Summary
O protocolo apresentado descreve uma remoção cirúrgica facile do apêndice (remendo caecal) em um rato seguido pela indução do cancro colorretal da doença de entranhas inflamatório-associado. Este modelo murino do apendicectomia permite a investigação do papel biológico do apêndice na patogénese da doença gastrintestinal humana.
Abstract
O apêndice humano foi recentemente implicado para desempenhar papéis biológicos importantes na patogénese de várias doenças complexas, tais como câncer colorretal, doença inflamatória intestinal, e doença de Parkinson. Para estudar a função do apêndice, um modelo de apendicectomia Murina associada à doença intestinal foi estabelecido e seu protocolo passo a passo é descrito aqui. Este relatório introduz um protocolo facile para a remoção caecal do remendo nos ratos seguidos pela indução química do cancro colorretal colite-associado crônico usando uma combinação de sódio do sulfato do dextrano (DSS) e do azoximetano (Aom). As pilhas específicas de IgA e a concentração de IgA foram reduzidas significativamente em cima da remoção do remendo caecal nos ratos C57BL/6 masculinos comparados àqueles no grupo Sham. Simultaneamente administrar 2% DSS e AOM resultaram em quase 80% de sobrevida de camundongos em grupos de Sham e apendicectomia sem perda significativa de peso corporal. Os resultados histológicos confirmaram a inflamação relativa ao cólon e os graus diferentes de adenocarcinoma. Este modelo pode ser usado para o estudo do papel funcional do apêndice em manter a homeostase da microbiota do intestino e a patogénese da colite e das malignidades do intestino, assim como para o desenvolvimento potencial de terapias de segmentação da droga.
Introduction
A apendicectomia clínica é um procedimento cirúrgico padrão que envolve a remoção do apêndice principalmente devido à inflamação (por exemplo, apendicite)1,2,3. No entanto, a função biológica do apêndice humano vermiforme permanece controversa4,5,6. O apêndice foi considerado como um remanescente vestigial que projeta-se do ceco no intestino grosso. Até recentemente, estudos evolucionários, imunológicos, morfológicos e microbiológicos sugeriram que o apêndice pode possuir funções distintas. Estas funções incluem a produção de imunoglobinas (por exemplo, IgA e IgG), uma variedade de células B e células T críticas para respostas imunes adaptativas dentro dos tecidos linfoides associados ao intestino (Galts), e reposição do intestino grosso com intestinal comensais 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11 anos de , doze anos.
Os estudos epidemiológicos clínicos dos pacientes com apendicectomia prévio ou apendicite aguda igualmente revelaram seus papéis potenciais na patogénese de doenças humanas, tais como a doença de entranhas inflamatório (IBD), o cancro colorretal, e não-gastrintestinal distúrbios (por exemplo, doença de Parkinson e doença cardiovascular)13,14,15,16,17,18. Por exemplo, um grande estudo de coorte da população asiática com 75.979 pacientes com apendicectomia mostrou recentemente uma associação significativa entre a apendicectomia e o desenvolvimento subseqüente do câncer colorretal, uma das neoplasias malignas mais comuns com alta incidência e mortalidade14,19. Conformemente, estabelecer um modelo animal apropriado do apendicectomia que se assemelhe a um ser humano será útil investigar as funções biológicas e os mecanismos moleculars do apêndice na patogénese da doença.
Muitos mamíferos possuem um apêndice ou órgão apêndice-like, incluindo primatas, lagomorfos (por exemplo, coelhos), alguns roedores, e marsupiais20. Para animais de laboratório pequenos e comumente usados, o coelho possui o apêndice vermiforme morfologicamente parecido com o humano21,22, mas Galt no coelho é extremamente grande em comparação com o que em seres humanos, uma vez que a maioria dos os tecidos lymphoid são encontrados igualmente em Peyer ' remendos de s situados nos intestinos pequenos e grandes21. Adicionalmente, o coelho mostra uma estrutura folicular lymphoid diferente, uma distribuição da pilha de T, e uma densidade da imunoglobulina do ser humano, que faz o estudo de seus apêndices inadequados21.
Os camundongos são o modelo animal mais comumente utilizado para estudar a fisiopatologia humana e testar os vários therapuetics existentes e novos23,24,25. O único grande aglomerado branco linfoide no ápice do cécum em camundongos, conhecido como o remendo caecal, é pensado para executar funções semelhantes ao apêndice humano26,27,28. No entanto, é praticamente difícil separar o remendo caecal de cécum em camundongos. Até o momento, os procedimentos cirúrgicos comuns para induzir a apendicite em um modelo de camundongo envolvem uma incisão relativamente grande (por exemplo, 1 – 2 cm) através da parede abdominal para obter acesso a todo o cécum (tabela suplementar 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.
Nisto, para gerar um modelo do apendicectomia associado com a doença gastrintestinal, este relatório apresenta um protocolo cirúrgico facile para a remoção caecal do remendo nos ratos. Isto é seguido pela administração combinada do agente genotóxico Aom e pelo agente pró-inflamatório DSS para a indução do cancro colorretal colite-associado similar àquele visto nos seres humanos. O IBD demonstrou ser um fator de risco do câncer intestinal37,38. A combinação do câncer colorretal associado à colite crônica induzida por Aom/DSS tem sido bem estabelecida, e os leitores podem se referir a Neufert et al., e Thaker et al. para procedimentos detalhados39,40. Este modelo reprodutível e rápido de apendicectomia Murina pode ser usado para estudar a inflamação intestinal modulada por apêndice e a microbiota do cólon, especialmente no desenvolvimento e progressão do IBD e do câncer colorretal.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Xi ' an Jiaotong (no. XJTULAC2019-1023).
1. apendicectomia de camundongos
- Casa 8 – 10-week-old C57BL/6 ratos machos em um certificado específico-patógeno livre (SPF) ambiente para 1 semana antes da cirurgia.
- Prepare os seguintes instrumentos cirúrgicos estéreis: um par de Microtesouras, um par de micro-fórceps, dois tamanhos (4-0 e 8-0) de suturas não absorvíveis esterilizadas, uma pena elétrica da coagulação com suporte da agulha, álcool médico de 75%, esfrega iodo-baseada ( por exemplo, entoiodine), e um pacote de cotonetes estéreis do algodão.
- Encha uma seringa de 10 mL com soro fisiológico pré-aquecido a 0,9% para o rubor abdominal e hidratação durante a cirurgia.
- Anestesie um rato não-jejum via intraperitoneal (i.p.) com 1% de pentobarbital sódico numa dose de 100 mg/kg. Verific para ver se há a profundidade da anestesia pela falta da resposta aos reflexos do pedal.
Nota: uma única dose anestésica é administrada para garantir um efeito sedativo completo no rato. a circunstância de procedimentos curtos, 50 mgs/quilograma do pentobarbital i.p. do sódio podem ser suficientes. - Raspar suavemente o cabelo abdominal com uma máquina de barbear eléctrica.
- Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.
- Fixe o rato em uma plataforma em uma posição supina coloc quatro tiras da fita adesiva médica através dos membros para impedir o movimento postural durante a cirurgia.
- Toque suavemente o abdômen inteiro para encontrar a sensação de um galo.
Nota: na maioria dos casos, a sensação de uma colisão sempre indica a posição exata do caecum. Para evitar possíveis danos ao resto do intestino, esta pré-localização do cécum antes da incisão abdominal é importante. - Cubra com uma cortina estéril e desinfete a área raspada do abdômen aplicando esfrega cirúrgica alternada da solução iodo-baseada e do álcool de 75%. Repita o processo 2x.
- Faça uma incisão longitudinal variando de 0,5 – 1,0 cm na linha média do abdômen.
- De acordo com a localização pré-determinada do cécum, alcançar o cécum e suavemente exteriorização (~ 1 cm) para identificar o remendo caecal. Use uma solução salina estéril e pré-aquecida de pH fisiológico para hidratar o intestino.
Nota: o remendo caecal de um rato é parte do cécum e caracterizado pela presença de folículos ovóide brancos na superfície. - Para evitar potenciais complicações do sangramento e infecção pós-operatória, ligar os vasos sanguíneos mesentéricos do cécum usando o 8-0 Sutura. Hidratar o cécum com soro fisiológico estéril.
- Marque a região de ressecção usando a sutura 4-0 com um laço aberto próximo ao ápice do cécum no cólon proximal.
Nota: a marcação do cécum com um laço aberto também impede o vazamento de conteúdo caecal do corte. - Corte o remendo caecal abaixo do Resection marcado usando micro-tesouras e limpe para fora o índice caecal residual com cotonetes médicos do algodão. Em seguida, desinfete o coto de cécum com esfoliação à base de iodo.
- Feche o coto com a sutura running usando o 8-0 Sutura.
- Remova com cuidado o laço da linha 4-0 usado previamente para marcar o resection no coto do caecum.
- Esterilizar a posição suturada com esfrega à base de iodo. Volte a hidratar o sítio cirúrgico com soro fisiológico.
- Feche a camada da musculatura com a sutura running usando 8-0 fio de sutura.
- Feche as camadas da pele usando suturas interrompidas com fio de sutura 4-0.
- Desinfete o corte cirúrgico 2x com esfoliação à base de iodo e, em seguida, remova o iodo usando 75% de álcool medicinal.
- Gentilmente virar o mouse para trás, por via subcutânea (s.c.) injetar 0,1 mg/kg de peso corporal de buprenorfina e 0,4 mL de soro fisiológico e deixe o mouse descansar na almofada de calor até retornar à consciência.
- Coloque o mouse de volta para a gaiola estéril e acompanhar de perto para sinais de dor por 3 dias após a cirurgia para garantir a recuperação.
Nota: a aplicação pós-operatória de 0, 5 mg/kg de buprenorfina pode ser necessária para o alívio da dor do rato individual. Permita que os ratos recuperem por 7 dias após a cirurgia para uma indução mais adicional do cancro colorretal colite-associado.
2. indução de câncer colorretal associado à colite crônica com AOM e DSS
Nota: Execute este procedimento 7 dias após a apendicectomia.
- Prepare a solução de ações da AOM dissolvendo 25 mg de AOM em 2,5 mL de soro fisiológico 0,9% estéril a uma concentração de 10 mg/mL.
Nota: AOM é sensível à luz.- Alíquota 2,5 mL de solução de ações AOM preparada em tubos de vidro de 5 mL envoltos com folha de alumínio e armazenar a-20 ° c cada vez após o uso.
- Descongelar uma alíquota de AOM uma vez e diluir-lo para uma concentração de 1 mg/mL com 0,9% de soro fisiológico estéril (rácio 1:10).
Cuidado: AOM é extremamente carcinogénico; Portanto, realize todo o procedimento de preparação em uma capa de fumaça.
- Dissolver 4 g de pó DSS em 200 mL de água esterilizada para preparar 2% (p/v) solução DSS.
Nota: a concentração de DSS pode variar dependendo da estirpe do rato, sexo e ciclo de indução; 3% DSS podem ser usados para outras cepas de camundongos. - Administrar simultaneamente o AOM/DSS preparado recentemente para os ratos. Para fazer isso, siga as etapas abaixo.
- Injete intraperitoneal 0, 1 mL/g de solução de trabalho de AOM preparada na hora para cada rato e substitua a água autoclavada por 2% de solução de DSS durante 5 dias ad libitum.
Nota: cada gaiola contém cinco camundongos; Verifique regularmente a garrafa de bebida DSS para garantir que nenhum precipitado ocorra durante o período de tratamento. - Peso e acompanhar de perto cada rato todos os dias.
Nota: durante a administração, eutanizar camundongos com até 20% de perda de peso em comparação com o seu peso inicial ou sinais da aproximação, squint, hipotermia, e atividade pobre.
- Injete intraperitoneal 0, 1 mL/g de solução de trabalho de AOM preparada na hora para cada rato e substitua a água autoclavada por 2% de solução de DSS durante 5 dias ad libitum.
- Forneça uma garrafa fresca de água autoclavada no dia 6 pós-AOM/DSS Administração até o dia 21 (Figura 1B).
Nota: Este é um ciclo completo composto por 21 dias. - Repita os passos 2.3 – 2.4 para um adicional de dois ciclos e sacrificar os ratos no dia 70.
3. avaliação da inflamação e do tumor colônicos (70 dias após a administração de AOM)
- Sacrifique os camundongos por inalação de CO2 a uma taxa de enchimento de 10% na câmara de eutanásia seguida de luxação cervical.
- Colher todo o cólon de cima da junção ileo-cólica para o ânus.
- Expor o lado do lúmen abrindo o cólon longitudinalmente. Corte o cólon inteiro em 10 cm de comprimento e fixe o tecido do cólon em formalina a 10% para 72 h para coloração de hematoxilina e eosina (H & E).
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Representative Results
Estabelecimento de modelo de apendicectomia murina
Este modelo de apendicectomia Murina do câncer colorretal associado à colite crônica pode ser gerado seguindo as etapas cirúrgicas e de indução seqüenciais, conforme ilustrado na Figura 1. As posições mais freqüentes do cécum estão na fossa ilíaca esquerda e direita seguida da linha média do abdome (Figura 2). A taxa bem sucedida de pré-localização do cécum antes da incisão do abdômen usando o método da palpação é quase 70% (informação suplementar, tabela S2). Os procedimentos de apendicectomia compreendem principalmente seis etapas importantes (Figura 3). Durante a cirurgia de apendicectomia, uma incisão na linha média de 0,5 – 1,0 cm de comprimento é fundamental para minimizar o trauma cirúrgico (Figura 3a). No caso de vazamento intraperitoneal, a ligadura de vasos mesangiais e o fechamento do coto do cécum são necessários, utilizando-se suturas em vez de ligação simples (Figura 3B, C, D, E).
Avaliação da IgA como biomarcador em camundongos apendicectomia
Para confirmar a apendicectomia, o intestino grosso de camundongos e o conteúdo fecal foram colhidos após a cirurgia para determinar os níveis de células plasmáticas específicas de IgA e concentrações secretoras de IgA (sIgA). Os camundongos com apendicectomia apresentaram redução significativa no percentual de células plasmáticas específicas de B220-IgA + em relação ao grupo Sham (Figura 4a, B). Além disso, comparado ao seu próprio estado inicial antes da cirurgia, camundongos Sham mantiveram a concentração fecal de sIgA ao longo de 14 dias após a cirurgia, enquanto o grupo de apendicectomia apresentou redução significativa da slgA no 14º dia (Figura 4C).
Validação de câncer colorretal associado à colite em camundongos apendicectomia
Comparado a 3% DSS, em que a maioria de ratos no grupo do apendicectomia mostraram complicações severas e perda de peso significativa do corpo (Figura 5A), 2% DSS em combinação com o Aom forneceu 80% da taxa de sobrevivência em grupos do Sham e do apendicectomia, com alterações razoáveis do peso corporal (Figura 5E). Ao final de três ciclos de tratamento, o intestino grosso de comprimento total foi colhido para avaliação patológica. A inspeção visual e a coloração por H & E mostraram os tumores colônicos com inflamação do cólon e diferentes graus de adenocarcinomas (adenocarcinomas bem, moderados e pouco diferenciados) em camundongos tratados com 2% de AOM/DSS (Figura 6).
Figura 1: ilustração esquemática do estabelecimento do modelo de apendicectomia Murina do câncer colorretal associado à colite crônica.
(A) um fluxograma dos principais passos cirúrgicos (três primeiros são críticos) do procedimento de apendicectomia. (B) indução do cancro colorretal. Sete dias após a apendicectomia, AOM e DSS foram administrados simultaneamente. Os pesos dos camundongos foram gravados em vários momentos (triângulo vermelho). No dia 70 após a cirurgia, os camundongos foram sacrificados, e os tecidos intestinais foram colhidos para novas avaliações. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: pré-determinação da localização da mancha caecal em camundongos antes da incisão abdominal.
(A) síntese da probabilidade de encontrar a posição do cécum. Imagens anatômicas de três posições mais comuns do cécum no (B) baixo direito, (C) médio, e (D) baixo abdômen esquerdo do mouse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: etapas críticas da apendicectomia murina.
(A) pequena incisão arranjada 0,5 – 1,0 cm; (B) retirando a porção exata do adesivo caecal após a pré-posição do caecum. (C) ligadura de vasos mesentéricos que acompanham o caecum. D) marcação da região de corte do cécum com a sutura 4-0. (E) fechando o coto com suturas running usando o 8-0 Sutura. (F) fechando a camada muscular com suturas interrompidas usando o 8-0 Sutura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: quantificação de células de plasmas específicos de IgA e concentração de sIgA fecal após apendicectomia.
(A) parcelas representativas de pontos para células coradas com anti-IgA e B220 em todo o intestino grosso de camundongos Sham e apendicectomia 1 dia e 14 dias após a cirurgia. Os linfócitos na lâmina própria foram preparados recentemente e corados com FITC anti-mouse IgA, PE anti-mouse CD45R/B220 para citometria de fluxo. Números dentro de parcelas indicam porcentagens de células nas respectivas áreas; (B) determinação quantitativa de células plasmáticas específicas de IgA em grupos de Sham e apendicectomia. Os dados representam média ± DP; n = 5 – 8 camundongos; * p < 0, 5, * * p < 0, 1, e * * * p < 0, 1. (C) concentrações fecais de siga antes e após a cirurgia. Os teores fecais foram coletados em pontos de tempo designados, e os níveis de sIgA foram testados por ELISA. Cada ponto de cor representa o mesmo mouse durante um período de 14 dias. A análise estatística foi realizada por meio de teste tnão pareado, com p < 0, 5 considerado estatisticamente significante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: estado de sobrevivência animal do modelo murino de câncer colorretal associado à colite crônica induzido pela Associação AOM/DSS após apendicectomia.
(A) a curva de sobrevida obtida com 3% de DSS para a indução de colite em grupos de Sham e apendicectomia. As complicações severas do prolapso anal (B) e do abcesso mural indicaram o valor-limite do animal (C). (D) a curva de sobrevida obtida com 2% DSS para a indução de colite em grupos Sham e apendicectomia; (E) alteração média do peso corporal de camundongos com mais de 70 dias. Os dados representam média ± DP, n = 6 camundongos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: imagens de tumores colorretais associados à colite crônica induzida pelo tratamento combinado de 2% DSS e 10 mg/kg de AOM.
Fotografias do cólon dissecado com tumores (a) inspeção visual e (B) microscópio de operação animal. H & E que mancha imagens dos tecidos relativos ao cólon que mostram (C) a inflamação relativa ao cólon, (D) adenocarcinoma bem diferenciado, (e) adenocarcinoma moderada diferenciado, e (F) adenocarcinoma altamente diferenciado. Seta preta indica a úlcera da mucosa, a seta preta indica adenocarcinoma, a flecha branca indica infiltração de neutrófilos entre as glândulas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela complementar 1: Resumo da literatura dos métodos cirúrgicos utilizados para a indução de apendicite em cepas de camundongos comumente usadas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela complementar 2: locais do cécum em camundongos após laparotomia. Órgão exposto após incisão indica o órgão encontrado diretamente na posição pré-localizada após laparotomia. A posição do cécum mostra a localização do cécum em relação à região abdominal/posição do cécum em relação ao intestino. Exposto indica que o cécum estava abaixo da camada muscular do abdômen e acima de outras partes do intestino. Incorporado indica que o cécum foi coberto pelo intestino. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Um modelo murino do apendicectomia do cancro colorretal colite-associado foi obtido usando etapas cirúrgicas com uma taxa de sobrevivência elevada nos ratos. Na maioria dos casos, desde que o cécum foi posicionado a parede abdominal (tabela suplementar 1, tabela suplementar 2, e Figura 2), era difícil prejudicar sua posição sem laparotomia. Neste protocolo cirúrgico, foi introduzido um passo fácil de tocar a colisão, e a avaliação quantitativa do local do cério também foi fornecida como orientação para aumentar a precisão da pré-localização do cálio (Figura 2). A exploração de características anatômicas para remover o remendo caecal minimizou o rompimento de partes não intencionais das entranhas, assim diminuindo a taxa de complicações potenciais do apendicectomia e da infecção da cavidade abdominal.
Três etapas críticas estão envolvidas neste modelo. Primeiramente, a examinação visual e a palpação antes da laparotomia podem ser úteis determinar a posição geral do caecum. Apesar do fato de que o cécum é mais provável presente na região ilíaca esquerda do abdômen, o remendo caecal que projeta-se do vértice do cécum é frequentemente dissociativo (isto é, mova-se ao redor ou encaixado) e é mais provável ser encontrado abaixo do peritônio médio ( Figura 2). Em segundo lugar, uma pequena incisão na linha média do abdômen e a exposição exata do remendo caecal são preferidas. Isto é porque há um ponto fino na linha média do abdômen, em que o corte nesta posição pode diminuir o ferimento potencial da camada abdominal da musculatura. Além, para evitar o volvulus em cima do appendectomy, que é prejudicial aos ratos, a exposição exata do remendo caecal minimiza a violação não intencional do intestino, reduzindo o risco de ocorrência do volvulus. Além disso, a exposição mínima da cavidade abdominal pode assegurar-se de que o intestino permaneça não contaminado, morno, e húmido; caso contrário, a exposição excessiva pode causar perda de calor e secagem significativas dos tecidos41.
Em terceiro lugar, a desinfecção e o fechamento do coto caecal com suturas running em vez da ligadura simples são necessários impedir o sangramento e a desinfecção potenciais dos índices caecal do coto. O nível de células plasmáticas específicas de IgA e sIgA fecal nas grandes entranhas de camundongos são significativamente reduzidos por uma apendicectomia, sugerindo que o remendo caecal é o local principal para a produção de IgA pelo menos no período inicial33. No intestino grosso, a função sIgA como defensor da saúde da mucosa estabilizando a colonização normal da flora comensal e contrariando os micróbios patogênicos42. A remoção do apêndice reduz a produção de IgA e pode interromper a homeostase mucosa.
A alta taxa de mortalidade e os sinais clínicos de indução de colite excessiva (i.e., fezes sangrentas severas, prolapso anal e abscesso abdominal43,44) foram observados em camundongos tratados com 3% DSS (Figura 5). Entretanto, a indução do DSS de 2% após três ciclos não causou nenhuma destas complicações, e a taxa de sobrevivência foi mantida acima de 80%. Isto indica que o uso combinado de DSS e de AOM deve ser validado, desde que a falta da integridade de GALTs pode, em certa medida, reduzir a tolerância dos ratos à combinação de AOM e de DSS. Os estudos observacionais de evidências clínicas sugerem que o apêndice está fortemente associado ao desenvolvimento do IBD e do câncer colorretal14,45,46. Entretanto, as funções biológicas e os mecanismos subjacentes do apêndice na patogénese de doenças de intestino crônicas são ainda obscuros. Parece que o apêndice atua como uma parte importante de Galts e como um reservatório para a flora comensal do intestino para regular a saúde ou Estados doentes17,18,31. Estabelecer este modelo de apendicectomia Murina repetível e rentável pode ser usado para estudar os papéis do apêndice no IBD e câncer colorretal no contexto da microbiota homeostase, prevenção do câncer e imunoterapia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é parcialmente apoiado por fundos de investigação fundamentais para a Universidade Central (G2018KY0302), fundo de desenvolvimento de investigação fundamental da Universidade (KT00062), Fundação Nacional de ciência natural da China (81870380), e prêmio de pesquisa clínica da Primeiro hospital afiliado da Universidade de Xi ' an Jiaotong na China (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Os autores agradecem o Dr. Chengxin shi por suas sugestões técnicas durante a fase adiantada da exploração do modelo murino do apendicectomia, assim como o patologista Dr. XI Liu para a avaliação de H & e que mancham resultados da colite e dos tumores colorretal. Y.L. realizou a demonstração cirúrgica, fez a análise dos dados, e escreveu o rascunho do manuscrito; A JL, a GL, a Z.P. e a Y.M. participaram da preparação cirúrgica, coleções de tecidos e produção de vídeo; M realizou citometria de fluxo e ELISA; Q.W. e H.X. forneceram o suporte técnico de gerar um modelo murino clinicamente relevante; R.X.Z. projetou o estudo, supervisionou a pesquisa, e escreveu e comprovou o manuscrito; J.S. revisou o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane(AOM) | Sigma-Aldrich,Inc. | A5486 | |
| Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) | MP Biomedicals,Inc. | 160110 | |
| Entoiodine | Shanghai likon high technology disinfection co. LTD | 310102 | |
| digital caliper | Ningbo yuanneng trading co. LTD | 4859263 | |
| 4-0 Silk Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| 8-0 Prolene Sutures | Yuanlikang co. LTD | 20172650032 | |
| Electric coagulation pen | Chuang mei medical equipment co. LTD | 28221777292 | |
| disposable syringe 1ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| disposable syringe 10ml | Shengguang medical products co. LTD | 3262-2014 | |
| 75% Medicinal alcohol | Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD | 371402AAJ008 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich,Inc. | 57-33-0 | |
| Physiological Saline | Shandong qidu pharmaceutical co. LTD | H37020766 | |
| Absorbent Cotton Swab | Henan ruike medical co., LTD | RK051 | |
| Surgical Instruments-Ophthalmic | Jinzhong Shanghai co.LTD | WA3050 |
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