat het aanhangsel sterk geassocieerd is met de ontwikkeling van IBD en colorectale kanker14,45,46. De biologische functies en onderliggende mechanismen van het aanhangsel bij de pathogenese van chronische darmziekten zijn echter nog onduidelijk. Het lijkt erop dat de appendix fungeert als een belangrijk onderdeel van galts en als een reservoir voor gut commensale flora om gezondheid of zieke Staten te reguleren17,18,31. Het vaststellen van Dit herhaalbare en kosteneffectieve Murine appendectomie model kan worden gebruikt voor het bestuderen van de rollen van de appendix in IBD en colorectale kanker in de context van microbiota homeostase, kankerpreventie, en immunotherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door fundamentele onderzoeksfondsen voor de Centrale Universiteit (G2018KY0302), het universitair fundamenteel onderzoek van het Ontwikkelingsfonds (KT00062), de National Natural Science Foundation of China (81870380) en de Clinical Research Award van de Eerste aangesloten ziekenhuis van Xi'an Jiaotong University in China (nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). De auteurs bedanken Dr. Chengxin Shi voor zijn technische suggesties tijdens de vroege exploratiefase van de Murine appendectomie model, evenals de patholoog Dr. XI Liu voor evaluatie van H & E kleuring resultaten van colitis en colorectale tumoren. Y.L. voerde de chirurgische demonstratie uit, deed gegevensanalyse en schreef het ontwerp van het manuscript; J.L., G.L., Z.P. en Y.M. namen deel aan de chirurgische voorbereiding, weefsel collecties en videoproductie; Hij voerde de flow cytometrie en ELISA uit; Q.W. page en H.X. op voorwaarde dat de technische ondersteuning van het genereren van een klinisch relevant Murine model; R.X.Z. ontwierp de studie, begeleidde het onderzoek en schreef en verzorgde het manuscript; J.S. heeft het manuscript bekeken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane(AOM) | Sigma-Aldrich,Inc. | A5486 | |
| Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) | MP Biomedicals,Inc. | 160110 | |
| Entoiodine | Shanghai likon high technology disinfection co. LTD | 310102 | |
| digital caliper | Ningbo yuanneng trading co. LTD | 4859263 | |
| 4-0 Silk Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| 8-0 Prolene Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| Electric coagulation pen | Chuang mei medical equipment co. LTD | 28221777292 | |
| disposable syringe 1ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| disposable syringe 10ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| 75% Medicinal alcohol | Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD | 371402AAJ008 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich,Inc. | 57-33-0 | |
| Physiological Saline | Shandong qidu pharmaceutical co. LTD | H37020766 | |
| Absorbent Cotton Swab | Henan ruike medical co., LTD | RK051 | |
| Surgical Instruments-Ophthalmic | Jinzhong Shanghai co.LTD | WA3050 |
References
- Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
- Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
- Mayo Clinic. Appendicitis. , at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
- On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
- Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
- Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
- Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
- Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
- Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
- Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
- Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
- Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
- Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
- Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
- Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
- Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
- Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
- Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
- Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
- Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
- Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
- Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
- Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
- Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
- Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
- Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
- Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
- Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
- Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
- Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
- Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
- Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
- Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
- Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
- Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. , at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
- Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
- Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
- Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
- Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
- Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
- Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
- Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).
