Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes nucléoside de ribohydrolase. Des protocoles sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli.

Abstract

La spectroscopie RMN est souvent utilisée pour l'identification et la caractérisation des inhibiteurs des enzymes dans la découverte de médicaments, en particulier dans le contexte du dépistage des fragments. Les essais d'activité basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans une expérience rmN peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela contraste avec les essais spectrophotométriques, dans lesquels les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet attribut les rend utiles en tant qu'essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage sur le banc. Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les méthodes sont démontrées à l'aide de deux enzymes de ribohydrolase nucléoside. L'utilisation de 1H NMR est montrée pour l'enzyme purine-spécifique, alors que 19NMR de F est montrée pour l'enzyme pyrimidine-spécifique. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme où les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Pour être le plus utile dans le contexte de la découverte de médicaments, la concentration finale de substrat ne doit pas être plus de 2-3x sa valeur Km. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible.

Introduction

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est bien établie pour caractériser et surveiller les réactions enzymatiques1,2. Les différences dans les changements chimiques et les modèles d'accouplement sont utilisées pour distinguer les résonances du substrat et du produit, et des intensités de résonance relative sont utilisées pour quantifier le pourcentage de la réaction. La consommation de substrat et la création de produits sont directement observées dans le spectre de la RMN. Cela contraste avec la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence, dans laquelle le cours du temps de réaction est indiqué par un changement d'absorption attribuable à certaines espèces chimiques consommées ou créées. Tout comme avec les autres méthodes, la RMN peut être utilisée pour étudier les réactions enzymatiques en fonction de la température, du pH ou d'autres conditions de solution, et les effets des inhibiteurs peuvent être déterminés.

Plus récemment, des tests d'activité enzymatiques à base de RMN ont été démontrés pour le dépistage des fragments3,4. Les essais basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai (souvent aussi élevés que 1 mM) nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans l'expérience rmnpeut peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela se compare favorablement aux essais spectrophotométriques où les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet avantage les rend utiles comme essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage de banc5.

Dans notre laboratoire de recherche, des essais d'activité basés sur la RMN sont utilisés pour identifier et évaluer les inhibiteurs des ribohydrolases nucléoside de Trichomonas vaginalis. Le parasite T. vaginalis cause la maladie sexuellement transmissible non virale la plus répandue6. L'augmentation de la résistance aux thérapies existantes7 est à l'origine de la nécessité de nouveaux traitements basés sur des mécanismes, avec des enzymes essentielles de voie de récupération nucléoside représentant des cibles de premier plan8. Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour les enzymes spécifiques à la pyrimidine et à la purine, la ribohydrolase nucléoside d'uridine (UNH)9, et l'adénosine/guanosine préférant la ribohydrolase nucléoside (AGNH)10. Les réactions catalysées par ces deux enzymes sont montrées dans la figure 1. Les essais de RMN sont utilisés pour dépister les bibliothèques de fragments à la recherche de points de départ chimiques, déterminer les valeurs de l'IC50 et éliminer les inhibiteurs de liaison à base d'agrégation ou covalents11. Les mêmes essais sont également traduits pour évaluer l'activité enzymatique dans les cellules entières12.

Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme dans laquelle les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Trois hypothèses ont été faites pour la simplicité. Tout d'abord, le substrat n'est pas spécifié. Pour que les essais d'activité basés sur la RMN soient utiles, la concentration finale du substrat ne devrait pas dépasser 2-3x la valeur Km 4. Dans les exemples montrés, les concentrations finales d'adénosine et defluorouridine 5 sont de 100 M (Km 54 'M) et de 50 'M (Km '15 'M), respectivement. Dans les protocoles, la réalisation de ces concentrations correspond à 12 l de 5 mM d'adénosine ou 12 à L de 2,5 mM 5-fluorouridine.

Deuxièmement, la quantité d'enzyme prévue dans les protocoles, 5 L, a été choisie pour correspondre à la quantité requise pour entraîner une conversion d'environ 75 % du substrat en produit en 30 min. Cette quantité représente généralement une dilution importante à partir d'un stock d'enzymes purifiées, et la dilution doit être déterminée à l'avance pour chaque enzyme. Les solutions de stock d'enzymes AGNH et UNH purifiées sont stockées à -80 oC dans des aliquots qui fournissent suffisamment d'enzymes pour plusieurs milliers de réactions. Ainsi, le facteur de dilution ne doit idéalement être déterminé ou validé que tous les quelques mois. Troisièmement, l'expérience spécifique 1D NMR n'est pas spécifiée. Dans les résultats représentatifs, 1H NMR est montré pour AGNH10 et 19F NMR est montré pour UNH9, avec l'expérience RmN décrite dans les références correspondantes. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible. Enfin, il convient de souligner que l'approche expérimentale décrite ne respecte pas les exigences strictes de la RMN quantitative (RMQ)13,14. Dans le protocole, une réaction en pourcentage est déterminée en utilisant les changements relatifs de l'intensité de la même résonance dans chaque spectre, plutôt qu'en déterminant les concentrations absolues. Cette approche élimine le besoin de modifications à l'acquisition et au traitement des données ainsi que des normes internes ou externes, qui sont requises pour le MRQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Essais de composés d'essai initiaux à 500 M et 250 M

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 50 mM composé d'essai dans le sulfoxide de diméthyle dilué (DMSO). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 12 l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 4.
    3. Ajouter 6 ll de DMSO deuterated aux tubes 1 (0 min de contrôle) et 4 (contrôle de 30 min). Ajouter 6 ll de composé d'essai au tube 2. Ajouter 3 ll de composé d'essai et 3 'L de DMSO dilué au tube 3.
  2. Préparer une solution de stock de réaction suffisante.
    REMARQUE : La solution de stock est pour cinq réactions qui contiennent chacune 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique deux fois pour mélanger.
  3. Simultanément initier et étancher la réaction de contrôle 0 min. Transférer 582 L de la solution de stock de réaction à un tube de microfuge propre. Ajouter 10 L de 1,5 M HCl à ce tube de microfuge. Transférer les 592 l combinés au tube de microfuge 1. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée.
  4. Initier et exécuter les trois réactions restantes de façon décalée. À l'heure 0 min, transférer 582 l de la solution de stock de réaction au tube de microfuge 2. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Répéter l'opération à intervalles de 30 s pour les tubes de microfuge 3 et 4. Attendez 30 min.
  5. Étancher les réactions. À la fois 30 min, ajouter 10 'L de 1,5 M HCl au microfuge 2. Répéter l'opération à intervalles de 30 s pour les tubes de microfuge 3 et 4. Transférer 600 l de solution de chaque microfuge vers les tubes RMN.
  6. Acquérir un spectre de RMN 1D sur chaque échantillon. Traiter les données pour assurer un phasage correct et des lignes de base plates.
  7. Calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les spectres de contrôle.
    1. Recalibrez les spectres pendant 0 min et 30 min de commandes. Échelle du signal de substrat dans le contrôle de 0 min pour correspondre à la commande de 30 min. Notez ce pourcentage.
    2. Calculez la conversion en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé à l'étape 1.7.1).
  8. Calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les réactions contenant composé d'essai.
    1. Resplant les spectres pour le contrôle de 0 min et la première réaction contenant le composé d'essai de 500 M. Échelle du signal de substrat dans le contrôle de 0 min pour correspondre au spectre avec le composé d'essai. Notez ce pourcentage. Calculer la conversion en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé).
    2. Répétez l'opération pour la deuxième réaction contenant le composé d'essai de 250 M.
  9. Calculez la réaction en pourcentage et l'inhibition pour cent pour chaque concentration composée d'essai.
    1. Calculez la réaction en pourcentage comme (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Calculez l'inhibition en pourcentage comme (100 - pourcentage déterminé à l'étape 1.9.1).

2. Détermination des valeurs IC50

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
  2. Préparer des dilutions en série de 10 mM de composé d'essai (dans le DMSO dilué).
    1. Ajouter 36 DMSO deulés de 36 L à cinq tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 5.
    2. Ajouter le composé d'essai de 12 l 10 mm au tube 1 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 2,5 mM.
    3. Transférer 12 l du tube 1 au tube 2 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,63 mM. Transférer 12 l du tube 2 au tube 3 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,16 mM. Transférer 12 l du tube 3 au tube 4 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,04 mM. Transférer 12 l du tube 4 au tube 5 et taper légèrement pour mélanger. Le composé d'essai est maintenant de 0,01 mM.
  3. Préparer 14 tubes de microfuge de 1,5 ml pour les réactions.
    1. Ajouter 12 ll de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des 14 tubes microfuge de 1,5 ml, 1-14.
    2. Ajouter 12 lde de DMSO dilué aux tubes 1 (0 min de contrôle) et 14 (contrôle de 30 min).
    3. Ajouter 12 l de composé d'essai de 10 mm aux tubes 2 et 3. Ajouter 12 l de composé d'essai de 2,5 mm aux tubes 4 et 5. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,63 mM aux tubes 6 et 7. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,16 mm aux tubes 8 et 9. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,04 mM aux tubes 10 et 11. Ajouter 12 l de composé d'essai de 0,01 mM aux tubes 12 et 13.
  4. Préparer une solution de stock de réaction suffisante pour exécuter 15 réactions qui contiennent 511 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 7,67 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 900 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 75 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  5. Suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 à (en utilisant 576 L de solution de stock de réaction) pour déterminer la réaction en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.
  6. Calculez la valeur IC50 à l'aide de GraphPad Prism.
    1. Créer un tableau de données corrélé le journal des concentrations composées d'essais de réaction (200 M, 50 M, 12,5 M, 3,13 M, 0,78 M, 0,20 M) avec une réaction en pourcentage (deux valeurs chacune).
    2. Utilisez une courbe non linéaire pour déterminer la valeur IC50 et l'erreur standard.

3. Essais d'écran de compteur de détergent à 100 M et 50 M

  1. Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 12 ll de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des huit tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 8.
    3. Ajouter 6 ll de DMSO deuterated aux tubes 1 et 5 (0 min de commandes) et 4 et 8 (30 min de commandes). Ajouter 6 ll de composé d'essai aux tubes 2 et 6. Ajouter 3 ll de composé d'essai et 3 l de DMSO dilué aux tubes 3 et 7.
  2. Préparer une solution de stock de réaction suffisante SANS détergent pour exécuter cinq réactions qui contiennent 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution enzymatique à utiliser.
    1. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    2. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  3. Préparer une solution de stock de réaction suffisante avec 0,01% v/v Triton X-100 détergent pour exécuter cinq réactions qui contiennent 517 l de tampon, 60 l d'oxyde de deutérium, et 5 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) chacune.
    1. Ajouter 2 ll de détergent Triton X-100 à 20 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5). Les solutions de détergent doivent être utilisées dans un délai d'un jour.
    2. Ajouter 2,59 ml de tampon de réaction contenant 0,01 % de détergent Triton X-100 dans un tube conique de 15 ml. Ajouter 300 l'oxyde de deutérium au tube conique. Ajouter 25 l de solution enzymatique (AGNH ou UNH) au conique.
    3. Inverser délicatement le tube conique 2x pour mélanger.
  4. Pour les tubes 1 à 4, à l'aide de la solution de stock de réaction SANS détergent, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 pour déterminer l'inhibition en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.
  5. Pour les tubes 5 à 8, en utilisant la solution de stock de réaction AVEC 0,01 % v/v Triton X-100 détergent, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.3-1.9 pour déterminer l'inhibition en pourcentage pour chaque concentration de composé d'essai.

4. Saut-dilution contre-écran essais

  1. Préparer le substrat et tester les composés pour les réactions
    1. Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 10 mM composé d'essai dans d'un DMSO dilué. Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.
    2. Ajouter 53,8 l de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH et 6,5) à deux tubes microfuge de 1,5 ml (chacun), 1 et 2. Ajouter 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) aux tubes 1 et 2.
    3. Ajouter 511 ll de tampon de réaction à deux tubes de microfuge de 1,5 ml, 3 et 4 (chacun). Ajouter 60 l'oxyde de deutérium aux tubes 3 et 4. Ajouter 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) aux tubes 3 et 4.
    4. Ajouter 1,2 L de DMSO dilué au tube 1 (30 min de contrôle). Ajouter 1,2 l de composé d'essai au tube 2. Ajouter 12 L de DMSO dilué au tube 3 (30 min de contrôle). Ajouter 12 ll de composé d'essai au tube 4. Incuber pendant 30 min.
  2. Préparer deux tubes de microfuge de 1,5 ml avec une solution de dilution.
    1. Ajouter 468 ll de tampon de réaction à chacun des deux tubes de microfuge de 1,5 ml, 5 et 6. Ajouter 60 l'oxyde de deutérium à chaque tube (5 et 6).
  3. Préparer quatre tubes de microfuge de 1,5 ml pour les réactions.
    1. Ajouter 12 l l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 7 à 10.
  4. Effectuez des dilutions de saut et déclenchez les réactions.
    1. Transférer 528 l de solution du tube 5 au tube 1. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Transférer 528 l de solution du tube 6 au tube 2. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée.
    2. À la fois 0 min, transférer 588 l de solution du tube 1 au tube 7. Aspirer et distribuer l'échantillon 2x d'une manière lente mais délibérée. À intervalles de 30 s, transférez 588 l de solution du tube 2 au tube 8, du tube 3 au tube 9, et du tube 4 au tube 10. Aspirer et distribuer l'échantillon deux fois de façon lente mais délibérée. Attendez 30 min.
  5. Pour les tubes 7 à 10, suivez les étapes décrites dans les étapes 1.5-1.9 pour déterminer l'inhibition pour cent pour chaque concentration composée d'essai.

5. Essais composés dans les cellules entières d'E. coli

  1. Préparer la culture de 10 ml d'E. coli la veille des expériences.
  2. Préparer les cellules E. coli pour les expériences rmN.
    1. Centrifuger les cellules en 1 ml d'aliquots pendant 10 min à 15 000 x g.
    2. Jeter le supernatant et resuspendre chaque aliquot de cellules dans 1 ml de tampon de réaction (50 mM de phosphate de potassium, 0,3 M KCl, pH - 6,5) par vortex.
  3. Suivez les sections 1 ou 2 pour l'exemple souhaité avec les modifications suivantes :
    1. Remplacer 280 l de tampon dans la solution de stock de réaction par 280 l de cellules rechargées.
    2. Remplacer 5 ll d'enzyme (AGNH ou UNH) dans la solution de stock de réaction par 5 ll de tampon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 2 montre les résultats de l'essai de deux composés contre AGNH à l'aide de 1RmNH H suivant la section 1. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d'adénosine à 8,48 ppm et 6,09 ppm, respectivement, et l'apparition d'une résonance de singlet adénine à 8,33 ppm comme observé dans le contrôle de 30 min spectre. En présence d'un composé 1 de 500 M, aucun produit n'est formé comme en témoigne l'absence d'une résonance adénite à 8,33 ppm. En présence d'un composé 1 de 250 M, environ 10 % du substrat a été converti en produit. En revanche, ni l'une ni l'autre concentration du composé 2 n'inhibe l'enzyme comme en témoigne le substrat et les résonances de produit ressemblant à ceux dans le spectre témoin de 30 min. Ces données identifient le composé 1 comme un bon inhibiteur de l'AGNH. Notez que les résonances résultant du composé 1 (7.70-8.00 et 8.50-8.60 ppm) et du composé 2 (7.40-7.80 ppm) sont également observées. Les mêmes résonances de substrat et de produit sont utilisées pour surveiller les réactions montrées dans la figure 4, la figure 6, la figure 8et la figure 10. La figure 3 montre les résultats de l'essai de deux composés contre l'UNH à l'aide de 19RMN F suivant l'article 1. La réaction enzymatique est facilement observée et quantifiée par la disparition de la résonance de 5 fluorouridines à -165,8 ppm et l'apparition d'une résonance de 5-fluorouracil à -169,2 ppm comme observé dans le spectre témoin de 30 min. Pour cette enzyme, le composé 2 inhibe complètement la réaction aux deux concentrations alors que le composé 1 n'a aucun effet. Ces données identifient le composé 2 comme un bon inhibiteur de l'UNH. Les mêmes résonances de substrat et de produit sont utilisées pour surveiller les réactions montrées dans la figure 5, la figure 7, la figure 9et la figure 11.

La figure 4 montre les données de RMN dose-réponse et la courbe IC50 obtenue pour un composé ayant une activité AGNH à l'aide de 1RMN H suivant la section 2. Les données RMN ne sont affichées que pour un seul des essais en double. Notez que les résonances résultant du composé testé (6,90-7,40 ppm) n'interfèrent pas avec le substrat ou les résonances du produit. La courbe IC50 était adaptée à l'aide des données des deux essais et a donné une valeur de 12,3 à 5,0 M. Ce résultat est conforme aux données de la RMN en ce que la perte importante de signal de substrat n'est pas observée jusqu'à ce que la concentration composée soit réduite à 12,5 M. La figure 5 montre les données de RMN dose-réponse et la courbe IC50 obtenue pour un composé ayant une activité de l'UNH à l'aide de 19RMN F suivant la section 2. Les données RMN ne sont affichées que pour un seul des essais en double. La courbe ic50 était adaptée à l'aide des données des deux essais et a donné une valeur de 16,7 à 10,4 M. Cette valeur est conforme aux données de la RMN en ce que la perte importante de signal de substrat n'est pas observée jusqu'à ce que la concentration composée soit réduite à 12,5 M.

La figure 6 montre les résultats pour l'essai d'un composé à deux concentrations contre AGNH en l'absence et la présence d'un détergent Triton X-100 de 0,01 % à l'aide de 1RMN H suivant la section 3. Seules des différences minimes sont observées dans l'intensité du substrat et les signaux du produit à l'aide des deux conditions, ce qui indique que l'inhibition enzymatique observée n'est pas un artefact d'agrégation composée. Notez que les résonances provenant du composé testé (7,10-7,70 ppm) et du Triton X-100 (6,90 et 7,40 ppm) n'interfèrent pas avec le substrat ou les résonances du produit. La figure 7 montre les résultats de l'essai d'un composé à deux concentrations contre l'UNH en l'absence et la présence d'un détergent Triton X-100 de 0,01 % à l'aide de 19RMN F suivant l'article 3. Seules des différences minimes sont observées dans l'intensité du substrat et les signaux du produit à l'aide des deux conditions, ce qui indique que l'inhibition enzymatique observée n'est pas un artefact d'agrégation composée.

La figure 8 montre les résultats pour tester un composé dans l'analyse de la dilution par saut contre AGNH à l'aide de 1H RMN suivant la section 4. L'intensité réduite du signal du substrat dans la réaction de 20 M par rapport à la réaction de 200 M indique que l'inhibition est réversible. Le composé testé a une valeur IC50 de 21,0 M, et ses résonances sont observées à 6,90-8,30 ppm. Dans cet exemple, les résonances du composé interfèrent avec celles du signal du produit adénine, et les progrès de réaction sont plus faciles à surveiller à l'aide de la résonance adénosine à 6,09 ppm. La figure 9 montre les résultats pour tester un composé dans l'analyse de la dilution par saut contre l'UNH à l'aide de 19RMN F suivant la section 4. L'intensité accrue du signal du produit à -169,2 ppm dans la réaction de 20 M par rapport à la réaction de 200 M indique que l'inhibition est réversible. Le composé testé a une valeur IC50 de 16,7 M.

La figure 10 montre l'utilité de la méthode pour effectuer des essais dans des cellules entières à l'aide de 1RMN H suivant la section 5. Les signaux du substrat d'adénosine sont presque complètement disparus après 30 min en présence de cellules entières, ce qui indique l'hydrolyse du substrat. En revanche, le substrat reste inchangé après 30 min en présence du supernatant de médias de croissance cellulaire, ce qui indique que la réaction d'hydrolyse est dépendante des cellules. Notez la présence de nombreux signaux de fond dans les spectres supernatants, y compris les signaux intenses de triplet de NH4- ions à 6,90-7,15 ppm qui sont également présents à un plus petit degré dans l'ensemble des spectres cellulaires. La figure 11 montre l'utilité de la méthode d'exécution des essais dans des cellules entières à l'aide de 19RMN F suivant l'article 5. Le signal du substrat à 5 fluororidines est complètement disparu après 60 min en présence de cellules entières, ce qui indique une hydrolyse du substrat. En revanche, le substrat reste inchangé après 60 min en présence du supernatant de médias de croissance cellulaire, ce qui indique que la réaction d'hydrolyse est dépendante des cellules.

Figure 1
Figure 1 : Réactions catalysées par l'UNH (en haut) et l'AGNH (en bas). Notez que l'UNH catalysera l'hydrolyse de l'uridine et de la fluorororidine 5 (illustrée). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Tests de composition initiale représentatifs à 500 L'entreprise M et 250 L'entreprise M contre AGNH en utilisant 1H RmN. Régions des spectres de réaction de 1H RMN pour deux composés, chacun à 500 M et 250 M, ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min. Le spectre de contrôle de 0 min contient des résonances de substrat d'adénosine à 6,09, 8,38 et 8,48 ppm. Le spectre de commande de 30 min contient une nouvelle résonance de produit adénine à 8,33 ppm. Les spectres d'essai contiennent des résonances supplémentaires provenant du composé testé. 1 Fois Les changements chimiques H ont été référencés à l'acide trimethyllylpropionic externe à 0.0 ppm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Tests de composition initiale représentatifs à 500 L'entreprise M et 250 L'entreprise M contre l'UNH en utilisant 19F RMN. Régions des 19spectres de réaction De rmN F pour deux composés, chacun à 500 m et 250 M, ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min. Le spectre témoin de 0 min contient une résonance de substrat de 5-fluorouridine à -165,8 ppm. Le spectre de contrôle de 30 min contient une nouvelle résonance de produit de 5-fluorouracil à -169.2 ppm. 19 ans, états-unis qui Les changements chimiques F ont été référencés au trifluoroéthanol externe de 50 M à -76,7 ppm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Données RENR de dose-réponse représentatives et courbe IC50 obtenue pour un composé ayant une activité AGNH utilisant 1H RMN. Régions des spectres de réaction de 1H RMN pour les concentrations variables d'un composé (200-0,20 M) ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min. Les résonances de 6,90 à 7,40 ppm proviennent du composé testé. La courbe IC50 a été adaptée à l'aide de données provenant de jeux de données RMN exécutés en double. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Données recticiennes représentatives de la dose-réponse nMR et courbe IC50 obtenue pour un composé ayant une activité de l'UNH à l'aide de 19RMN F. Régions des spectres de réaction de 19F RMN pour les concentrations variables d'un composé (200-0,20 M) ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min. La courbe IC50 a été adaptée à l'aide de données provenant de jeux de données RMN exécutés en double. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Le contre-écran de détergent représentatif demande un composé ayant une activité AGNH à l'aide de 1RMN H. Régions des spectres de réaction de 1H RMN pour un composé à 100 m et 50 M, ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min, en présence et en l'absence de 0,01 % Triton X-100. Les résonances à 7,10-7,70 ppm et 6,90 et 7,40 ppm proviennent du composé testé et Triton X-100, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Essais de contre-écran de détergent représentatifs pour un composé ayant une activité de l'UNH à l'aide de 19RMN F. Régions des spectres de réaction de 19F RmN pour un composé à 100 m et 50 M, ainsi que des spectres de contrôle de 0 min et 30 min, en présence et en l'absence de 0,01 % Triton X-100. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Le contre-écran de saut-dilution représentatif demande un composé avec l'activité AGNH utilisant 1H RmN. Régions des spectres de réaction de 1H RMN pour un composé à 200 m et 20 M, ainsi que des spectres de contrôle de 30 min. L'enzyme a été incubée pendant 30 min à 200 m composé avant le début des réactions, avec la réaction de 20 M diluée immédiatement avant d'initier la réaction. Les résonances à 6,90-8.30 ppm proviennent du composé testé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : Le contre-écran de saut-dilution représentatif est adapté à un composé ayant une activité de l'UNH à l'aide de 19RMN F. Régions des 19spectres de réaction de la RMN F pour un composé à 200 m et 20 M, ainsi que des spectres de contrôle de 30 min. L'enzyme a été incubée pendant 30 min à 200 m composé avant le début des réactions, avec la réaction de 20 M diluée immédiatement avant d'initier la réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10
Figure 10 : Tests représentatifs dans des cellules entières à l'aide de 1RmNH H. Régions des spectres de réaction de 1H RMN pour les échantillons contenant soit 280 l de cellules E. coli rechargées en tampon (0, 15 et 30 min) ou supernatant de médias de croissance cellulaire (30 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 11
Figure 11 : Tests représentatifs dans des cellules entières à l'aide de 19RMN F. Régions des 19spectres de réaction De la RMN F pour les échantillons contenant soit 280 l de cellules E. coli resuspendues en tampon (0, 15, 30 et 60 min) ou supernatant de médias de croissance cellulaire (60 min). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les protocoles décrits s'appliquent généralement à de nombreuses enzymes, à condition que les substrats et/ou les produits aient des signaux résolvables dans le spectre de la RMN. Cependant, il est essentiel que la concentration de substrat soit proche de sa valeur Km et suffisamment élevée pour être détectée dans une expérience de RMN dans un délai raisonnable. Une concentration de substrat ne s'est pas supérieure à 2-3x la valeur de Km est optimale pour détecter les inhibiteurs concurrentiels, non concurrentiels, et non concurrentiels4. Comme démontré ici pour UNH, substrat, Km valeurs aussi bas que 15 M sont appropriés. L'utilisation de substrats avec des signaux CH3 ou CF3, couplée à la collecte de données RMN sur les sondes cryogéniques, peut abaisser ce seuil encore plus loin15. Les enzymes dont le substratest inférieur à 1 M, cependant, sont probablement difficiles à étudier en utilisant cette méthode en raison de la faible sensibilité inhérente de l'expérience RMN. Dans ces situations, la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence sont des techniques plus appropriées.

Une autre limitation à l'application de ces méthodes est un agent d'étanchéité approprié. Tous les protocoles décrits ici sont des essais à temps fixe, avec la réaction éteinte après 30 min par l'ajout de HCl. Pour AGNH et UNH, il avait été précédemment déterminé que HCl a immédiatement arrêté la réaction, et l'a gardée pendant des périodes de semaines9,10. Ceci est important car des dizaines de réactions sont souvent courues simultanément, puis en file d'attente pour la collecte de données RMN sur une période de plusieurs heures. Il est également important d'établir que la dégradation non enzymatique du substrat ou des signaux du produit ne se produit pas après l'étanchéité, mais avant la collecte de données rmnènes. En plus de HCl, d'autres manières communes pour éteindre des réactions sont par l'addition d'un inhibiteur nanomolaire connu16 ou, dans le cas des réactions impliquant le triphosphate d'adénosine, l'addition de l'acide éthylènediaminetetratraacetic d'agent de chélatage17.

Les tests d'activité basés sur la RMN apportent une valeur ajoutée lorsqu'ils sont utilisés pour le dépistage par fragments ou les essais orthogonaux pour valider les résultats du dépistage à haut débit4. Contrairement aux essais contraignants, les essais d'activité basés sur la RMN identifient ou confirment les composés comme inhibiteurs réels. Les essais d'activité utilisent également beaucoup moins d'enzymecible que les essais de liaison. Les mêmes méthodes sont incroyablement robustes pour deux types de contre-écrans effectués pour valider l'activité réversible, spécifique à la cible et exclure l'activité d'analyse artifactual18. Les essais de détergent et de saut-dilution sont des contre-écrans pour l'agrégation colloïdale19 et l'inhibition irréversible20,respectivement. Les composés qui réussissent ces tests sont validés points de départ pour la chimie médicinale et l'optimisation des inhibiteurs guidés par la structure. Les essais d'activité basés sur la RMN peuvent continuer à fournir des données sur l'activité composée au fur et à mesure que le projet progresse vers les inhibiteurs des nanomolaires.

Enfin, l'utilité de ces tests pour la surveillance des réactions dans les cellules entières est remarquable21. L'inhibition de corrélatification de l'enzyme purifiée avec l'inhibition de l'enzyme dans les cellules fournirait la preuve définitive du mécanisme biochimique sous-jacent à l'effet phénotypique observé22. Pour les deux enzymes présentées ici, l'effet phénotypique souhaité est la perte de viabilité (activité antitricolomonale). Une corrélation entre l'inhibition épurée d'enzyme, l'inhibition d'enzyme dans-cellule, et la mort de cellules parasites constituerait la preuve du mécanisme d'inhibiteur de l'action.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Dean Brown d'avoir fourni des composés de la bibliothèque de fragments d'AstraZeneca et le Dr David Parkin d'avoir fourni les enzymes AGNH et UNH. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R15AI128585 à B. J. S. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.Research a également été soutenu par une bourse de recherche d'été Horace G. McDonell décernée à S. N. M., une famille Landesberg Bourse décernée à J. A. G., subventions de perfectionnement du corps professoral et prix de recherche Frederick Bettelheim de l'Université Adelphi à B. J. S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

Chimie Numéro 148 contre-écran détergent analyse d'activité enzymatique valeur IC50, saut-dilution 1H RMN 19F RMN RMN cellulaire entière ribohydrolase nucléoside
Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC<sub>50,</sub> l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter