Summary
L'objectif de ce protocole est de détecter différents toxinotypes de Clostridium perfringens dans les aliments achetés localement, en particulier la toxine d'epsilon produisant des types de souche B et D, sans l'utilisation des chambres anaérobies.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) est un producteur prolifique de toxines et provoque un large éventail de maladies chez divers hôtes. C. perfringens est classé en cinq toxines différentes, A à E, basées sur le transport de quatre gènes toxiques majeurs. La prévalence et la distribution de ces divers toxinotypes sont sous-étudiées, en particulier leur omniprésence dans les aliments au détail américains. Nous sommes particulièrement intéressés par les souches de type B et D, qui produisent de la toxine epsilon, une toxine extrêmement mortelle suggérée comme le déclencheur environnemental de la sclérose en plaques chez l'homme. Pour évaluer la présence de différents toxinotypes de C. perfringens dans divers échantillons d'aliments, nous avons développé une méthode facile pour cultiver sélectivement ces bactéries sans l'utilisation d'un système de récipient anaérobie impliquant seulement trois étapes de culture. Les aliments sont achetés dans les épiceries locales et transportés au laboratoire dans des conditions ambiantes. Les échantillons sont hachés et inoculés dans des supports perfringens rapides modifiés (RPM) et incubés pendant la nuit à 37 oC dans un tube conique scellé et hermétique. Les cultures de nuit sont inoculées sur une couche inférieure de solide tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, puis recouverte d'une couche supérieure de gélose TSC fondue, créant un "sandwiched", environnement anaérobie. Les plaques d'agar sont incubées pendant la nuit à 37 oC, puis évaluées pour l'apparition de colonies noires qui réduisent le sulfite. C. perfringens- Les colonies soupçonnées sont retirées de l'agar du TSC à l'aide de gouttes stériles pour les yeux, et inoculées en RPM et sous-cultivées pendant la nuit à 37 oC dans un tube conique hermétique. L'ADN est extrait de la sous-culture RPM, puis analysé pour la présence de gènes de toxine C. perfringens par réaction en chaîne de polymérase (PCR). Selon le type d'aliments échantillonnés, de 15 à 20 % des échantillons sont généralement positifs pour C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) est une bactérie Gram positive, anaérobie, en forme de spore, en forme de tige, qui se trouve partout dans l'environnement. Cette espèce de bactéries porte des gènes qui codent pour plus de 17 toxines et, historiquement, a été caractérisé en cinq toxinotypes (A-E) basé sur la présence de quatre gènes de toxine différents: alpha, bêta, epsilon, et la toxine iota (tableau 1)1. Récemment, il a été suggéré que ce schéma de frappe doit être élargi pour inclure les types F et G, qui abritent l'entérotoxine C. perfringens (CPE) et la toxine NetB, respectivement2. Cependant, d'autres recherches sont nécessaires avant que ce système intrigant ne soit officiellement accepté. Tandis que le gène de toxine alpha est strictement chromosomiquement localisé, le gène de CPE peut être trouvé sur le chromosome et les plasmides. En comparaison, les gènes des toxines restantes se trouvent sur divers plasmides de taille différente. Nous nous intéressons particulièrement à la prévalence des types B et D de C. perfringens, car ces souches produisent de la toxine d'epsilon, une toxine extrêmement puissante qui forme des pores, qui a été suggérée pour jouer un rôle dans le déclenchement de la sclérose en plaques (SEP) chez l'homme3 ,4,5,6,7. On ne sait pas comment les gens sont infectés ou colonisés par ces souches. Une explication possible est par la consommation de produits alimentaires contaminés. Pour aider à répondre à cette question, nous avons cherché à déterminer la prévalence de différents toxinotypes C. perfringens dans les échantillons alimentaires américains.
La présence de c. perfringens toxinotypes dans les échantillons alimentaires américains est sous-étudiée et nécessite souvent l'utilisation de systèmes de conteneurs anaérobies et de nombreuses étapes de sous-culture8,9,10,11 . Bien que de nombreuses étapes de sous-culture soient nécessaires pour obtenir des isolats purifiés, cette méthode peut entraîner une perte de plasmides au fil du temps12,13,14, affectant éventuellement la détection des gènes de la toxine transmis par le plasmide y compris le gène de la toxine epsilon. Nous avons cherché à développer une méthode facile, avec moins d'étapes de sous-culture, à la culture sélective C. perfringens sans l'utilisation de chambres anaérobies, des pots ou des sacs. En bref, les échantillons d'aliments sont inoculés dans Rapid Perfringens Media (RPM) pendant la nuit (ON), puis «sandwichés» dans la gélose TSC et incubé ON. Des colonies soupçonnées d'être des C. perfringens sont alors sous-cultivées en RPM et incubées à nouveau on. L'ADN est extrait et le PCR effectué pour déterminer le génotype (Figure 1). Nous avons choisi d'utiliser la RPM comme il a été démontré pour augmenter la récupération des souches de C. perfringens à partir d'échantillons d'aliments par rapport à d'autres médias plus standard15. En outre, RPM a été utilisé avec succès pour isoler une toxine epsilon produisant la souche de type B d'un patient de SP4. Nous utilisons une version modifiée de RPM au lieu de la version originale pour permettre l'extraction facile de l'ADN. Bien que cette méthode permette une identification facile des gènes de toxine dans les échantillons, il est possible qu'un échantillon individuel contiendra plus d'un toxinotype c. perfringens. Parce que notre méthode n'isole pas les souches purifiées à l'aide de plusieurs tours de purification, l'identification de plusieurs toxinotypes à partir d'un échantillon n'est pas possible. Cependant, des techniques de purification standard (généralement stries sur les plaques TSC ou les plaques d'agar de sang) peuvent être appliquées à la fin de notre protocole pour atteindre les cultures purifiées.
Protocol
REMARQUE : C. perfringens est considéré comme un organisme de niveau 2 (BSL2) de danger pour la biosécurité. Bien que tous les échantillons d'aliments ne contiennent pas de C. perfringens,tous les échantillons cultivés doivent être traités comme tels. Toutes les précautions appropriées et l'équipement de protection du personnel (EPI) doivent être portés en tout temps. Décontaminer tous les matériaux avant l'élimination.
1. Préparer RPM modifié4,15
- Combinez 30 g/L de thioglycolate moyen, 60 g/L de gélatine, 5 g/L de peptone, 5 g/L de glucose, 5 g/L de phosphate de potassium dibasic, 3 g/L extrait de levure, 1,5 g/L de chlorure de sodium, 0,5 g/L de sulfate ferreux dans l'eau deionized jusqu'à ce qu'elle soit dispersée uniformément. Nous fabriquons généralement 1 lots L.
- Autoclave à 121 oC pendant 15 min.
- Laisser refroidir jusqu'à environ 40 oC.
- Une fois que le RPM est frais, ajouter la D-cycloserine à une concentration finale de 440 mg/L.
REMARQUE : Les concentrations de D-cycloserine dissoutes dans l'eau stérile à 50 mg/mL peuvent être stockées à -20 oC pour une utilisation future. - Transférer aseptiquement 10 ml de Tr/min à 15 ml de tubes coniques. La tr/mIN peut être préparée en lots et stockée à 4 oC pendant une année pouvant aller jusqu'à un mois.
- Réchauffer la RPM à 37 oC avant l'utilisation.
2. Collecte d'échantillons et incubation de La RPM
- Transportez les aliments au laboratoire à des températures ambiantes dans un délai de 1 h. Les aliments peuvent être transportés dans des emballages d'origine ou des contenants stériles. Si ce n'est pas un test immédiat, les aliments peuvent être entreposés à -20 oC jusqu'à l'utilisation. Prenez note du type d'aliments et du pays d'origine selon l'étiquette d'emballage, le cas échéant, ainsi que de toute autre information pertinente.
- Retirer environ 1,0 à 2,0 g de nourriture et le transférer dans un plat stérile Petri ou équivalent. Hacher finement avec une lame de rasoir stérile ou un scalpel.
- Inoculer dans 10 ml de phosphate tamponné saline (PBS) dans un tube conique de 15 ml. Bien mélanger.
- Pour sélectionner les cellules végétatives, transférer 5 ml du mélange PBS-alimentaire dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de RPM. Fixez le couvercle hermétiquement.
- Pour sélectionner les spores, chauffer les 5 ml restants de mélange PBS-alimentaire à 85 oC pendant 15 min, puis transférer dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de Tr/min. Fixez le couvercle hermétiquement.
- Vortex et inverser les cultures food-RPM pour assurer un mélange complet.
- Scellez fermement les tubes coniques et enveloppez les couvercles avec du film de paraffine ou une pellicule plastique pour assurer un environnement anaérobie.
- Incuber la nuit (ON) à 37 oC.
- Le lendemain matin, notez toute turbidité ou fermentation dans les tubes RPM.
3. TSC "sandwich" placage
- Inoculer les cultures ON RPM dans l'agar TSC à l'aide d'une technique de « sandwich » (figure 2) décrite ci-dessous.
- Préparer la gélose TSC selon les instructions du fabricant.
- Préparer la couche de base des plaques TSC en transférant 10 ml d'agar TSC fondu à la vaisselle stérile Petri et permettre de se solidifier. Ceux-ci peuvent être préparés à l'avance et stockés à 4 oC. Assurez-vous que les assiettes sont réchauffées à température ambiante avant de les utiliser.
- Pour la couche supérieure de la plaque TSC, maintenez le reste de la gélose TSC fondue à 40 oC.
REMARQUE : Bien que le point de fusion de l'agar soit supérieur à 85 oC, l'agar fondu se solidifie autour de 32 à 45 oC.
- Récupérez soigneusement les cultures ON RPM et transférez 100 L à la base d'agar de TSC. En raison de la fermentation, certaines cultures peuvent être sous pression. Assurez-vous de porter tous les EPI appropriés.
- Étendre l'inoculum RPM à l'aide de perles de verre stérilisées ou d'épandeurs cellulaires.
- Laisser le RPM être « absorbé » dans l'agar TSC pendant 5 à 10 min à température ambiante.
- Transférer délicatement 20 ml d'agar TSC fondu de 40 oC sur une plaque à l'aide d'une pipette sérologique.
- Remplacer le couvercle du couvercle de la vaisselle Petri et permettre à l'agar TSC de se solidifier complètement à température ambiante.
- Inverser le plat Petri et incuber à 37 oC ON.
- Si des dilutions en série sont souhaitées, effectuer des dilutions des cultures ON RPM en RPM frais et préréchauffé s'est réchaud avant d'être inoculation dans l'agar de TSC.
4. Sous-creusation des colonies de sulfite-réduction
- Le lendemain matin, retirer les plaques de l'incubateur et examiner la croissance bactérienne. Des bactéries aérobiques peuvent être présentes à la surface de l'agar. Des bactéries anaérobies se trouveront de plus en plus encastrées dans l'agar. Les bactéries sulfite-réductrices tourneront le noir d'agar environnant. Les colonies possibles de C. perfringens seront noires et incorporées dans l'agar.
- C. perfringens colonies suspectées seront positifs pour la réduction de sulfite et apparaîtra noir, incorporé dans l'agar. À l'aide d'un eyedropper stérile à usage unique, « arracher » les colonies noires de l'agar et transférer à 10 ml de RPM frais dans un tube conique de 15 ml. Il est important que l'air du eyedropper soit expulsé avant de percer l'agar.
- S'il y a une quantité dense de croissance bactérienne aérobie à la surface de la plaque, utilisez un grattoir à cellules stériles pour enlever les colonies des zones sélectionnées. Plusieurs C. perfringens colonies suspectées peuvent être échantillonnés à partir de la même plaque TSC dans des cultures rPM distinctes.
- Fixez les couvercles coniques et enveloppez-les dans un film de paraffine ou une pellicule plastique. Incuber ON à 37 oC.
5. Extraction d'ADN
- Enlever les cultures ON RPM et examiner les signes de croissance, y compris la turbidité et la fermentation.
- Invertissez délicatement la culture de la RPM pour disperser les bactéries sédentaires et ouvrir soigneusement. Transférer 1 ml de la culture dans un tube de microcentrifuge.
- Centrifugeuse à la vitesse maximale (environ 15 000 x g)pendant 10 min pour granuler les bactéries.
- Laver les granulés avec 1 ml de PBS stérile.
- Dans certaines circonstances, la gélatine non digérée s'installera au-dessus des bactéries granulées. Pour enlever la gélatine, "fluff" hors gélatine en agitant doucement avec PBS à l'aide d'une micropipette. Cela va "fluff-up" la gélatine tout en laissant la pastille bactérienne intacte.
- Retirez le mélange PBS-gélatine avec une aspiration douce. Suspendre à nouveau le reste des granulés bactériens avec 1 ml de PBS frais.
- Centrifuger la pastille bactérienne en suspension à la vitesse de pointe pendant 10 min et aspirer soigneusement le supernatant.
- Effectuer immédiatement l'extraction de l'ADN à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN et d'un protocole spécialement créé pour l'extraction de l'ADN à partir de bactéries Gram-positives (voir le Tableau des matériaux).
- Utilisez immédiatement l'ADN extrait ou entreposez-les à -20 oC jusqu'à ce que l'analyse PCR.
6. Détection de C. perfringens via le génotypage PCR
- Pour déterminer si les cultures sont positives pour les toxinotypes de C. perfringens, examinez l'ADN extrait pour différents gènes de toxine par l'intermédiaire de PCR.
REMARQUE: Parce que nous sommes les plus intéressés par la toxine epsilon produisant des souches de type B et D C. perfringens, nous évaluons pour la présence des gènes de la toxine alpha, bêta, et epsilon. Les amorces sont énumérées dans le tableau 2. Les amorces pour l'ADN ribosomal de 16s sont employées comme contrôle d'extraction d'ADN. Des amorces supplémentaires peuvent être utilisées pour tester les toxinotypes A à G et peuvent être trouvées dans la littérature publiée2,12,13. - Utilisez l'ADN précédemment extrait de C. perfringens comme un contrôle positif. Ce contrôle garantit que tous les composants des réactions PCR fonctionnent. Nous utilisons l'ADN extrait de C. perfringens type B (ATCC 3626) comme notre contrôle positif. Cultivez ATCC 3636 ON en RPM à 37 oC et extrayez l'ADN en utilisant les mêmes méthodes décrites dans les étapes 5.1-5.7. Conserver l'ADN extrait à -20 oC jusqu'à l'utilisation.
- Définir les conditions de PCR comme suit : 94,0 oC pendant 3 min; 94,0 oC pour 30 s; 47,9 oC pour 30 s, 72,0 oC pour 1 min (Répéter les étapes 2 à 4 pour 35 cycles); 72,0 oC pendant 10 min.
- Pour confirmer les produits PCR, exécutez des réactions de PCR sur un gel d'agarose de 1,8 g/100 ml utilisant des techniques standard. La taille prévue des produits PCR est indiquée dans le tableau 2. Les résultats PCR typiques sont affichés dans la figure 3.
Representative Results
En utilisant cette méthode, 15 à 20 % de nos aliments échantillonnés sont positifs pour C. perfringens. Bien que la plupart des souches soient positives pour le toxinotype A, nous avons détecté avec succès des échantillons de type B et De dans des échantillons d'aliments. Dans un article publié précédemment, nous avons testé un total de 216 échantillons d'aliments achetés dans les magasins de détail de New York16 (tableau 3). Ces échantillons comprenaient divers échantillons de viande (boeuf, agneau, porc et agneau), des échantillons de volaille (poulet et dinde) et des échantillons de fruits de mer (cod, saumon, crustacés, vivaneau, plie, calmar, tilapia, thon et divers autres poissons). Des échantillons de produits et de produits laitiers ont également été testés. Sur 216 échantillons, 34 (16 %) étaient positifs pour C. perfringens. Sur les 34 échantillons positifs perfringens, 31 (91,2 %) contient la toxine alpha, un échantillon (2,9 %) toxine alpha, bêta et epsilon, et deux échantillons (5,9 %) contient la toxine alpha et epsilon.
Fait intéressant, nous avons également découvert que C. perfringens était plus répandu comme cellules végétatives par rapport aux spores. Vingt-cinq échantillons ont été comparés pour la présence de cellules ou de spores végétatives de C. perfringens. Les spores ont été sélectionnées par des échantillons de chaleur choquantes à 85 oC pendant 15 min. Sur les 25 échantillons testés, 16 % étaient positifs pour les souches végétatives de C. perfringens contre 4 % pour les spores. Cela indique qu'il peut être plus rentable de tester uniquement les cellules végétatives au lieu des deux.
Figure 1 : Aperçu de la procédure.
Les échantillons d'aliments sont hachés et dilués en PBS stérile. La moitié de l'échantillon de PBS-alimentaire est inoculé dans la RPM pour sélectionner pour les cellules végétatives. L'échantillon pbS-alimentaire restant est la chaleur choquée à 85 oC pendant 15 minutes pour sélectionner les spores avant l'inoculation dans la RPM. Les cultures sont incubées à 37 oC, puis plaquées dans l'agar tSC. L'agar de TSC est incubé on à 37 oC et les cultures noires, qui réduisent le sulfite, sont sous-cultivées en RPM frais. Les cultures rPM sous-cultivées sont incubées à 37 oC et l'ADN est extrait pour effectuer le génotypage via PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Schéma de la technique du sandwich à l'agar TSC.
Les milieuis de régime contenant les bactéries C. perfringens sont plaqués entre deux couches de gélose TSC afin de favoriser un environnement anaérobie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats PCR sélectionnés.
Exemple d'images des résultats de génotypage de C. perfringens de sept différents types d'aliments, et un contrôle positif de C. perfringens type B. Une échelle de poids moléculaire (première voie de chaque gel) a été utilisée pour estimer la taille des résultats de PCR dans les paires de base (bp). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Toxinotype | Alpha | Bêta | Epsilon | once | Cpe | NetB (en) | |
| établi | un | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Proposé | F | + | - | - | - | + | - |
| gr | + | - | - | - | - | + | |
| - présent - non présent peut ou ne peut pas être présent |
|||||||
Tableau 1 : Aperçu des génotypes de C. perfringens. Un tableau des combinaisons de toxines produites par chaque c. perfringens toxinotype.
| cible | Paires d'apprêt | Produit PCR attendu (bp) |
| Alpha | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Bêta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC TC TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s ARN | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
1300 euros |
Tableau 2 : Amorces et produits PCR attendus pour certains gènes toxiques. Amorces utilisées dans l'étape de génotypage PCR.
| Type d'aliment | Type A | Type B | Type C | Type D | C. perf - États-Unis | |||||||
| toxine alpha positive | alpha, bêta, et la toxine d'epsilon positive | alpha et bêta toxine positive | toxine alpha et epsilon positive | |||||||||
| n | n | % | n | % | n | % | n | % | n | % | ||
| viande | bœuf | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| agneau | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| porc | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| mixte | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| sous-total | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| volaille | poulet | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| Turquie | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| sous-total | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| fruits | morue | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| mixte | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| saumon | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| shelfish (shelfish) | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| lutjanidé | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| flet | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| calmar | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| thon | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| autre | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| sous-total | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| laiterie | vache | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| chèvre | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| lait | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| sous-total | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| produire | légume | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| fruit | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| herbe | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| sous-total | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| total | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Tableau 3 : Prévalence de différents toxinotypes C. perfringens dans 216 échantillons d'aliments. Exemple des résultats obtenus lors de l'utilisation de cette méthode pour tester les aliments au détail pour C. perfringens. Ce tableau a été modifié à partir du manuscrit publié précédemment Regan et al.16.
Discussion
Ici nous décrivons une méthode pour identifier la prédominance de C. perfringens dans les échantillons au détail d'aliments avec la sous-culture limitée et sans utilisation d'un système de chambre anaérobie. Cette méthode utilise une combinaison de techniques pour augmenter l'identification de C. perfringens à partir d'échantillons d'aliments. En utilisant une version modifiée des médias RPM, nous permettons la croissance sélective de C. perfringens. En prenant en sandwich le RPM inoculé entre les couches de l'agar TSC, nous sommes en mesure d'identifier et d'isoler anaérobie, sulfite-réduction des bactéries caractéristiques de C. perfringens. Pour confirmer la présence de C. perfringens,les colonies de sulfite-réduction sont sous-cultivées en RPM frais. La version modifiée ou RPM nous permet d'extraire facilement l'ADN des cultures, permettant la confirmation PCR de gènes toxiques spécifiques. La confirmation des échantillons d'aliments contaminés par C. perfringens peut être obtenue dans un délai de trois jours.
Dans les premières expériences, des échantillons de nourriture ont simplement été inoculés dans la RPM et l'ADN extrait des cultures ON. Cette méthode a permis de détecter les C. perfringens dans un nombre limité d'échantillons (données non affichées). Bien que la RPM soit sélective pour la croissance de C. perfringens, elle n'est pas exclusive pour la croissance de C. perfringens. D'autres bactéries résistantes à la dcycolérine d'un gramme peuvent encore se développer en RPM. Nous avons émis l'hypothèse que la contamination par d'autres espèces bactériennes pourrait avoir diminué notre détection des souches de C. perfringens en diminuant la sensibilité de notre analyse PCR dans notre première culture ON RPM. L'inclusion de la technique du « sandwich » de l'agar de TSC a été une étape cruciale pour accroître la détection des C. perfringens. Cela nous a permis de différencier et de sélectionner pour les colonies anaérobies, sulfite-réduction, caractéristique de C. perfringens. Une étape clé dans ce processus est de s'assurer que la couche supérieure de la gélose TSC en fusion est à 40 oC. Bien que certaines souches de C. perfringens puissent croître à des températures plus élevées (46-48 oC)15,16, l'ajout d'agar fondu à des températures accrues réduit considérablement la quantité de cultures récupérées, la plupart du temps probablement en raison de la mort cellulaire .
Il y a plusieurs limitations potentielles à cette méthode. Comme nous l'avons mentionné précédemment, ni l'agar RPM ni l'agar TSC ne sélectionnent ou ne différencient exclusivement pour C. perfringens, ce qui permet la croissance d'autres espèces bactériennes présentes dans les échantillons alimentaires. Cela peut réduire la sensibilité de l'analyse à sélectionner pour C. perfringens seulement. Cependant, c'est une limitation commune dans presque toutes les techniques de culture. La confirmation du génotypage des isolats purifiés est la meilleure méthode pour identifier définitivement C. perfringens et d'autres espèces bactériennes. Une autre limite de cette étude est que nous ne testons pas les isolats purifiés. Nous avons délibérément fait cela pour limiter la quantité de subculturing, comme la subculturing répétée est craint d'entraîner une perte de plasmide. Parce que nous n'isolons pas à la pureté, il est possible que plusieurs toxines C. perfringens puissent être présents dans le même échantillon ou sous-culture. Si les chercheurs souhaitent obtenir des isolats purifiés, des méthodes de purification standard peuvent être utilisées sur la dernière culture de RPM décrite dans cette méthode; cela nécessite généralement l'utilisation de chambres anaérobies. Bien qu'elle soit utilisée à l'origine pour isoler c. perfringens des aliments, cette méthode peut être utilisée pour identifier et isoler les Perfringens c. à partir d'une multitude de sources. Plus précisément, l'une de ces applications de cette méthode consiste à tester des échantillons fécaux d'humains (ou d'animaux) qui sont soupçonnés d'être infectés par C. perfringens et de toxiner les bactéries pour mieux comprendre la source de l'infection.
Disclosures
Pas de divulgations.
Acknowledgments
Cette recherche n'a reçu aucun financement spécifique des secteurs public, commercial ou sans but lucratif.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
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