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खुदरा खाद्य नमूनों में क्लोस्ट्रिडियम perfringens toxinotypes की समृद्धि और जांच

Published: October 18, 2019 doi: 10.3791/59931
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Brain and Mind Institute, Weill Cornell Medical College
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्थानीय रूप से खरीदे गए खाद्य पदार्थों में विभिन्न क्लोस्ट्रिडियम perfringens toxins का पता लगाने के लिए है, विशेष रूप से एप्सिलॉन विष तनाव प्रकार बी और डी का उत्पादन, अवायवीय कक्षों के उपयोग के बिना.

Abstract

क्लोस्ट्रिडियम perfringens (सी perfringens) एक विपुल विष उत्पादक है और विभिन्न मेजबानों में रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है. C. perfringens पांच अलग toxinotypes में वर्गीकृत किया गया है, ए के माध्यम से ई, चार प्रमुख विष जीन की गाड़ी पर आधारित है. प्रसार और इन विभिन्न toxinotypes के वितरण understudied है, विशेष रूप से अमेरिकी खुदरा भोजन में उनकी व्यापकता. हमारे लिए विशेष रुचि के प्रकार बी और डी उपभेदों, जो एप्सिलॉन विष का उत्पादन कर रहे हैं, एक अत्यंत घातक विष मनुष्यों में एकाधिक काठिन्य के पर्यावरण ट्रिगर होने का सुझाव दिया. विभिन्न खाद्य नमूनों में विभिन्न सी perfringens toxinotypes की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए, हम चुनिंदा एक अवायवीय कंटेनर प्रणाली केवल तीन culturing कदम शामिल के उपयोग के बिना इन बैक्टीरिया संस्कृति के लिए एक आसान तरीका विकसित की है. खाद्य स्थानीय किराने की दुकानों से खरीदा है और परिवेश की स्थिति के तहत प्रयोगशाला में ले जाया जाता है। नमूनों कीमा बनाया जाता है और संशोधित तेजी से perfringens मीडिया (आरपीएम) में inoculated और एक सील, airtight शंकु ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर incubated. रात भर संस्कृतियों ठोस Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar के एक नीचे की परत पर inoculated रहे हैं, और फिर पिघला हुआ TSC agar के एक शीर्ष परत के साथ मढ़ा, एक "सैंडविच", अवायवीय वातावरण बनाने. आगर प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट किया जाता है और फिर काले, सल्फाइट-कम करने वाली कालोनियों की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया जाता है। सी perfringens-संदिग्ध कालोनियों बाँझ आंख droppers का उपयोग कर TSC आगर से हटा रहे हैं, और RPM में inoculated और एक airtight शंकु ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उप संस्कृति. डीएनए RPM subculture से निकाला जाता है, और फिर C. polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के माध्यम से विष जीन perfringens की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया. नमूने के प्रकार के आधार पर, आम तौर पर 15-20% नमूने सी perfringensके लिए सकारात्मक परीक्षण .

Introduction

क्लोस्ट्रिडियम पर्फ्रिंग्स (सी. perfringens) एक ग्राम सकारात्मक, अवायवीय, बीजाणु बनाने, रॉड आकार जीवाणु है कि पर्यावरण में सर्वव्यापी पाया जाता है. बैक्टीरिया की इस प्रजाति में ऐसे जीन होते हैं जो 17 से अधिक विषाक्त पदार्थों के लिए सांकेत: सांकेत: बदलते हैं और ऐतिहासिक रूप से चार अलग-अलग विष जीनों की उपस्थिति के आधार पर पांच विष-प्रकार (ए-ई) में पहचाने जाते हैं: अल्फा, बीटा, एप्सिलॉन, और जरा विष(तालिका 1)1. हाल ही में, यह सुझाव दिया गया है कि इस टाइपिंग-स्कीम को प्रकार एफ और जी को शामिल करने के लिए विस्तारित किए जाने की आवश्यकता है, जो सी perfringens enterotoxin (सीपीई) और NetB विष, क्रमशः2बंदरगाह. हालांकि, इस sheming प्रणाली औपचारिक रूप से स्वीकार किया जाता है इससे पहले कि और अधिक शोध की जरूरत है. जबकि अल्फा विष जीन सख्ती से गुणसूत्रीय स्थित है, सीपीई जीन गुणसूत्र और प्लाज्मिड दोनों पर पाया जा सकता है। तुलना में, शेष विषाक्त पदार्थों 'जीन विभिन्न अलग आकार प्लाज्मिड पर पाए जाते हैं. हम विशेष रूप से सी perfringens प्रकार बी और डी के प्रसार में रुचि रखते हैं के रूप में इन उपभेदों एप्सिलॉन विष का उत्पादन, एक अत्यंत शक्तिशाली, छिद्र बनाने विष, जो एकाधिक स्क्लेरोसिस ट्रिगर में एक भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है (एमएस) मनुष्यों में3 ,4,5,6,7. कैसे लोगों को संक्रमित हो या इन उपभेदों से उपनिवेश अज्ञात है. एक संभव विवरण दूषित खाद्य उत्पादों की खपत के माध्यम से है. इस सवाल का जवाब देने में मदद करने के लिए, हम विभिन्न सी अमेरिकी खाद्य नमूनों में toxinotypes perfringens की व्यापकता निर्धारित करने की मांग की.

अमेरिकी खाद्य नमूनों में सी perfringens toxinotypes की उपस्थिति understudied है और अक्सर अवायवीय कंटेनर प्रणालियों और कई उप-कुलिंग कदम8,9,10,11 के उपयोग की आवश्यकता है . हालांकि कई उप-पलिंग कदम शुद्ध अलग प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, इस विधि समय12,13,14के साथ प्लाज्मिड की हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं , संभवतः प्लाज्मिड जनित विष जीन का पता लगाने को प्रभावित एप्सिलॉन विष जीन सहित. हम एक आसान विधि विकसित करने की मांग की, कम उप-कुलिंग कदम के साथ, चुनिंदा संस्कृति सी perfringens अवायवीय कक्षों, जार, या बैग के उपयोग के बिना. संक्षेप में, खाद्य नमूनों को रैपिड परफ्रिंग्स मीडिया (आरपीएम) रात भर (ऑन) में टीका लगाया जाता है, फिर टीएससी आगर में "सैंडविच" और इनक्यूबेट ऑन। सी perfringens होने का संदेह कालोनियों तो RPM में उप-संस्कृति और फिर से पर incubated कर रहे हैं. डीएनए निकाला जाता है और पीसीआर जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए किया जाता है (चित्र 1)। हम RPM का उपयोग करने के लिए चुना है के रूप में यह अन्य अधिक मानक मीडिया15की तुलना में खाद्य नमूनों से सी perfringens उपभेदों की वसूली में वृद्धि करने के लिए प्रदर्शन किया गया है . इसके अलावा, RPM सफलतापूर्वक एक एमएस रोगी से एक epsilon विष उत्पादन प्रकार बी तनाव को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था4. हम आसान डीएनए निष्कर्षण की अनुमति देने के लिए मूल संस्करण के बजाय RPM का एक संशोधित संस्करण का उपयोग करें। हालांकि इस विधि के नमूनों के भीतर विष जीन की आसान पहचान की अनुमति देता है, यह संभव है कि एक व्यक्ति के नमूने में एक से अधिक सी perfringens toxinotype शामिल होंगे. क्योंकि हमारी विधि शुद्धीकरण के कई दौर का उपयोग कर शुद्ध उपभेदों को अलग नहीं करता है, एक नमूने से कई toxinotypes की पहचान संभव नहीं है. हालांकि, मानक शुद्धि तकनीक (आमतौर पर टीएससी प्लेटों या रक्त agar प्लेटों पर लकीर) शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल के अंत में लागू किया जा सकता है.

Protocol

नोट: सी perfringens एक जैव सुरक्षा खतरा स्तर 2 (BSL2) जीव माना जाता है. हालांकि सभी खाद्य नमूनों में सी perfringensशामिल नहीं होगा, सभी सुसंस्कृत नमूनों के रूप में इस तरह के व्यवहार किया जाना चाहिए. सभी उचित सावधानियों और कर्मियों सुरक्षात्मक उपकरण (PPE) हर समय पहना जाना चाहिए. निपटान से पहले सभी सामग्री को दूषित करना।

1. संशोधित RPM4,15 तैयार करें

  1. मिश्रण 30 g/L तरल पदार्थ थायोग्लाइकोलेट मध्यम, 60 ग्राम/L जिलेटिन, 5 g/L peptone, 5 g/L ग्लूकोज, 5 g/L पोटेशियम फॉस्फेट dibasic, 3 g/L खमीर निकालने, 1.5 g/L सोडियम क्लोराइड, 0.5 ग्राम/ हम आम तौर पर 1 एल बैच बनाते हैं।
  2. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव।
  3. लगभग 40 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें।
  4. एक बार RPM ठंडा है, 440 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डी-cycloserine जोड़ें /
    नोट: D-cycloserine के स्टॉक सांद्रता 50 मिलीग्राम/एमएल पर बाँझ पानी में भंग भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. आरपीएम के 10 एमएल को 15 एमएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें। RPM बैचों में तैयार किया जा सकता है और एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. गर्म RPM करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने से पहले.

2. नमूना संग्रह और RPM ऊष्मायन

  1. 1 ज के भीतर परिवेश के तापमान के तहत प्रयोगशाला में परिवहन भोजन मूल पैकेजिंग या बाँझ कंटेनरों में ले जाया जा सकता है। यदि तुरंत परीक्षण नहीं, भोजन -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक उपयोग करें. पैकेजिंग लेबल के अनुसार भोजन के प्रकार और मूल देश, यदि उपलब्ध हो, साथ ही किसी भी अन्य प्रासंगिक जानकारी का ध्यान दें।
  2. लगभग 1.0-2.0 ग्राम भोजन निकालें और बाँझ पेट्री डिश या समकक्ष को स्थानांतरित करें। एक बाँझ रेजर ब्लेड या स्केलपेल के साथ बारीक कीमा।
  3. 15 एमएल शंकुन कक में फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के 10 एमएल में टीका लगाइए। अच्छी तरह मिला लें।
    1. वनस्पति कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में पीबीएस खाद्य मिश्रण के 5 एमएल हस्तांतरण RPM के 10 एमएल युक्त. ढक्कन को कसकर सुरक्षित करें।
    2. बीजाणुओं के लिए चयन करने के लिए, पीबीएस-खाद्य मिश्रण के शेष 5 एमएल को 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और फिर 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल आरपीएम है। ढक्कन को कसकर सुरक्षित करें।
  4. भंवर और पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए खाद्य-आरपीएम संस्कृतियों को उलटा।
  5. शंकु ट्यूबों को कसकर सील करें और एक अवायवीय वातावरण सुनिश्चित करने के लिए पैराफिन फिल्म या प्लास्टिक की चादर के साथ ढक्कन लपेटें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (ऑन) इनक्यूबेट करें।
  7. अगली सुबह आरपीएम ट्यूबों में किसी भी अस्थिरता या किण्वन ध्यान दें।

3. टीएससी "सैंडविच" चढ़ाना

  1. नीचे वर्णित "सैंडविच" तकनीक का उपयोग करते हुए टीएससी आगर में आरपीएम संस्कृतियों पर टीका लगाना (चित्र 2)
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार टीएससी आगर तैयार करें।
    1. टीएससी प्लेटों की आधार परत को 10 एमएल पिघला हुआ टीएससी गार को बाँझ पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित करके और ठोस करने की अनुमति दें। इन्हें उन्नत में तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि प्लेटों का उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म कर रहे हैं।
    2. टीएससी प्लेट की शीर्ष परत के लिए, शेष पिघला हुआ टीएससी एगार को 40 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
      नोट: यद्यपि ऐगार का गलन बिंदु 85 डिग्री सेल्सियस से ऊपर होता है, पिघले हुए ऐगार लगभग 32-45 डिग्री सेल्सियस जम जाता है।
  3. ध्यान से ON RPM संस्कृतियों को पुनर्प्राप्त करें और TSC agar आधार करने के लिए 100 $L स्थानांतरित करें। किण्वन की वजह से, कुछ संस्कृतियों के दबाव में हो सकता है. सभी उपयुक्त PPE पहनने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. बाँझ ग्लास मोती या सेल स्प्रेडर का उपयोग कर के साथ आरपीएम इनोकुलम फैलाएं।
  5. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए टीएससी आगर में RPM को "अवशोषित" होने की अनुमति दें।
  6. सावधानी से पिघला हुआ 20 एमएल, 40 डिग्री सेल्सियस टीएससी agar एक serological पिपेट का उपयोग कर प्लेट के लिए स्थानांतरण।
  7. पेट्री डिश ढक्कन को बदलें और टीएससी आगर को कमरे के तापमान पर पूरी तरह से जमने दें।
  8. पेट्री डिश और इनक्यूबेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर उलटा करें।
  9. सीरियल कमजोर पड़ने वांछित हैं, तो TSC agar में टीका लगाने से पहले ताजा, पूर्व-वार्म्ड RPM में ON RPM संस्कृतियों के कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं।

4. सल्फेट कम करने वाली कालोनियों का उप-कुलीकरण

  1. अगली सुबह, इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और जीवाणु विकास के लिए जांच करें। एरोबिक जीवाणु आगर की सतह पर उपस्थित हो सकते हैं। एनारोबिक बैक्टीरिया आगर के भीतर एम्बेडेड बढ़ पाया जाएगा। Sulfite कम करने बैक्टीरिया के आसपास के agar काले हो जाएगा. संभावित सी perfringens कालोनियों काले और agar में एम्बेडेड हो जाएगा.
  2. C. perfringens संदिग्ध कालोनियों सल्फेट कमी के लिए सकारात्मक हो जाएगा और काले दिखाई देगा, agar के भीतर एम्बेडेड. एक बाँझ, एकल उपयोग eyedropper का उपयोग करना, "pluck" agar से काले कालोनियों और एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में ताजा RPM के 10 एमएल के लिए स्थानांतरण. यह महत्वपूर्ण है कि आईड्रॉपर से हवा को भेदी आगर से पहले निष्कासित किया जाए।
  3. यदि प्लेट की सतह पर एरोबिक जीवाणु वृद्धि की एक घनी मात्रा है, तो चयनित क्षेत्रों से कालोनियों को हटाने के लिए एक बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग करें। एकाधिक सी perfringens संदिग्ध कालोनियों अलग RPM संस्कृतियों में एक ही TSC प्लेट से नमूना किया जा सकता है.
  4. तंग सुरक्षित शंकु ट्यूब lids और पैराफिन फिल्म या प्लास्टिक की चादर में लपेटो. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

5. डीएनए निष्कर्षण

  1. पर RPM संस्कृतियों निकालें और turbidity और किण्वन सहित विकास के संकेत के लिए जांच.
  2. किसी भी बसे बैक्टीरिया को फैलाने और सावधानी से खोलने के लिए धीरे-धीरे आरपीएम संस्कृति को उलटा करें। एक microcentrifuge ट्यूब करने के लिए संस्कृति के 1 एमएल स्थानांतरण.
  3. शीर्ष गति पर सेंट्रीफ्यूज (लगभग 15,000 x ग्राम) 10 मिनट के लिए गोली बैक्टीरिया के लिए.
  4. बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ गोली धो लो.
    1. कुछ परिस्थितियों में, अपाच्य जिलेटिन गोलीबैक्टीरिया के शीर्ष पर बस जाएगा. जिलेटिन को दूर करने के लिए, धीरे एक micropipette का उपयोग कर PBS के साथ आंदोलन करके जिलेटिन बंद "फ्लफ". यह जीवाणु गोली बरकरार छोड़ने के दौरान जिलेटिन "फ्लफ-अप" होगा।
    2. कोमल आकांक्षा के साथ पीबीएस-जेलटिन मिश्रण निकालें। ताजा पीबीएस के 1 एमएल के साथ शेष जीवाणु गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. 10 मिनट के लिए शीर्ष गति पर resuspended जीवाणु गोली centrifuge और ध्यान से supernatant प्रेरित.
  6. तुरंत एक डीएनए निष्कर्षण किट और एक प्रोटोकॉल विशेष रूप से ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया से निष्कर्षण डीएनए के लिए बनाया का उपयोग कर डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें).
  7. पीसीआर विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत निकाले गए डीएनए का उपयोग करें या स्टोर करें।

6. पीसीआर जीनोटाइपिंग के माध्यम से सी perfringens की जांच

  1. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या संस्कृतियां सी के लिए सकारात्मक हैं, तो पीसीआर के माध्यम से विभिन्न विष जीनों के लिए निकाले गए डीएनए की जांच करें।
    नोट: क्योंकि हम सबसे अधिक रुचि रखते हैं epsilon विष उत्पादन उपभेदों प्रकार बी और डी सी perfringens,हम अल्फा, बीटा, और एप्सिलॉन विष जीन की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन. प्राइमर तालिका 2में सूचीबद्ध हैं। 16s राइबोसोमल डीएनए के लिए प्राइमर एक डीएनए निष्कर्षण नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। अतिरिक्त प्राइमर का उपयोग जी के माध्यम से विषाक् तों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है और इसे प्रकाशित साहित्य2,12,13में पाया जा सकता है .
  2. पहले निकाले गए सी का प्रयोग करें एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में डीएनए perfringens. यह नियंत्रण सुनिश्चित करता है कि PCR प्रतिक्रियाओं के सभी घटक काम कर रहे हैं. हम अपने सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सी perfringens प्रकार बी (ATCC 3626) से निकाले गए डीएनए का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर RPM में ATCC 3636 पर वृद्धि और चरण 5-1-5.7 में वर्णित एक ही तरीके का उपयोग कर डीएनए निकालें। उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर निकाले डीएनए स्टोर।
  3. पीसीआर शर्तों को निम्नानुसार सेट करें: 3 मिनट के लिए 94.0 डिग्री सेल्सियस; 30 s के लिए 94.0 डिग्री सेल्सियस; 30 s के लिए 47.9 डिग्री सेल्सियस, 72.0 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट के लिए (35 चक्रों के लिए 2-4 दोहराएँ); 10 मिनट के लिए 72.0 डिग्री सेल्सियस।
  4. PCR उत्पादों की पुष्टि करने के लिए, मानक तकनीकों का उपयोग करके 1.8 g/100 एमएल agarose जेल पर PCR प्रतिक्रियाओं को चलाएँ. अपेक्षित PCR उत्पाद आकार तालिका 2में सूचीबद्ध हैं। विशिष्ट PCR परिणाम चित्र 3 में प्रदर्शित किए जातेहैं।

Representative Results

इस विधि का उपयोग करते हुए, हमारे नमूनों में से 15-20% सी perfringensके लिए सकारात्मक परीक्षण | जबकि सबसे उपभेदों toxinotype ए के लिए सकारात्मक रहे हैं, हम सफलतापूर्वक दोनों प्रकार बी और डी खाद्य नमूनों में पता चला है. एक पहले प्रकाशित कागज में हम न्यूयॉर्क खुदरा स्टोर से खरीदे गए 216 खाद्य नमूनों की कुल परीक्षणकिया 16 (तालिका 3). इन नमूनों में विभिन्न मांस के नमूने (बीफ, भेड़ का बच्चा, सूअर का मांस और भेड़ का बच्चा), पोल्ट्री नमूने (चिकन और टर्की), और समुद्री भोजन के नमूने (कॉड, सामन, शेलफिश, स्नैपर, फ्लौंडर, स्क्विड, टिलपिया, ट्यूना, और विभिन्न अन्य मछलियों) शामिल थे। उत्पादन और डेयरी नमूनों की भी जांच की गई। 216 नमूनों में से 34 (16%) सी perfringensके लिए सकारात्मक थे . 34 सी perfringens सकारात्मक नमूनों में से, 31 नमूने (91.2%) अल्फा विष निहित, एक नमूना (2.9%) अल्फा, बीटा और एप्सिलॉन विष निहित है, और दो नमूने (5.9%) अल्फा और एप्सिलॉन विष निहित.

दिलचस्प बात यह है कि हमने यह भी पाया कि सी perfringens बीजाणुओं की तुलना में वनस्पति कोशिकाओं के रूप में अधिक प्रचलित था. पच्चीस नमूनों की तुलना वनस्पति सी पर्सार्स कोशिकाओं या बीजाणुओं की उपस्थिति के लिए की गई थी। बीजाणुओं के लिए 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी चौंकाने वाले नमूनों के लिए चुना गया था. परीक्षण किए गए 25 नमूनों में से 16% वनस्पति सी के लिए सकारात्मक थे जो बीजाणुओं के लिए 4% की तुलना में प्रतिस्पर्धियों के लिए हैं। यह इंगित करता है कि यह दोनों के बजाय केवल वनस्पति कोशिकाओं के लिए परीक्षण करने के लिए और अधिक लागत प्रभावी हो सकता है.

Figure 1
चित्र 1: प्रक्रिया का अवलोकन.
खाद्य नमूनों को कीमा बनाया जाता है और बाँझ पीबीएस में पतला कर दिया जाता है। पीबीएस खाद्य नमूने का आधा वनस्पति कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए आरपीएम में टीका लगाया है। शेष पीबीएस-खाद्य नमूने गर्मी 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर हैरान है RPM में टीका लगाने से पहले बीजाणुओं के लिए चयन करने के लिए। संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है, फिर टीएससी आगर में चढ़ाया जाता है। टीएससी आगर को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया है और काले, सल्फेट-कम करने वाली संस्कृतियों को ताजा आरपीएम में उप-संस्कृत किया जाता है। उप-संस्कृत आरपीएम संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है और पीसीआर के माध्यम से जीनोटाइपिंग करने के लिए डीएनए निकाला जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: TSC agar सैंडविच तकनीक के Schematic.
सी perfringens बैक्टीरिया युक्त RPM मीडिया एक अवायवीय वातावरण को बढ़ावा देने के क्रम में TSC agar की दो परतों के बीच चढ़ाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: चयनित PCR परिणाम.
C. के जीनोटाइपिंग परिणामों के उदाहरण प्रतिबिंब सात विभिन्न प्रकार के भोजन से प्रतिक्षेपित होते हैं, तथा C. के सकारात्मक नियंत्रण का कोई सकारात्मक नियंत्रण प्रकार ठ. एक आणविक वजन सीढ़ी (प्रत्येक जेल की पहली लेन) आधार जोड़े (बीपी) में पीसीआर परिणामों के आकार का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

टॉक्सिनोटाइप अल्फा बीटा एप्सिलॉन जरा Cpe NetB
स्थापित एक + - - - - -
बी + + + - - -
सी + + - - + -
D + - + - + -
ई + - - + + -
प्रस्तावित F + - - - + -
जी + - - - - +
+ वर्तमान
- मौजूद नहीं
+/- मौजूद हो सकता है या नहीं हो सकता है

तालिका 1: C. perfringens जीनोटाइप का अवलोकन. प्रत्येक सी द्वारा उत्पादित विषाक्त पदार्थों के संयोजन का एक चार्ट विषप्ररूप को प्रतिकार करता है।

लक्ष्य प्राइमर जोड़े अपेक्षित पीसीआर उत्पाद (बीपी)
अल्फा एफ: जीसीटी एएटी जीटी एक्ट जीसीसी जीटी जीए
आर: सीसीटी सीटीजी एटीए कैट CGT GTA एजी		 325
बीटा एफ: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA
आर: जीसीए जीसीए एसीए टा टा जीटीए सीटीटी सी		 196
एप्सिलॉन एफ: जीसीजी GTG ATA टीसी एटीसी एटीटी टीसी
आर: सीसीए सीटीटी अधिनियम TGT CCT अधिनियम एएसी		 655
16s आरएनए एफ: AGA GTT TGA TCC TGG सीटीसी ए
आर: जीजीटी टीएसी सीटीटी जीटी ए सी जी अधिनियम टी		 $1300

तालिका 2: Primers और चयनित विष जीन के लिए उम्मीद पीसीआर उत्पादों. पीसीआर जीनोटाइपिंग चरण में इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर।

खाद्य प्रकार टाइप A प्रकार B प्रकार C टाइप डी C. पर्फ +
ऐल्फा विष धनात्मक अल्फा, बीटा, और एप्सिलॉन विष सकारात्मक ऐल्फा और बीटा विष धनात्मक ऐल्फा और एप्सिलॉन विष धनात्मक
एन एन % एन % एन % एन % एन %
मांस गाय का मांस 38 8 21% 1 3% 0 0% 0 0% 9 24%
भेड़ 10 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
सूअर का मांस 15 2 13% 0 0% 0 0% 0 0% 2 13%
मिश्रित 1 1 100% 0 0% 0 0% 0 0% 1 100%
उपयोग 64 11 17% 1 2% 0 0% 0 0% 12 19%
पोल्ट्री चिकन 19 5 26% 0 0% 0 0% 0 0% 5 26%
तुर्कस्तान 7 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
उपयोग 26 5 19% 0 0% 0 0% 0 0% 5 19%
समुद्री भोजन कॉड 4 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
मिश्रित 1 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
सामन 11 2 18% 0 0% 0 0% 0 0% 2 18%
निधानी जैसा 32 1 3% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
स्नैपर 4 3 75% 0 0% 0 0% 0 0% 3 75%
अशुद्धि 12 4 33% 0 0% 0 0% 0 0% 4 33%
विद्रूप 4 1 25% 0 0% 0 0% 0 0% 1 25%
Tilapia 21 2 10% 0 0% 0 0% 2 10% 4 19%
ट्यूना 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
अन्य 8 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 1 13%
उपयोग 100 14 14% 0 0% 0 0% 2 2% 16 16%
डेयरी गाय 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
बकरी 4 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
दूध 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
उपयोग 10 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
उत्पादन करना सब्जी 12 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 1 8%
फल 1 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
जड़ी बूटी 3 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0%
उपयोग 16 1 6% 0 0% 0 0% 0 0% 1 6%
कुल 216 31 14% 1 0.50% 0 0% 2 0.90% 34 16%

तालिका 3: विभिन्न सी की prevalence 216 खाद्य नमूनों में toxinotypes perfringes. C. perfringensके लिए खुदरा भोजन का परीक्षण करने के लिए इस विधि का उपयोग करते समय प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण . इस सारणी को पहले प्रकाशित पांडुलिपि रेगन एट अल से संशोधित किया गयाहै।

Discussion

यहाँ हम सीमित subculturing के साथ खुदरा खाद्य नमूनों में और एक अवायवीय कक्ष प्रणाली के उपयोग के बिना सी perfringens प्रसार की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि के खाद्य नमूनों से सी perfringens की पहचान बढ़ाने के लिए तकनीकों का एक संयोजन का उपयोग करता है. RPM मीडिया के एक संशोधित संस्करण का उपयोग करके, हम C. perfringensके चयनात्मक विकास के लिए अनुमति देते हैं। टीएससी आगर की परतों के बीच में टीका कृतिक आरपीएम को सैंडविच करके, हम सी perfringensकी विशेषता अवायवीय, सल्फाइट कम करने वाले बैक्टीरिया की पहचान करने और उन्हें अलग करने में सक्षम हैं। सी perfringensकी उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, सल्फाइट कम कालोनियों ताजा RPM में उप-संस्कृति रहे हैं। संशोधित संस्करण या RPM हमें आसानी से संस्कृतियों से डीएनए निकालने के लिए अनुमति देता है, विशिष्ट विष जीन की पीसीआर पुष्टि को सक्षम करने. सी perfringens दूषित खाद्य नमूनों की पुष्टि तीन दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है.

प्रारंभिक प्रयोगों में, खाद्य नमूनों बस आरपीएम और डीएनए पर संस्कृतियों से निकाले में inoculated थे. इस विधि के परिणामस्वरूप नमूनों की सीमित संख्या में C. perfringens का पता लगाने के परिणामस्वरूप (डेटा नहीं दिखाया गया). यद्यपि RPM C. perfringens वृद्धि के लिए चयनात्मक है, यह C. perfringens वृद्धि के लिए अनन्य नहीं है। अन्य, ग्राम सकारात्मक, डी-साइकॉल्सरीन प्रतिरोधी बैक्टीरिया अभी भी आरपीएम में विकसित हो सकते हैं। हम hypothesized है कि अन्य जीवाणु प्रजातियों द्वारा संदूषण हमारी पहली ON RPM संस्कृति में हमारे पीसीआर विश्लेषण की संवेदनशीलता को कम करके सी perfringens उपभेदों के हमारे पता लगाने में कमी आई है हो सकता है. सी perfringens का पता लगाने को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण कदम TSC agar "सैंडविच" तकनीक का समावेश किया गया था. यह हमें अंतर करने के लिए अनुमति दी और अवायवीय, सल्फाइट कम कालोनियों, सी perfringens की विशेषता के लिए चयन करें. इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि पिघला हुआ टीएससी आगर की शीर्ष परत 40 डिग्री सेल्सियस पर है। हालांकि कुछ सी perfringens उपभेदों वृद्धि हुई तापमान पर विकसित कर सकते हैं (46-48 डिग्री सेल्सियस)15,16, बढ़ी हुई तापमान पर पिघला हुआ आगर के अलावा बहुत बरामद संस्कृतियों की मात्रा कम कर देता है, ज्यादातर सेल मौत के कारण होने की संभावना .

इस विधि के लिए कई संभावित सीमाएँ हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, न तो आरपीएम और न ही टीएससी आगर विशेष रूप से सी perfringens के लिए चयन करता है या अंतर करता है, खाद्य नमूनों में मौजूद अन्य जीवाणु प्रजातियों के विकास के लिए अनुमति देता है। यह केवल C. perfringens के लिए चयन करने के लिए परख की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं. हालांकि, यह लगभग सभी culturing तकनीकों में एक आम सीमा है. शुद्ध अलग की जीनोटाइपिंग पुष्टि निश्चित रूप से सी perfringens और अन्य जीवाणु प्रजातियों की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है। इस अध्ययन की एक और सीमा यह है कि हम शुद्ध अलग परीक्षण नहीं है. हम जानबूझकर यह subculturing की मात्रा को सीमित करने के लिए किया था, के रूप में बार-बार subculturing प्लाज्मिड नुकसान में परिणाम की आशंका है. क्योंकि हम शुद्धता के लिए अलग नहीं है, यह संभव है कि कई सी perfringens toxinotypes एक ही नमूना या subculture में मौजूद हो सकता है. यदि शोधकर्ताओं को शुद्ध अलग प्राप्त करना चाहते हैं, मानक शुद्धि विधियों पिछले RPM संस्कृति इस विधि में वर्णित पर इस्तेमाल किया जा सकता है; यह आम तौर पर अवायवीय कक्षों के उपयोग की आवश्यकता है. हालांकि मूल रूप से भोजन से C. perfringens को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया, इस विधि की पहचान करने और सी स्रोतों की एक भीड़ से perfringens को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, इस विधि का एक ऐसा ही अनुप्रयोग मनुष्यों (या जानवरों) से मल के नमूनों का परीक्षण करना है जो संक्रमण के स्रोत को बेहतर ढंग से समझने के लिए बैक्टीरिया को सी perfringens और toxinotype से संक्रमित होने का संदेह है।

Disclosures

कोई प्रकटीकरण नहीं.

Acknowledgments

इस शोध को सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं लाभ क्षेत्रों के लिए से कोई विशिष्ट धन प्राप्त नहीं किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Cycloserine Sigma-Aldrich C6880
Dextrose Sigma Life Science D9434-250G
Disposable Transfer Pipets any brand Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69504 Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.
Dry Incubator any brand
Fluid thioglycolate medium Remel R453452
Gelatin from porcine skin Sigma Life Science G1890-500G
Individual Primers Invitrogen
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma Life Science F8633-250 G
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876 Needed for DNA extraction, not provided in kit
microcentrifuge tube any brand
parafilm or plastic wrap any brand
Peptone from casein and other animal proteins Sigma-Aldrich 70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) Oxoid CM0587 Make TSC agar according to instructions
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222-100G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S-7653
Sterile Cell Scraper any brand
Sterile cell Spreader any brand
Sterile petri dishes any brand
Supplies and equipment for gel electrophoresis any brand
table top centrifuge any brand
Taq PCR Master Mix Kit Qiagen 201443
Thermocycler for PCR reaction any brand
water bath any brand
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161-100G

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 152 क्लोस्ट्रिडियम perfringens,एप्सिलॉन विष जीनोटाइप विषटाइप खुदरा खाद्य नमूने अमेरिकी
खुदरा खाद्य नमूनों में <em>क्लोस्ट्रिडियम perfringens</em> toxinotypes की समृद्धि और जांच
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Anwar, Z., Regan, S. B., Linden, J.… More

Anwar, Z., Regan, S. B., Linden, J. Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples. J. Vis. Exp. (152), e59931, doi:10.3791/59931 (2019).

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