Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Berigelse og påvisning af Clostridium perfringens toxinotypes i detail fødevareprøver

Published: October 18, 2019 doi: 10.3791/59931
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Brain and Mind Institute, Weill Cornell Medical College
* These authors contributed equally

Summary

Formålet med denne protokol er at påvise forskellige Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt indkøbte fødevarer, især Epsilon-toksin, der producerer stamme typer B og D, uden brug af anaerobe kamre.

Abstract

Clostridium perfringens (C. perfringens) er en produktiv toksin producent og forårsager en bred vifte af sygdomme i forskellige værter. C. perfringens er kategoriseret i fem forskellige toxinotypes, A gennem E, baseret på transport af fire store toksin gener. Forekomsten og distributionen af disse forskellige toxinotyper er undersøgt, især deres omsiggribende i amerikanske detail-fødevarer. Af særlig interesse for os er de type B og D stammer, som producerer Epsilon toxin, en ekstremt dødelig toksin foreslået at være den miljømæssige udløser af multipel sklerose i mennesker. For at evaluere tilstedeværelsen af forskellige C. perfringens toxinotypes i forskellige fødevareprøver, udviklede vi en nem metode til selektivt kultur disse bakterier uden brug af en anaerob container system kun involverer tre dyrkning trin. Fødevarer købes fra lokale købmandsforretninger og transporteres til laboratoriet under omgivende forhold. Prøverne hakes og inokuleres i modificerede Rapid perfringens-medier (RPM) og inkuberet natten over ved 37 °C i et forseglet, lufttæt konisk rør. Overnight kulturer er inokuleret på et bund lag af solid Tryptose sulfit Cycloserin (TSC) agar, og derefter overlagt med et øverste lag af smeltet TSC agar, hvilket skaber en "Sandwiched", anaerobe miljø. Agarpladerne inkuberes natten over ved 37 °C og evalueres derefter for udseendet af sorte, sulfit reducerende kolonier. C. perfringens-mistænkte kolonier fjernes fra TSC-agar ved hjælp af sterile øjen pipetter og inokuleres i omdrejninger og sub-dyrkes natten over ved 37 °c i et lufttæt konisk rør. DNA udvindes fra RPM Subculture, og derefter analyseres for tilstedeværelsen af C. perfringens toksin gener via polymerase kædereaktion (PCR). Afhængigt af den type mad, man prøver at prøve, testes typisk 15 – 20% af prøverne positivt for C. perfringens.

Introduction

Clostridium perfringens (C. perfringens) er en gram positiv, anaerob, sporedannende, stang formet bakterie, der findes allestedsnærværende i miljøet. Denne art af bakterier bærer gener, der indkode for over 17 toksiner og, historisk, er blevet karakteriseret i fem toxinotypes (A-E) baseret på tilstedeværelsen af fire forskellige toksin gener: Alpha, beta, Epsilon, og Iota toxin (tabel 1)1. For nylig er det blevet foreslået, at denne Typing-ordningen skal udvides til at omfatte typer F og G, som havnen C. perfringens enterotoksiner (CPE) og NetB toksin, henholdsvis2. Men mere forskning er nødvendig, før dette skemat system er formelt accepteret. Mens alfa toksin genet er strengt kromosomalt placeret, kan CPE-genet findes både på kromosom og plasmider. Til sammenligning findes de resterende toksiner gener på forskellige mellemstore plasmider. Vi er især interesseret i forekomsten af C. perfringens typer B og D, da disse stammer producerer Epsilon toxin, en yderst potent, pore dannende toksin, som er blevet foreslået at spille en rolle i at udløse multipel SKLEROSE (MS) i mennesker3 ,4,5,6,7. Hvordan folk bliver smittet eller koloniseret af disse stammer er ukendt. En mulig forklaring er gennem indtagelse af forurenede fødevarer. For at hjælpe med at besvare dette spørgsmål, vi søgte at bestemme forekomsten af forskellige C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver.

Tilstedeværelsen af C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver er undersøgt og kræver ofte brug af anaerobe containersystemer og talrige subculturing trin8,9,10,11 . Selv om der er behov for talrige subculturing trin for at opnå oprenset isolater, kan denne metode føre til tab af plasmider over tid12,13,14, hvilket muligvis påvirker påvisning af plasmid-bårne toksin gener herunder Epsilon-toksin genet. Vi søgte at udvikle en nem metode, med færre sub-culturing trin, til selektivt kultur C. perfringens uden brug af anaerobe kamre, krukker eller poser. Kort fortalt inokuleres fødevareprøver i hurtige perfringens-medier (RPM) natten over (ON) og derefter "klemt" ind i TSC agar og inkuberet på. Kolonier, der mistænkes for at være C. perfringens , bliver derefter under dyrket i rpm og inkuberet igen på. DNA udvindes og PCR udføres for at bestemme genotype (figur 1). Vi valgte at bruge RPM, da det har vist sig at øge inddrivelsen af C. perfringens stammer fra fødevareprøver sammenlignet med andre mere standard Media15. Desuden blev RPM anvendt med succes til at isolere et Epsilon-toksin, der producerede type B-stamme fra en MS-patient4. Vi bruger en modificeret version af RPM i stedet for den oprindelige version til at tillade nem DNA-ekstraktion. Denne metode gør det let at identificere toksin gener i prøverne, men det er muligt, at en enkelt prøve indeholder mere end én C. perfringens toxinotype. Da vores metode ikke isolerer rensede stammer ved hjælp af flere rensnings runder, er det ikke muligt at identificere flere toxinotyper fra en prøve. Men, standard rensning teknikker (typisk striber på TSC plader eller blod agar plader) kan anvendes i slutningen af vores protokol for at opnå renset kulturer.

Protocol

Bemærk: C. perfringens betragtes som en biosikkerheds risikoniveau 2 (BSL2) organisme. Selv om ikke alle fødevareprøver vil indeholde C. perfringens, skal alle dyrkede prøver behandles som sådanne. Alle passende forholdsregler og personale beskyttelsesudstyr (PPE) skal bæres til enhver tid. At defiltrere alt materiale inden bortskaffelse.

1. Forbered modificeret rpm4,15

  1. Kombiner 30 g/L Fluid thioglycolat medium, 60 g/L gelatine, 5 g/L peptone, 5 g/L glucose, 5 g/L kaliumphosphat dibasic, 3 g/L gær ekstrakt, 1,5 g/L natriumchlorid, 0,5 g/L jernholdige sulfat i deioniseret vand indtil jævnt dispergeret. Vi laver typisk 1 L-batches.
  2. Autoklave ved 121 °C i 15 min.
  3. Afkøles til ca. 40 °C.
  4. Når RPM er køligt, tilsættes D-cycloserin til en endelig koncentration på 440 mg/L.
    Bemærk: Stam koncentrationer af D-cycloserin opløst i sterilt vand ved 50 mg/mL kan opbevares ved-20 °C til fremtidig brug.
  5. Overfør aseptisk 10 mL RPM til 15 mL koniske rør. RPM kan tilberedes i bundter og opbevares ved 4 °C i op til en måned.
  6. Varm RPM til 37 °C før brug.

2. opsamling af prøver og RPM-inkubation

  1. Transport af fødevarer til laboratoriet under omgivende temperaturer inden for 1 h. fødevarer kan transporteres i original emballage eller sterile beholdere. Hvis den ikke testes med det samme, kan maden opbevares ved-20 °C, indtil den anvendes. Læg mærke til typen af fødevarer og oprindelseslandet i henhold til emballage etiketten, hvis en sådan findes, samt alle andre relevante oplysninger.
  2. Fjern ca. 1,0 – 2,0 g mad og Overfør til steril Petri skål eller tilsvarende. Fint hakket med en steril barberkniv eller skalpel.
  3. Der inokuleres i 10 mL fosfatbuffer saltvand (PBS) i et 15 mL konisk rør. Bland godt.
    1. For at vælge for vegetativt celler overføres 5 ml PBS-Food blandingen til et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml rpm. Fastgør låget stramt.
    2. For at vælge sporer skal de resterende 5 mL PBS-Food-blandinger opvarmes ved 85 °C i 15 minutter og derefter overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder 10 mL RPM. Fastgør låget stramt.
  4. Vortex og invertere mad-RPM kulturer for at sikre fuldstændig blanding.
  5. Tætsiddende koniske rør og wrap låg med paraffin film eller plast wrap for at sikre en anaerobe miljø.
  6. Inkuber natten over (ON) ved 37 °C.
  7. Den følgende morgen notat enhver turbiditet eller gæring i RPM rør.

3. TSC "sandwich" plating

  1. Inokulere på RPM kulturer i TSC agar ved hjælp af en "sandwich" teknik (figur 2) beskrevet nedenfor.
  2. Forbered TSC agar i fabrikantens anvisninger.
    1. TSC-pladerne forberedes ved at overføre 10 mL smeltet TSC-agar til sterile Petri skåle og gøre det muligt at størkne. Disse kan tilberedes i avanceret og opbevares ved 4 °C. Sørg for, at pladerne opvarmes til stuetemperatur før brug.
    2. For det øverste lag af TSC-pladen opretholdes den resterende smeltede TSC-agar ved 40 °C.
      Bemærk: Selvom agar's smeltepunkt er over 85 °C, størkner den smeltede agar omkring 32 – 45 °C.
  3. Hent omhyggeligt de på RPM kulturer og Overfør 100 μL til TSC agar base. På grund af gæring, nogle kulturer kan være under pres. Sørg for at bære alle relevante PV.
  4. Spred RPM-inokulum ved hjælp af steriliserede glasperler eller celle sprederen.
  5. Lad RPM blive "absorberet" i TSC agar i 5 – 10 minutter ved stuetemperatur.
  6. Overfør forsigtigt 20 mL smeltet, 40 °C TSC agar til pladen ved hjælp af en serologisk pipette.
  7. Udskift Petri skålen, og lad TSC agar helt størkne ved stuetemperatur.
  8. Vend Petri skålen og Inkuber ved 37 °C på.
  9. Hvis der ønskes serielle fortyndinger, skal du udføre fortyndinger af ON RPM-kulturerne i frisk, forvarmet RPM før inokulering til TSC agar.

4. under dyrkning af sulfit reducerende kolonier

  1. Den følgende morgen, fjerne plader fra inkubator og undersøge for bakteriel vækst. Aerobe bakterier kan være til stede på overfladen af agar. Anaerobe bakterier vil blive fundet voksende indlejret i agar. Sulfit-reducerende bakterier vil vende omgivende agar sort. Mulige C. perfringens kolonier vil være sorte og indlejret i agar.
  2. C. perfringens formodede kolonier vil være positive for sulfit reduktion og vil fremstå sort, indlejret i agar. Ved hjælp af en steril engangs pipette "pluck" de sorte kolonier fra agar og overføres til 10 mL frisk RPM i et 15 mL konisk rør. Det er vigtigt, at luften fra pipetten udvises før piercing agar.
  3. Hvis der er en tæt mængde aerob bakterievækst på pladens overflade, skal du bruge en steril celle skraber til at fjerne kolonier fra udvalgte områder. Flere C. perfringens mistænkte kolonier kan udtages fra samme TSC-plade i separate rpm-kulturer.
  4. Tætsiddende koniske rør låg og wrap i paraffin film eller plast wrap. Inkuber ved 37 °C.

5. DNA-ekstraktion

  1. Fjern på RPM kulturer og undersøge for tegn på vækst, herunder Turbiditet og gæring.
  2. Vend forsigtigt RPM kultur for at sprede alle bosatte bakterier og forsigtigt åbne. 1 mL af kulturen overføres til et mikrocentrifuge glas.
  3. Centrifugeres ved tophastighed (ca. 15.000 x g) i 10 min. til pellet bakterier.
  4. Vask pellet med 1 mL steril PBS.
    1. Under visse omstændigheder vil uforfordøjet gelatine bosætte sig oven på pelleterede bakterier. At fjerne gelatine, "Fluff" off gelatine ved forsigtigt agitere med PBS ved hjælp af en mikropipette. Dette vil "fnug op" gelatine, mens de forlader den bakterielle pellet intakt.
    2. Fjern PBS-gelatine blandingen med blid aspiration. De resterende bakterielle piller gensuspenderes med 1 mL frisk PBS.
  5. Centrifuger den opslæmmede bakterielle pellet ved tophastighed i 10 minutter, og Aspirér forsigtigt supernatanten.
  6. Udfør straks DNA-ekstraktion ved hjælp af et DNA-ekstraktions udstyr og en protokol, der er specielt skabt til ekstraktions DNA fra gram positive bakterier (Se tabellen over materialer).
  7. Brug straks det ekstraherede DNA eller Opbevar ved-20 °C indtil PCR-analyse.

6. påvisning af C. perfringens via PCR-genotype

  1. For at afgøre, om kulturer er positive for C. perfringens toxinotypes, undersøger ekstraheret DNA for forskellige toksin gener via PCR.
    Bemærk: fordi vi er mest interesseret i Epsilon-toksin producerende stammer type B og D C. perfringens, evaluerer vi for tilstedeværelsen af alfa-, beta-og Epsilon-toksin gener. Primere er opført i tabel 2. Primers for 16s ribosomale DNA anvendes som en DNA-ekstraktions kontrol. Yderligere primere kan bruges til at teste for toxinotypes A til G og kan findes i publiceret litteratur2,12,13.
  2. Brug tidligere ekstraherede C. perfringens DNA som en positiv kontrol. Denne kontrol sikrer, at alle komponenter i PCR-reaktionerne virker. Vi bruger DNA udvundet fra C. perfringens type B (atcc 3626) som vores positive kontrol. Vokse ATCC 3636 på i RPM ved 37 °C og udtrække DNA ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet i trin 5.1 – 5.7. Opbevares udtrukket DNA ved-20 °C indtil brug.
  3. Angiv PCR-betingelser som følger: 94,0 °C i 3 min; 94,0 °C i 30 s; 47,9 °C i 30 s, 72,0 °C i 1 min (Gentag trin 2 – 4 for 35 cyklusser); 72,0 °C i 10 min.
  4. For at bekræfte PCR-produkter skal du køre PCR-reaktioner på en 1,8 g/100 mL agopstået gel ved hjælp af standardteknikker. Forventede PCR-produktstørrelser er angivet i tabel 2. Typiske PCR-resultater vises i figur 3.

Representative Results

Ved hjælp af denne metode, 15 – 20% af vores udtagne fødevarer test positiv for C. perfringens. Mens de fleste stammer er positive for toxinotype A, har vi med succes opdaget både type B og D i fødevareprøver. I et tidligere udgivet papir testede vi i alt 216 fødevareprøver købt fra New York Retail Stores16 (tabel 3). Disse prøver omfattede forskellige kødprøver (oksekød, lam, svinekød og lam), fjerkræ prøver (kylling og kalkun), og Seafood prøver (torsk, laks, skaldyr, snapper, skrubbe, blæksprutte, tilapia, tun, og forskellige andre fisk). Produkter og mælkeprøver blev også afprøvet. Af 216 prøver, 34 (16%) var positive for C. perfringens. Af 34 C. perfringens positive prøver, 31 prøver (91,2%) indeholdt alfa toksin, en prøve (2,9%) indeholdt alfa-, beta-og Epsilon-toksin, og to prøver (5,9%) indeholdt Alpha-og Epsilon-toksin.

Interessant nok opdagede vi også, at C. perfringens var mere udbredt som vegetativt celler sammenlignet med sporer. Femogtyve prøver blev sammenlignet for tilstedeværelsen af vegetativt C. perfringens celler eller sporer. Sporer blev udvalgt til ved varme chokerende prøver ved 85 °C i 15 min. Af de 25 testede prøver var 16% positive for vegetativt C. perfringens -stammer versus 4% for sporer. Dette indikerer, at det kan være mere omkostningseffektivt at teste for kun vegetativt celler i stedet for begge.

Figure 1
Figur 1: oversigt over proceduren.
Fødevare prøverne hakes og fortyndes til sterile PBS. Halvdelen af PBS-Food prøven inokuleres i rpm for at vælge for vegetativt celler. Den resterende PBS-Food-prøve er varme chokeret ved 85 °C i 15 min for at vælge for sporer før inokulering i RPM. Kulturer inkuberet på 37 °C derefter belagt i TSC agar. TSC agar inkuberes på 37 °C og sorte, sulfit-reducerende kulturer er under kultiveret i frisk RPM. Sub-dyrkede RPM-kulturer inkuberet ved 37 °C, og DNA udvindes for at udføre genotypebestemmelse via PCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk af TSC agar sandwich teknik.
RPM-medier, der indeholder C. perfringens -bakterier, er belagt mellem to lag TSC agar for at fremme et anaerob miljø. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udvalgte PCR-resultater.
Eksempel billeder af resultaterne af genotypebestemmelse af c. perfringens fra syv forskellige typer fødevarer og en positiv kontrol af c. perfringens typen B. En molekylvægt stige (første vognbane af hver gel) blev brugt til at tilnærme størrelsen af PCR resultater i base Pairs (BP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Toxinotype Alpha Beta Epsilon Tøddel Cpe NetB
Etableret A + - - - - -
B + + + - - -
C + + - - + -
D + - + - + -
E + - - + + -
Foreslåede F + - - - + -
G + - - - - +
+ nuværende
-ikke til stede
+/-måske eller måske ikke være til stede

Tabel 1: oversigt over C. perfringens genotyper. Et diagram over de kombinationer af toksiner, der produceres af hver C. perfringens toxinotype.

Mål Primer par Forventet PCR-produkt (BP)
Alpha F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA
R: CCT CTG ATA KAT CGT GTA AG		 325
Beta F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA
R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C		 196
Epsilon F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC
R: CCA CTT ACT TGT FTT ACT AAC		 655
16s RNA F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A
R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T		 ~ 1300

Tabel 2: primere og forventede PCR-produkter til udvalgte toksin gener. Primere, der anvendes i PCR genotypebestemmelse-trinnet.

Fødevare type Skriv en Type B Type C Type D C. perf +
Alfa toksin positiv Alfa-, beta-og Epsilon-toksin positiv Alfa og beta toksin positiv Alfa-og Epsilon-toksin positiv
N N % N % N % N % N %
Kød Oksekød 38 8 21 1 3 0 0 0 0 9 24
Lam 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Svinekød 15 2 13 0 0 0 0 0 0 2 13
Blandet 1 1 100% 0 0 0 0 0 0 1 100%
Subtotal 64 11 17 1 2 0 0 0 0 12 19
Fjerkræ Kylling 19 5 26 0 0 0 0 0 0 5 26
Tyrkiet 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Subtotal 26 5 19 0 0 0 0 0 0 5 19
Skaldyr Torsk 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Blandet 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Laks 11 2 18 0 0 0 0 0 0 2 18
shelfish 32 1 3 0 0 0 0 0 0 1 3
Snapper 4 3 75% 0 0 0 0 0 0 3 75%
Skrubbe 12 4 33% 0 0 0 0 0 0 4 33%
Blæksprutte 4 1 25 0 0 0 0 0 0 1 25
Tilapia 21 2 10 0 0 0 0 2 10 4 19
Tun 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Andre 8 1 13 0 0 0 0 0 0 1 13
Subtotal 100 14 14 0 0 0 0 2 2 16 16
Mejeri Ko 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ged 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mælk 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Subtotal 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Producere Vegetabilsk 12 1 8 0 0 0 0 0 0 1 8
Frugt 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Urt 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Subtotal 16 1 6 0 0 0 0 0 0 1 6
Samlede 216 31 14 1 0,50% 0 0 2 0,90% 34 16

Tabel 3: forekomsten af forskellige C. perfringens toxinotypes i 216 fødevareprøver. Et eksempel på de opnåede resultater, når du bruger denne metode til at teste detail mad til C. perfringens. Denne tabel er blevet ændret fra det tidligere offentliggjorte manuskript Regan et al.16.

Discussion

Her beskriver vi en metode til at identificere C. perfringens prævalens i detail fødevareprøver med begrænset opdyrkning og uden brug af et anaerob kammer system. Denne metode bruger en kombination af teknikker til at øge identifikationen af C. perfringens fra fødevareprøver. Ved at bruge en modificeret version af RPM-medier, giver vi mulighed for selektiv vækst af C. perfringens. Ved at sandwichere den inokulerede RPM i mellem lag af TSC agar, er vi i stand til at identificere og isolere anaerobe, sulfit-reducerende bakterier karakteristisk for C. perfringens. For at bekræfte tilstedeværelsen af C. perfringens, sulfit-reducerende kolonier er sub-kultiveret i frisk rpm. Den modificerede version eller RPM giver os mulighed for nemt at udtrække DNA fra kulturer, hvilket muliggør PCR-bekræftelse af specifikke toksin gener. Bekræftelse af C. perfringens kontaminerede fødevareprøver kan opnås inden for tre dage.

I tidlige eksperimenter blev madprøver simpelthen inokuleret i RPM og DNA udvundet fra på kulturer. Denne metode resulterede i påvisning af C. perfringens i et begrænset antal prøver (data ikke vist). Selv om RPM er selektiv for c. perfringens vækst, er den ikke eksklusiv for c. perfringens vækst. Andre, gram-positive, D-cycolserin resistente bakterier kan stadig vokse i RPM. Vi hypotese, at forurening med andre bakterielle arter kan have reduceret vores påvisning af C. perfringens stammer ved at reducere følsomheden af vores PCR analyse i vores første på rpm kultur. Et afgørende skridt i at øge påvisning af C. perfringens var inddragelsen af TSC agar "sandwich" teknik. Dette tillod os at differentiere og vælge for anaerobe, sulfite-reducerende kolonier, karakteristisk for C. perfringens. Et vigtigt skridt i denne proces er at sikre, at det øverste lag af smeltet TSC agar er ved 40 °C. Selv om nogle C. perfringens stammer kan vokse ved højere temperaturer (46 – 48 °c)15,16, tilsætning af smeltet agar ved højere temperaturer reducerer mængden af genvundne kulturer, for det meste sandsynligvis på grund af celledød .

Der er flere potentielle begrænsninger for denne metode. Som tidligere nævnt udvælger eller differentierer hverken RPM eller TSC agar udelukkende for C. perfringens , hvilket giver mulighed for vækst af andre bakteriearter, som findes i fødevareprøver. Dette kan reducere følsomheden af analysen til at vælge for C. perfringens kun. Men, dette er en fælles begrænsning i næsten alle dyrkning teknikker. Genotyping bekræftelse af rensede isolater er den bedste metode til endeligt at identificere C. perfringens og andre bakteriearter. En anden begrænsning af denne undersøgelse er, at vi ikke tester de rensede isolater. Vi bevidst gjorde dette for at begrænse mængden af afdyrkning, som gentagne afdyrkning frygtes at resultere i plasmid tab. Fordi vi ikke isolerer til renhed, er det muligt, at flere C. perfringens toxinotypes kan være til stede i samme prøve eller subkultur. Hvis forskerne ønsker at få renset isolater, kan standard rensningsmetoder anvendes på den sidste RPM-kultur, der er beskrevet i denne metode; Dette kræver typisk brug af anaerobe kamre. Selv om det oprindeligt blev brugt til at isolere c. perfringens fra mad, kan denne metode bruges til at identificere og isolere c. perfringens fra et væld af kilder. Specifikt, en sådan anvendelse af denne metode er at teste fækale prøver fra mennesker (eller dyr), der mistænkes for at være inficeret med C. perfringens og toxinotype bakterierne til bedre at forstå kilden til infektion.

Disclosures

Ingen oplysninger.

Acknowledgments

Denne forskning har ikke modtaget nogen specifik finansiering fra den offentlige, kommercielle eller ikke-profit sektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Cycloserine Sigma-Aldrich C6880
Dextrose Sigma Life Science D9434-250G
Disposable Transfer Pipets any brand Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69504 Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.
Dry Incubator any brand
Fluid thioglycolate medium Remel R453452
Gelatin from porcine skin Sigma Life Science G1890-500G
Individual Primers Invitrogen
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma Life Science F8633-250 G
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876 Needed for DNA extraction, not provided in kit
microcentrifuge tube any brand
parafilm or plastic wrap any brand
Peptone from casein and other animal proteins Sigma-Aldrich 70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) Oxoid CM0587 Make TSC agar according to instructions
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P2222-100G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S-7653
Sterile Cell Scraper any brand
Sterile cell Spreader any brand
Sterile petri dishes any brand
Supplies and equipment for gel electrophoresis any brand
table top centrifuge any brand
Taq PCR Master Mix Kit Qiagen 201443
Thermocycler for PCR reaction any brand
water bath any brand
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
  2. Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
  3. Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
  4. Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
  5. Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
  6. Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
  7. Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
  8. Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
  9. Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
  10. Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
  11. Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
  12. Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
  13. Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
  14. Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
  15. Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
  16. Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).

Tags

Miljøvidenskaber Clostridium perfringens Epsilon-toksin genotype toxinotype detail fødevareprøver amerikansk
Berigelse og påvisning af <em>Clostridium perfringens</em> toxinotypes i detail fødevareprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anwar, Z., Regan, S. B., Linden, J.… More

Anwar, Z., Regan, S. B., Linden, J. Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples. J. Vis. Exp. (152), e59931, doi:10.3791/59931 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter