Summary
Het doel van dit protocol is het opsporen van verschillende Clostridium perfringens toxinotypes in lokaal aangekochte voedingsmiddelen, in het bijzonder Epsilon toxine die stam types B en D produceren, zonder het gebruik van anaerobe kamers.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) is een productieve toxine producent en veroorzaakt een breed scala aan ziekten in verschillende hosts. C. perfringens is onderverdeeld in vijf verschillende toxinotypes, A tot en met E, gebaseerd op het vervoer van vier belangrijke toxine genen. De prevalentie en distributie van deze verschillende toxinotypes is onderonderzocht, vooral hun alomtegenwoordige levensmiddelen in de Amerikaanse retail. Van bijzonder belang voor ons zijn de type B-en D-stammen, die Epsilon-toxine produceren, een extreem dodelijk toxine dat wordt voorgesteld om de milieu-trigger van multiple sclerose bij mensen te zijn. Om de aanwezigheid van verschillende C. perfringens toxinotypes in verschillende voedselmonsters te evalueren, ontwikkelden we een eenvoudige methode om deze bacteriën selectief te kweken zonder het gebruik van een anaerobe containersysteem waarbij slechts drie kweek stappen werden uitgevoerd. Voedsel wordt gekocht bij lokale kruidenierszaken en vervoerd naar het laboratorium onder omgevingscondities. De monsters worden fijngemalen en geënt in gemodificeerde Rapid perfringens media (RPM) en worden gedurende een nacht bij 37 °C geïncubeerd in een verzegelde, luchtdichte conische buis. 'S nachts culturen worden geënt op een onderlaag van massief Tryptose sulfieten Cycloserine (TSC) agar, en vervolgens overgelegd met een toplaag van gesmolten TSC agar, het creëren van een "ingeklemde", anaerobe omgeving. Agar-platen worden 's nachts geïnventariseerd bij 37 °C en vervolgens geëvalueerd op de verschijning van zwarte, sulfiet-reducerende kolonies. C. perfringens-vermoedelijke kolonies worden uit de TSC agar verwijderd met behulp van steriele oogdruppels, en geënt in rpm en ondergekweekt 's nachts bij 37 ° c in een luchtdichte conische buis. DNA wordt geëxtraheerd uit de RPM-subcultuur en vervolgens geanalyseerd op de aanwezigheid van C. perfringens toxine genen via de polymerase kettingreactie (PCR). Afhankelijk van het type van de bemonsterde voeding is doorgaans 15 – 20% van de monsters positief voor C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) is een gram positieve, anaerobe, sporenvormende, staafvormige bacterie die alomtegenwoordig wordt aangetroffen in de omgeving. Deze soort bacteriën draagt genen die coderen voor meer dan 17 toxines en, historisch gezien, is gekenmerkt in vijf toxinotypes (A-E) op basis van de aanwezigheid van vier verschillende toxine genen: alpha, beta, Epsilon, en Iota toxine (tabel 1)1. Onlangs is geopperd dat dit type schema moet worden uitgebreid met de soorten F en G, die de C. perfringens enterotoxine (CPE) en netb toxine, respectievelijk2, bevatten. Echter, meer onderzoek is nodig voordat dit schemerende systeem formeel wordt aanvaard. Hoewel het Alfa toxine-gen strikt chromosomaal is gelegen, kan het CPE-gen zowel op het chromosoom als op de plasmiden worden aangetroffen. Ter vergelijking, de overgebleven toxines ' genen zijn te vinden op verschillende grootte plasmiden. We zijn vooral geïnteresseerd in de prevalentie van C. perfringens types B en D omdat deze stammen Epsilon toxine produceren, een zeer krachtige, Pore-vormende toxine, die is gesuggereerd om een rol te spelen bij het triggeren van multiple sclerose (MS) bij mensen3 ,4,5,6,7. Hoe mensen worden geïnfecteerd of gekoloniseerd door deze stammen is onbekend. Een mogelijke verklaring is de consumptie van besmette voedingsmiddelen. Om deze vraag te helpen beantwoorden, probeerden we de prevalentie van verschillende C. perfringens toxinotypes in Amerikaanse voedselmonsters te bepalen.
De aanwezigheid van C. perfringens toxinotypes in Amerikaanse voedselmonsters is onderbestudeerd en vereist vaak het gebruik van anaerobe containersystemen en tal van subculturing stappen8,9,10,11 . Hoewel er talrijke subculturing stappen nodig zijn om gezuiverde isolaten te verkrijgen, kan deze methode leiden tot verlies van plasmiden na verloop van tijd12,13,14, wat mogelijk gevolgen heeft voor de detectie van plasmide-overgedragen toxine genen met inbegrip van het epsilon toxine gen. We probeerden een eenvoudige methode te ontwikkelen, met minder subculturing stappen, om selectief cultuur C. perfringens zonder het gebruik van anaerobe kamers, potten of zakken. Kort, voedselmonsters worden geënt in snelle perfringens media (RPM) 's nachts (aan), vervolgens "ingeklemd" in TSC agar en geïncubeerd. Kolonies waarvan vermoed wordt dat ze C. perfringens zijn, worden vervolgens in rpm gecultibeerd en opnieuw geïnineerd. DNA wordt geëxtraheerd en PCR uitgevoerd om genotype te bepalen (Figuur 1). We kozen ervoor om RPM te gebruiken, omdat het is aangetoond dat het de terugwinning van C. perfringens stammen uit voedselmonsters verhoogt in vergelijking met andere meer standaard media15. Bovendien werd RPM met succes gebruikt om een Epsilon-toxine te isoleren die type B-stam van een MS-patiënt4produceerde. We gebruiken een aangepaste versie van RPM in plaats van de originele versie om eenvoudige DNA-extractie mogelijk te maken. Hoewel met deze methode een eenvoudige identificatie van toxine genen binnen monsters mogelijk is, kan het voorkomen dat een afzonderlijk monster meer dan één C. perfringens toxinotype bevat. Omdat onze methode gezuiverde stammen met behulp van meerdere zuiverings rondes niet isoleert, is identificatie van meervoudige toxinotypes uit één monster niet mogelijk. Standaard reinigingstechnieken (meestal strepen op TSC-platen of bloedagar platen) kunnen echter aan het einde van ons protocol worden toegepast om gezuiverde culturen te bereiken.
Protocol
Opmerking: C. perfringens wordt beschouwd als een bioveiligheidsrisico niveau 2 (BSL2) organisme. Hoewel niet alle voedselmonsters C. perfringenszullen bevatten, moeten alle gekweekte monsters als zodanig worden behandeld. Alle juiste voorzorgsmaatregelen en beschermingsmiddelen voor personeel (PBM) moeten te allen tijde worden gedragen. Ontsmet al het materiaal vóór de verwijdering.
1. aangepaste rpm voorbereiden4,15
- Combineer 30 g/L vloeistof thioglycolaat medium, 60 g/L gelatine, 5 g/L peptone, 5 g/L glucose, 5 g/L kalium fosfaat dibasic, 3 g/L gistextract, 1,5 g/L natriumchloride, 0,5 g/L ferro sulfaat in gedeïoniseerd water tot gelijkmatig gedispergeerd. We maken meestal 1 L batches.
- Autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min.
- Laat afkoelen tot ongeveer 40 °C.
- Als het toerental koel is, voeg dan D-cycloserine toe aan een eindconcentratie van 440 mg/L.
Opmerking: de voorraad concentraties van D-cycloserine opgelost in steriel water bij 50 mg/mL kunnen bij-20 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik. - Breng 10 mL RPM aseptisch over naar 15 mL conische buizen. RPM kan in batches worden bereid en gedurende maximaal één maand bij 4 °C worden bewaard.
- Warm toerental tot 37 °C vóór gebruik.
2. monsterafname en toerental incubatie
- Vervoer van levensmiddelen naar het laboratorium bij omgevingstemperaturen binnen 1 uur. voedsel mag in originele verpakking of steriele recipiënten worden vervoerd. Als het niet onmiddellijk wordt getest, kan het voedsel bij-20 °C worden bewaard tot het gebruik. Noteer het soort levensmiddel en het land van oorsprong op basis van het verpakkingsetiket, indien beschikbaar, alsmede alle andere relevante informatie.
- Verwijder ongeveer 1,0 – 2,0 g voedsel en breng het over in een steriel Petri schaaltje of gelijkwaardig. Fijn gehakt met een steriel scheermesje of scalpel.
- Inoculeren in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een conische buis van 15 mL. Meng goed.
- Om te selecteren voor vegetatieve cellen, Breng 5 mL van het PBS-voedsel mengsel over in een conische buis van 15 mL met 10 mL RPM. Bevestig het deksel stevig.
- Verwarm de resterende 5 mL PBS-Food mengsel bij 85 °C gedurende 15 minuten en breng vervolgens over naar een conische buis van 15 mL met 10 mL RPM. Bevestig het deksel stevig.
- Vortex en Inverteer de voedsel-RPM culturen om te zorgen voor volledige menging.
- Sluit de conische buizen strak af en wikkel de deksels met paraffine folie of plastic folie om een anaerobe omgeving te garanderen.
- Inincuberen 's nachts (aan) bij 37 °C.
- De volgende ochtend Opmerking elke troebelheid of fermentatie in RPM buizen.
3. TSC "sandwich" plating
- Inoculeren op RPM-culturen in TSC agar met behulp van een "sandwich"-techniek (Figuur 2) die hieronder wordt beschreven.
- Voorbereiding van TSC agar volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid de basislaag van de TSC Plates door 10 mL gesmolten TSC agar over te brengen naar steriele Petri schalen en te stollen. Deze kunnen worden bereid in vergevorderd en bewaard bij 4 °C. Zorg ervoor dat de platen vóór gebruik op kamertemperatuur zijn opgewarmd.
- Houd voor de bovenste laag van de TSC-plaat de resterende gesmolten TSC agar bij 40 °C.
Opmerking: Hoewel het smeltpunt van de agar boven de 85 °C ligt, stolt de gesmolten agar rond de 32 – 45 °C.
- Haal de op-RPM culturen voorzichtig op en breng 100 μL over naar de TSC agar base. Door fermentatie kunnen sommige culturen onder druk staan. Zorg ervoor dat u alle geschikte PBM draagt.
- Verdeel de rpm entmateriaal met behulp van gesteriliseerde glas kralen of een celspreader.
- Laat RPM worden "geabsorbeerd" in TSC agar voor 5 – 10 min bij kamertemperatuur.
- Breng met behulp van een serologische pipet voorzichtig 20 mL gesmolten, 40 °C TSC agar naar de plaat.
- Vervang de Petri schaal deksel en laat TSC agar volledig stollen bij kamertemperatuur.
- Keer de Petri schaal om en inbroed bij 37 °C.
- Als seriële verdunningen gewenst zijn, voert u verdunningen van de ON-RPM culturen uit in verse, voorverwarmde RPM voorafgaand aan de inoculatie in TSC agar.
4. subculturing van sulfieten-reducerende kolonies
- De volgende ochtend, verwijder platen uit de incubator en onderzoek naar bacteriële groei. Aërobe bacteriën kunnen aanwezig zijn op het oppervlak van de agar. Anaerobe bacteriën worden gevonden die in de agar groeien. Sulfiet-reducerende bacteriën zullen de omringende agar zwart omdraaien. Mogelijke C. perfringens kolonies zullen zwart zijn en ingebed in de agar.
- C. perfringens vermoedelijke kolonies zal positief zijn voor sulfiet reductie en zal verschijnen zwart, ingebed in de agar. Gebruik een steriel pipet voor eenmalig gebruik, "Pluk" de zwarte kolonies van de agar en breng op 10 mL vers toerental in een conische buis van 15 mL. Het is belangrijk dat de lucht van het pipet wordt uitgezet voor de doordringende agar.
- Als er een dichte hoeveelheid aërobe bacteriële groei op het oppervlak van de plaat, gebruik een steriele cel schraper kolonies uit geselecteerde gebieden te verwijderen. Meervoudige C. perfringens vermoedelijke kolonies kunnen worden bemonsterd uit dezelfde TSC plaat in afzonderlijke rpm culturen.
- Stevig beveiligde conische buis deksels en wikkel in paraffine film of plastic folie. Inincuberen op 37 °C.
5. DNA-extractie
- Verwijder op RPM-culturen en onderzoek naar tekenen van groei, waaronder troebelheid en fermentatie.
- Keer de RPM-cultuur voorzichtig om om alle afgerekende bacteriën te dispergeren en voorzichtig open. Breng 1 mL van de kweek naar een microcentrifuge buis.
- Centrifugeer op topsnelheid (ongeveer 15.000 x g) gedurende 10 minuten tot pellet bacteriën.
- Was de pellet met 1 mL steriel PBS.
- In sommige gevallen zal onverteerde gelatine zich op de top van gepileerde bacteriën vestigen. Om gelatine te verwijderen, "pluis" uit gelatine door zachtjes te agiteren met PBS met behulp van een micro pipet. Dit zal "fluff-up" de gelatine, terwijl het verlaten van de bacteriële pellet intact.
- Verwijder het PBS-gelatine mengsel met zachte aspiratie. Resuspendeer de resterende bacteriële pellet met 1 mL verse PBS.
- Centrifugeer de geresuspendeerde bacteriële pellet op topsnelheid gedurende 10 minuten en zuig voorzichtig het supernatant op.
- Voer onmiddellijk DNA-extractie uit met behulp van een DNA-extractie Kit en een protocol dat speciaal is gemaakt voor extractie-DNA van gram-positieve bacteriën (Zie de tabel met materialen).
- Gebruik het geëxtraheerde DNA onmiddellijk of Bewaar bij-20 °C tot PCR-analyse.
6. detectie van C. perfringens via PCR-genotypering
- Om te bepalen of culturen positief zijn voor C. perfringens toxinotypes, onderzoek het geëxtraheerde DNA voor verschillende toxine genen via PCR.
Opmerking: omdat we het meest geïnteresseerd zijn in de Epsilon toxine producerende stammen type B en D C. perfringens, evalueren we voor de aanwezigheid van de Alfa, bèta en Epsilon toxine genen. Primers staan vermeld in tabel 2. Primers voor 16s ribosomaal DNA worden gebruikt als een DNA-extractie controle. Extra primers kunnen worden gebruikt om te testen op toxinotypes A tot en met G en kunnen worden gevonden in de gepubliceerde literatuur2,12,13. - Gebruik eerder geëxtraheerd C. perfringens DNA als een positieve controle. Deze controle zorgt ervoor dat alle componenten van de PCR-reacties werken. We gebruiken DNA geëxtraheerd uit C. perfringens type B (atcc 3626) als onze positieve controle. Groei ATCC 3636 in RPM bij 37 °C en extraheer DNA met dezelfde methoden als beschreven in stappen 5.1 – 5.7. Bewaar het geëxtraheerde DNA bij-20 °C tot het gebruik.
- Stel PCR-condities als volgt in: 94,0 °C gedurende 3 min; 94,0 °C gedurende 30 s; 47,9 °C gedurende 30 s, 72,0 °C gedurende 1 minuut (Herhaal stap 2 – 4 voor 35 cycli); 72,0 °C gedurende 10 min.
- Om PCR-producten te bevestigen, voert u PCR-reacties uit op een 1,8 g/100 mL agarose-gel met behulp van standaardtechnieken. De verwachte PCR-product groottes worden weergegeven in tabel 2. Typische PCR-resultaten worden weergegeven in Figuur 3.
Representative Results
Met deze methode test 15 – 20% van onze bemonsterde voedingsmiddelen positief voor C. perfringens. Terwijl de meeste stammen zijn positief voor toxinotype A, we hebben met succes gedetecteerd zowel type B en D in voedselmonsters. In een eerder gepubliceerd document testten we in totaal 216 voedselmonsters gekocht van winkelketens in New York16 (tabel 3). Deze monsters waren verschillende vleesmonsters (rundvlees, lam, varkensvlees en lam), gevogelte monsters (kip en Turkije), en zeevruchten monsters (kabeljauw, zalm, schaaldieren, snapper, bot, inktvis, tilapia, tonijn, en diverse andere vissen). Producten en zuivel monsters werden ook getest. Van 216 monsters, 34 (16%) waren positief voor C. perfringens. Van de 34 C. perfringens positieve monsters, 31 monsters (91,2%) Alfa toxine bevatte, één monster (2,9%) bevatte de Alfa-, bèta-en Epsilon-toxine en twee monsters (5,9%) Alfa-en Epsilon-toxine bevatte.
Interessant is dat we ook ontdekten dat C. perfringens vaker voorkomt als vegetatieve cellen in vergelijking met sporen. Vijfentwintig monsters werden vergeleken voor de aanwezigheid van vegetatieve C. perfringens cellen of sporen. Sporen werden geselecteerd door hitteschok kende monsters bij 85 °C gedurende 15 minuten. Van de 25 geteste monsters was 16% positief voor vegetatieve C. perfringens stammen versus 4% voor sporen. Dit geeft aan dat het mogelijk kosteneffectiever om te testen voor alleen vegetatieve cellen in plaats van beide.
Figuur 1: overzicht van de procedure.
Voedselmonsters worden fijngemalen en verdund tot steriele PBS. De helft van het PBS-voedsel monster wordt inocculeerd in RPM om te selecteren voor vegetatieve cellen. Het resterende PBS-voedings monster is hitte geschokt bij 85 °C gedurende 15 minuten om voor sporen te selecteren voorafgaand aan de inoculatie in RPM. De culturen worden geïnineerd op 37 °C en vervolgens geplateerd in TSC agar. TSC agar wordt geïnventariseerd op 37 °C en zwarte, sulfiet-reducerende culturen worden gesubculeerd in vers toerental. Subculturen van RPM-culturen worden geïnfiltreerd op 37 °C en DNA wordt geëxtraheerd om via PCR genotypering uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische voorstelling van de TSC agar sandwich techniek.
RPM-media met de C. perfringens -bacteriën worden tussen twee lagen TSC agar geplateerd om een anaerobe omgeving te bevorderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: geselecteerde PCR-resultaten.
Voorbeeldafbeeldingen van de genotypering resultaten van c. perfringens uit zeven verschillende soorten voedsel, en een positieve controle van c. perfringens type B. Een molecuulgewicht ladder (eerste rijstrook van elke gel) werd gebruikt om de grootte van PCR-resultaten in basis paren (BP) te benaderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Toxinotype | Alpha | Beta | Epsilon | Iota | Cpe | NetB | |
| Vastgesteld | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Voorgestelde | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + heden -niet aanwezig +/-kan al dan niet aanwezig zijn |
|||||||
Tabel 1: overzicht van de genotypes van C. perfringens . Een grafiek van de combinaties van toxines geproduceerd door elk C. perfringens toxinotype.
| Doel | Primer paren | Verwacht PCR-product (BP) |
| Alpha | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
~ 1300 |
Tabel 2: primers en verwachte PCR-producten voor geselecteerde toxine genen. Primers gebruikt in de PCR-genotypering stap.
| Type voedsel | Typt u een | Type B | Type C | Type D | C. perf + | |||||||
| Alfa toxine positief | Alfa-, bèta-en Epsilon-toxine-positief | Alfa en bèta toxine positief | Alfa en Epsilon toxine positief | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| Vlees | Rundvlees | 38 | 8 | 21 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 24 |
| Lam | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Varkensvlees | 15 | 2 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 13 | |
| Gemengde | 1 | 1 | 100% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 100% | |
| Subtotaal | 64 | 11 | 17 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 19 | |
| Pluimvee | Kip | 19 | 5 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 26 |
| Turkije | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Subtotaal | 26 | 5 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 19 | |
| Zeevruchten | Kabeljauw | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Gemengde | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Zalm | 11 | 2 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18 | |
| dieren | 32 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | |
| Snapper | 4 | 3 | 75% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75% | |
| Flounder | 12 | 4 | 33% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 33% | |
| Squid | 4 | 1 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 10 | 4 | 19 | |
| Tonijn | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Andere | 8 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 13 | |
| Subtotaal | 100 | 14 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 16 | 16 | |
| Zuivel | Koe | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Geit | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Melk | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Subtotaal | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Produceren | Plantaardige | 12 | 1 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| Fruit | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Kruid | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Subtotaal | 16 | 1 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | |
| Totale | 216 | 31 | 14 | 1 | 0,50% | 0 | 0 | 2 | 0,90% | 34 | 16 | |
Tabel 3: prevalentie van verschillende C. perfringens toxinotypes in 216 voedselmonsters. Een voorbeeld van de resultaten die worden verkregen bij het gebruik van deze methode om Retail Food voor C. perfringenste testen. Deze tabel is gewijzigd van het eerder gepubliceerde manuscript Regan et al.16.
Discussion
Hier beschrijven we een methode om C. perfringens prevalentie in detailhandel voedselmonsters met beperkte kweken en zonder gebruik van een anaerobe kamer systeem te identificeren. Deze methode gebruikt een combinatie van technieken om de identificatie van C. perfringens uit voedselmonsters te verhogen. Door gebruik te maken van een gemodificeerde versie van RPM media, zorgen we voor de selectieve groei van C. perfringens. Door het ingeënt toerental tussen de lagen van TSC agar te fixeren, kunnen we anaerobe, sulfiet-reducerende bacteriën identificeren en isoleren die kenmerkend zijn voor C. perfringens. Om de aanwezigheid van C. perfringenste bevestigen, worden sulfieten-reducerende kolonies gesubcultureerd in vers toerental. De gemodificeerde versie of RPM stelt ons in staat om eenvoudig DNA uit culturen te halen, waardoor PCR-bevestiging van specifieke toxine genen mogelijk is. Bevestiging van C. perfringens besmette voedselmonsters kunnen binnen drie dagen worden bereikt.
In vroege experimenten werden voedselmonsters eenvoudigweg geënt in RPM en DNA geëxtraheerd uit op culturen. Deze methode resulteerde in de detectie van C. perfringens in een beperkt aantal monsters (gegevens niet weergegeven). Hoewel RPM selectief is voor c. perfringens groei, is het niet exclusief voor c. perfringens groei. Andere, gram-positieve, D-cycolserine resistente bacteriën kunnen nog steeds groeien in RPM. We veronderstellen dat besmetting door andere bacteriesoorten onze detectie van C. perfringens -stammen kan verminderen door de gevoeligheid van onze PCR-analyse te verlagen in onze eerste on-rpm-cultuur. Een belangrijke stap in het verhogen van de detectie van C. perfringens was het opnemen van de TSC agar "sandwich"-techniek. Hierdoor konden we differentiëren en selecteren voor anaerobe, sulfieten-reducerende kolonies, kenmerkend voor C. perfringens. Een belangrijke stap in dit proces is ervoor te zorgen dat de bovenste laag van gesmolten TSC agar op 40 °C ligt. Hoewel sommige C. perfringens stammen kunnen groeien bij verhoogde temperaturen (46 – 48 °c)15,16, toevoeging van gesmolten agar bij verhoogde temperaturen vermindert de hoeveelheid culturen, meestal waarschijnlijk als gevolg van celdood .
Er zijn verschillende mogelijke beperkingen voor deze methode. Zoals eerder vermeld, selecteert of differentieert noch de RPM noch TSC agar voor C. perfringens uitsluitend, waardoor de groei van andere bacteriesoorten aanwezig in voedselmonsters mogelijk is. Dit kan de gevoeligheid van de test beperken om alleen C. perfringens te selecteren. Echter, dit is een gemeenschappelijke beperking in bijna alle kweektechnieken. Genotypbevestiging van gezuiverde isolaten is de beste methode voor het definitief identificeren van C. perfringens en andere bacteriesoorten. Een andere beperking van deze studie is dat we de gezuiverde isolaten niet testen. We hebben dit opzettelijk gedaan om de hoeveelheid kweken te beperken, omdat herhaalde kweken wordt gevreesd om te resulteren in plasmide verlies. Omdat we niet isoleren tot zuiverheid, is het mogelijk dat meerdere C. perfringens toxinotypes aanwezig kunnen zijn in hetzelfde monster of dezelfde subcultuur. Als onderzoekers gezuiverde isolaten willen verkrijgen, kunnen standaard zuiverings methoden worden gebruikt op de laatste RPM-cultuur die in deze methode wordt beschreven; Dit vereist meestal het gebruik van anaerobe kamers. Hoewel oorspronkelijk gebruikt om c. perfringens te isoleren van voedsel, kan deze methode worden gebruikt om c. perfringens te identificeren en te isoleren uit een veelheid van bronnen. Specifiek, een dergelijke toepassing van deze methode is het testen van fecale monsters van mensen (of dieren) waarvan vermoed wordt dat ze besmet zijn met C. perfringens en toxinotype de bacteriën om de bron van infectie beter te begrijpen.
Disclosures
Geen openbaarmakingen.
Acknowledgments
Dit onderzoek heeft geen specifieke financiering ontvangen van de sectoren Public, Commercial of not-profit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
