Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות שונים Clostridium הפרסטריגנים טוקנוסוגים של מזון מקומי נרכש, במיוחד אפסילון רעלן ייצור סוגי זן B ו-D, ללא שימוש בתאי אנאירובית.
Abstract
קלוסטרידיום פרפיגנס (ג. פרפיגנס) הוא מפיק רעלים פורה וגורם למגוון רחב של מחלות במארחים שונים. ג. פרהגנס מסווג לחמישה רעלים שונים, A דרך E, מבוסס על כרכרה של ארבעה גנים הרעלן העיקריים. השכיחות וההפצה של הרעלים השונים הללו הם בעלי לימודים שונים, במיוחד הpervasiveness שלהם במזון הקמעונאי האמריקאי. עניין מיוחד לנו הם הסוג B ו-D זנים, אשר מייצרים אפסילון רעלן, רעלן קטלני ביותר הציע להיות הגורם הסביבתי של טרשת נפוצה בבני אדם. כדי להעריך את הנוכחות של C. pergens רעלים שונים בדגימות מזון שונים, פיתחנו שיטה קלה באופן סלקטיבי תרבות חיידקים אלה ללא שימוש במערכת מכולה אנאירובית רק מעורבים שלושה צעדים culturing. מזון נרכש מחנויות מכולת מקומיות ומועבר למעבדה בתנאי הסביבה. דגימות הם כתוש ומחוסן לתוך שונה מדיה הפרטוגנים מהירה (RPM) ו מודבטים לילה ב 37 ° c בצינור אטום, אטום חרוט. תרבויות לילה מחוסנת על שכבה תחתונה של טריקטוז סולפיט ציקלוסרין (TSC) אגר, ולאחר מכן מצופה בשכבה העליונה של מותכת TSC אגר, יצירת סביבה "דחוקה", אנאירובית. לוחות אגר מודבטים לילה ב 37 ° c ולאחר מכן מוערך עבור המראה של שחור, סולפיט להפחתת המושבות. ג. הפרטוגנים-מושבות החשודות מוסרות מ-tsc אגר באמצעות מדרומי עיניים סטריליים, ומחוסן לתוך RPM ו-sub-תרבותי לילה ב 37 ° c בצינור אטום חרוט. ה-DNA מופק מתוך תת-תרבות RPM, ולאחר מכן ניתח עבור נוכחות של C. הפרשגנים הרעלן באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). בהתאם לסוג המזון שנדגם, בדרך כלל 15-20% של דגימות מבחן חיובי עבור C. פרשגנס.
Introduction
קלוסטרידיום פרצגנס (ג. פרצגנס) הוא גראם חיובי, אנאירובי, יוצר נבג, חיידק בצורת מוט שנמצא אוביקוויטיבי בסביבה. זן זה של חיידקים נושאת גנים המקודדים במשך מעל 17 רעלים, היסטורית, התאפיין בחמישה רעלים (A-E) מבוסס על נוכחות של ארבעה גנים הרעלן שונים: אלפא, בטא, אפסילון, ו הרעלן איודה (שולחן 1)1. לאחרונה, הוצע כי זו ערכת הקלדה צריך להתרחב כדי לכלול את הסוגים F ו-G, אשר הנמל C. pergens בידור (cpe) ו-netb הרעלן, בהתאמה2. עם זאת, נדרש מחקר נוסף לפני מערכת זו מזימות מקובלת רשמית. בעוד גן אלפא רעלן הוא בהחלט ממוקם כרומוסומלית, הגן CPE ניתן למצוא הן על כרומוזום ו פלמידים. לעומת זאת, הגנים הנותרים של הרעלים מצויים בפלמידים שונים בגודל שונה. אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של C. pergens סוגים B ו D כמו זנים אלה לייצר אפסילון רעלן, חזק מאוד, הנקבוביות להרכיב רעלן, אשר הוצע לשחק תפקיד מפעילה טרשת נפוצה (MS) בבני אדם3 ,4,5,6,7. כיצד אנשים הופכים נגועים או הכובש על ידי זנים אלה אינו ידוע. הסבר אפשרי אחד הוא באמצעות צריכת מוצרי מזון מזוהמים. כדי לעזור לענות על שאלה זו, ביקשו לקבוע את השכיחות של שונים של C. הפרגנים רעלים בדגימות המזון האמריקאי.
הנוכחות של C. pergens רעלים בדגימות המזון האמריקאי הוא למד לעתים קרובות דורש שימוש של מערכות מכולה אנאירובית ושלבים רבים sub-culturing8,9,10,11 . למרות שפעולות sub-culturing רבות נחוצות כדי לקבל מבודד מטוהר, שיטה זו יכולה להוביל לאובדן של פלמידס לאורך זמן12,13,14, ואולי להשפיע על גילוי של גנים רעלן בשלבי המועברות . כולל הגן הרעלן של אפסילון ביקשו לפתח שיטה קלה, עם פחות צעדים תת-שלבי, לתרבות בררנית C. פרפוגנים ללא שימוש בתאים אנאירובית, צנצנות או שקיות. בקצרה, דגימות מזון מחוסנו לתוך מדיה פרטוגנס מהירה (RPM) לילה (ב), אז "דחוקה" לתוך TSC אגר ו מודב. המושבות שנחשדו כאלה הם משני מתורבתים לאחר מכן לתוך סל ד ומודגרות שוב ושוב . ה-DNA מופק ו-PCR המבוצעים כדי לקבוע גנוטיפ (איור 1). בחרנו להשתמש RPM כפי שהוא הוכח כדי להגדיל את ההתאוששות של C. pergens זנים מתוך דגימות מזון לעומת מדיה רגילה אחרים15. בנוסף, RPM השתמשו בהצלחה כדי לבודד את אפסילון מייצר סוג B זן מחולה MS4. אנו משתמשים בגירסה ששונתה של RPM במקום בגירסה המקורית כדי לאפשר חילוץ קל DNA. בעוד שיטה זו מאפשרת זיהוי קל של גנים הרעלן בתוך דגימות, ייתכן שמדגם בודד יכיל יותר C. pergens toxinotype. מכיוון שהשיטה שלנו לא לבודד זנים מטוהרים באמצעות סיבובים מרובים של טיהור, זיהוי של רעלים מרובים מדגם אחד אינו אפשרי. עם זאת, טכניקות טיהור סטנדרטיות (בדרך כלל יורד על צלחות TSC או לוחות דם אגר) ניתן להחיל בסוף הפרוטוקול שלנו כדי להשיג תרבויות מטוהרים.
Protocol
הערה: ג. פרטיגנס נחשב לסיכון ביולוגי ברמת בטיחות 2 (BSL2). למרות שלא כל דגימות המזון יכילו את הג, יש להתייחס לכל הדגימות המתורבתות ככאלה. יש לענוד את כל אמצעי הזהירות וציוד ההגנה הנאותים (PPE) בכל עת. טהרים כל החומר לפני סילוק.
1.הכנת RPM שונה 4,15
- לשלב 30 g/L נוזל thioglycolate בינוני, 60 g/L ג'לטין, 5 g/L peptone, 5 g/L גלוקוז, 5 g/L אשלגן פוספט dibasic, 3 g/L תמצית שמרים, 1.5 g/L נתרן כלוריד, 0.5 g/L ברזל סולפט במים מיווים עד שווה התפזרו. אנחנו בדרך כלל עושים 1 קבוצות L.
- אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות.
- אפשר להתקרר כ 40 ° c.
- לאחר RPM הוא קריר, להוסיף D-ציקלוסרין לריכוז הסופי של 440 mg/L.
הערה: ריכוזי המלאי של D-ציקלוסרין הומס במים סטריליים ב-50 מ"ג/mL עשויים להיות מאוחסנים ב-20 ° c לשימוש עתידי. - העברה באופן כסטי 10 מ ל של RPM עד 15 מ ל שפופרות חרוט. RPM ניתן להכין בקבוצות ומאוחסנות ב -4 ° c עד חודש אחד.
- מעבר ל37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. אוסף דוגמאות ודגירה RPM
- הובלה מזון למעבדה תחת טמפרטורות הסביבה בתוך 1 h. ניתן להעביר מזון באריזות מקוריות או במכולות סטרילי. אם לא בודקים מיד, ניתן לאחסן את המזון ב-20 ° צ' עד לשימוש. שים לב לסוג המזון ולמדינת המקור בהתאם לתווית האריזה, אם הוא זמין, וכן כל מידע רלוונטי אחר.
- הסר כ 1.0 – 2.0 גר' מזון והעברה לצלחת פטרי סטרילית או שווה ערך. . עם סכין גילוח סטרילי או אזמל
- האיחסן לתוך 10 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) ב 15 מ"ל צינור חרוט. . תערבב היטב
- כדי לבחור עבור תאים וגטטיבי, להעביר 5 מ ל של תערובת מזון PBS לתוך שפופרת של 15 מ ל בצורת חרוט 10 מ ל של RPM. . תאבטחו את המכסה בחוזקה
- כדי לבחור עבור נבגים, לחמם את הנותרים 5 מ ל של תערובת מזון PBS ב 85 ° c עבור 15 דקות ולאחר מכן להעביר לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ ל של RPM. . תאבטחו את המכסה בחוזקה
- מערבולת ולהפוך את המזון-RPM התרבויות כדי להבטיח ערבוב מלא.
- חותם הדוק את צינורות חרוט ולעטוף מכסים עם סרט פרפין או ניילון לעטוף כדי להבטיח סביבה אנאירובית.
- דגירה לילה (ב) ב 37 ° c.
- למחרת בבוקר הערה כל עכירות או תסיסה בצינורות RPM.
3. הציפוי "סנדוויץ '"
- החיסונים על התרבויות RPM לתוך TSC אגר באמצעות טכניקת "סנדוויץ '" (איור 2) המתואר להלן.
- הכינו TSC נאגר לפי הוראות היצרן.
- הכינו את שכבת הבסיס של צלחות TSC על ידי העברת 10 מ ל של TSC מותכת אגר כדי מנות פטרי סטרילי ולאפשר לגבש. אלה עשויים להיות מוכנים בשלב מתקדם ומאוחסן ב -4 ° c. יש לוודא שלוחות מחוממים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- עבור השכבה העליונה של לוחית TSC, לשמור על הנותרים TSC אגר מותכת ב 40 ° c.
הערה: למרות שנקודת ההיתוך של אגר היא מעל 85 ° c, אגר מותכת מתקשה סביב 32-45 ° צ'.
- בזהירות לאחזר את התרבויות ON RPM ולהעביר 100 μL לבסיס TSC אגר. בגלל תסיסה, יש תרבויות שעלולות להיות תחת לחץ. הקפידו ללבוש את כל הPPE המתאים.
- הפיצו את סל ד באמצעות חרוזי זכוכית מעוקר או spreader תא.
- אפשר RPM להיות "נספג" לתוך TSC אגר עבור 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- העברה בזהירות של 20 מ ל של מותכת, 40 ° c מעלות צלזיוס לצלחת באמצעות מצפטה סרוולוגית.
- להחליף את מכסה צלחת פטרי ולאפשר TSC אגר כדי לחזק לחלוטין בטמפרטורת החדר.
- היפוך צלחת פטרי ו הדגירה ב 37 ° c ON.
- אם מדלל סדרתי רצוי, לבצע דילול של התרבויות ON RPM לתוך טרי, מחומם מראש התחמם לפני החיסון TSC אגר.
4. תת-הנפה של מושבות סולפיט-הפחתת
- למחרת בבוקר, להסיר צלחות מתוך החממה ולבחון את הצמיחה חיידקי. חיידקים אירוביים עשויים להיות נוכח על פני השטח של אגר. חיידקים אנאירובית ימצאו גדל מוטבע בתוך אגר. סולפיט-להפחתת חיידקים להפוך סביב אגר שחור. ניתן לקבל מושבות של הפראגנים יהיו שחורים ומשובצים באגר.
- ג. הפרתוגנים החשודים במושבות יהיו חיוביים להפחתת סולפיט והוא יופיע שחור, מוטבע בתוך אגר. באמצעות הטפטפת סטרילי, להשתמש יחיד, "לקטוף" את המושבות השחורות מן אגר ולהעביר 10 מ ל של סל ד טרי ב 15 מ"ל שפופרת חרוט. חשוב כי האוויר מן הטפטפת להיות מגורש לפני פירסינג אגר.
- אם יש כמות צפופה של גידול בקטריאלי אירובית על פני השטח של הצלחת, להשתמש מגרד תא סטרילי להסיר מושבות מאזורים נבחרים. מספר רב של מושבות החשודים במושבות ניתן לדגום מלוחית ה-tsc באותה הצלחת לתוך התרבויות הנפרדות של RPM.
- שפופרת מאובטח היטב בצינור חרוט ולעטוף בסרט פרפין או ניילון לעטוף. . מופעל ב-37 ° c
5. הפקת דנ א
- להסיר על התרבויות RPM ולבחון סימנים של צמיחה כולל עכירות ותסיסה.
- להפוך בעדינות את התרבות RPM לפזר חיידקים שיוחסו ופתוח בזהירות. העבר 1 מ ל של התרבות לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה במהירות העליונה (כ 15,000 x g) עבור 10 דקות כדי חיידקים גלולה.
- לשטוף את הגלולה עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי.
- בנסיבות מסוימות, ג'לטין לא מתעכל יהיה ליישב על גבי חיידקים לפלטד. כדי להסיר את הג, "מוך" מחוץ לג על ידי הגאתה בעדינות עם PBS באמצעות מיקרופיפטה. בזמן שהוא משאיר. את הגלולה החיידקית ללא פגע
- הסירו את תערובת הPBS-ג'לטין. בשאיפה עדינה השהה מחדש את הגלולה החיידקית הנותרת עם 1 מ ל של PBS טרייה.
- צנטריפוגה את הגלולה החיידקית מחדש במהירות הגבוהה ביותר עבור 10 דקות ומתה בזהירות את הסופרנטאנט.
- באופן מיידי לבצע חילוץ DNA באמצעות ערכת החילוץ DNA ופרוטוקול שנוצר במיוחד עבור ה-DNA החילוץ מחיידקים גראם חיוביים (לראות את הטבלה של חומרים).
- השתמש ב-DNA חילוץ מיד או לאחסן ב-20 ° c עד ניתוח ה-PCR.
6. זיהוי הפרשגנים באמצעות ה-PCR
- כדי לקבוע אם התרבויות הן חיוביות עבור C. שולי רעלים רעילות, לבדוק DNA שחולצו עבור גנים שונים רעלן באמצעות ה-PCR.
הערה: מכיוון שאנו מעוניינים בעיקר ב-אפסילון רעלן הפקת זנים B ו-D C. פרשגנס, אנו מעריכים את נוכחותם של הגנים אלפא, בטא, ו אפסילון הרעלן. . התחל מופיע בשולחן 2 התחל עבור ה-DNA ריבוזומבית של 16 s משמשים כבקרת חילוץ DNA. ניתן להשתמש בצבעי יסוד נוספים כדי לבדוק רעלים מסוג A עד G וניתן למצוא אותם בספרות המפורסמת2,12,13. - השימוש שחולצו בעבר ג. א. ה. DNA כשליטה חיובית. פקד זה מבטיח שכל הרכיבים של תגובות ה-PCR פועלים. אנו משתמשים ב-DNA שחולצו מ -C פרשגנס סוג B (atcc 3626) כמו שליטה חיובית שלנו. לגדול ATCC 3636 ON ב-RPM ב 37 ° צ' ו לחלץ DNA באמצעות אותן שיטות שתוארו בשלבים 5.1 – 5.7. חנות DNA שחולצו ב-20 ° צ' עד השימוש.
- הגדר את תנאי ה-PCR כדלקמן: 94.0 ° צ' למשך 3 דקות; 94.0 ° צ' עבור 30 ס מ; 47.9 ° צ' עבור 30 s, 72.0 ° צ' עבור 1 דקות (חזור על שלבים 2 – 4 עבור 35 מחזורים); 72.0 ° c במשך 10 דקות.
- כדי לאשר את מוצרי ה-PCR, הפעל את תגובות ה-PCR ב-1.8 g/100 מ"ל ג'ל באמצעות טכניקות סטנדרטיות. גדלי המוצר הצפויים של ה-PCR מפורטים בטבלה 2. תוצאות ה-PCR האופייניות מוצגות באיור 3.
Representative Results
באמצעות שיטה זו, 15 – 20% של המזונות שנדגמו שלנו מבחן חיובי C. פרסוגנים. בעוד רוב הזנים הם חיוביים עבור toxinotype A, הבחנו בהצלחה הן סוג B ו-D בדגימות מזון. בעיתון שפורסם בעבר בדקנו סך של 216 דגימות מזון שנרכשו מניו יורק החנויות הקמעונאיות16 (שולחן 3). דגימות אלה כללו דגימות בשר שונות (בשר בקר, כבש, חזיר טלה), דגימות עוף (עוף והודו), ודגימות פירות ים (בקלה, סלמון, רכיכה, מכיש, פלאנדר, דיונון, אמנון, טונה, ודגים שונים). התוצרת ודגימות החלב נבדקו גם הם. של 216 דגימות, 34 (16%) היו חיוביות ל -C. פרפראגנים. של 34 C. הפרהגנים דגימות חיוביות, 31 דגימות (91.2%) הכיל את הרעלן אלפא, מדגם אחד (2.9%) הכיל את אלפא, בטא, אפסילון הרעלן, ושתי דגימות (5.9%) הכיל את האלפא. והרעל אפסילון
מעניין, גילינו גם כי C. פרשוגנים היה נפוץ יותר כמו תאים וגטטיבי לעומת הנבגים. עשרים וחמש דגימות הושוו לנוכחות של וגטטיבי C. שולי תאים או נבגים. נבגים נבחרו על ידי מחממים דגימות מזעזע ב 85 ° c עבור 15 דקות. מתוך 25 דגימות נבדק, 16% היו חיוביים עבור וגטטיבי C. הפרטגנים זנים לעומת 4% עבור נבגים. זה מצביע על כך שהוא עשוי להיות יעיל יותר לבדוק רק תאים וגטטיבי במקום שניהם.
איור 1: מבט כולל על הפרוצדורה.
דגימות המזון מדולולות. ומדולל בתוך הערוץ הסטרילי מחצית מדגימת ה-PBS-פוד מחוסנת לתוך RPM כדי לבחור עבור תאים וגטטיבי. מדגם ה-PBS-פוד הנותר מזועזע מחום ב-85 ° c במשך 15 דקות כדי לבחור לנבגים לפני החיסון לפני החיסונים. תרבויות מודבטים על 37 ° c ומצופה לתוך TSC אגר. TSC אגר הוא מודב ב 37 ° צ' ושחור, התרבויות להפחתת סולפיט הם תת תרבותית לתוך סל ד טרי. תרביות סל ד מתורבת הם מודבטים ב 37 ° c ו-DNA מופק לבצע גנוהקלדה באמצעות ה-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמטית של טכניקת הסנדוויץ ' TSC אגר.
מדיית RPM המכילה את החיידקים של C. pergens מצופים בין שתי שכבות של tsc אגר על מנת לקדם את הסביבה אנאירובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות ה-PCR שנבחרו.
תמונות לדוגמה של תוצאות הגנוטיפ של c. פרשגנים משבעה סוגים שונים של מזון, ושליטה חיובית של c. פרשגנס סוג B. סולם משקל מולקולרי (הנתיב הראשון של כל ג'ל) שימש לקירוב הגודל של תוצאות ה-PCR בזוגות בסיס (bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| טוקנוטיפ | אלפא | בטא | אפסילון | איודה | CPE | הוצאת רשת | |
| וקמה | קצת | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| מוצע | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + הווה -לא נוכח +/-ייתכן או לא להיות נוכח |
|||||||
שולחן 1: מבט כולל על מבני הגנוסוגים. תרשים של שילובים של רעלים המיוצר על ידי כל C. פרשגנס toxinotype.
| יעד | פריימר זוגות | מוצר ה-PCR הצפוי (bp) |
| אלפא | שאלה: המנון מועצת התיירות R: CCT CCT החתול CCT GTA AG |
325 |
| בטא | מועד הבית של החתול CTG R: GCA GCA משחק המשחק |
196 |
| אפסילון | F: GCG GTG ATA להתחייבויותיו לאווירית R: אמנות עכשווית מעשה TGT CTT למעשה |
655 |
| שנות ה-RNA | F: אגה GTT TGA TGA CTC A R: משחק מחלקה T |
ל1300 |
טבלה 2: מוצרי ה-PCR התחל והצפוי עבור גנים הרעלן הנבחרים. התחל בשימוש בשלב ההקלדה. של הPCR
| סוג מזון | סוג א | סוג ב' | סוג ג | סוג ד | ג. perf + | |||||||
| אלפא רעלן חיובי | אלפא, בטא, ו-אפסילון הרעלן חיובי | אלפא ורעלן ביתא חיובי | אלפא ו אפסילון הרעלן חיובי | |||||||||
| n | n | % | n | % | n | % | n | % | n | % | ||
| בשר | בשר | 38 | 8 | 21 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 24 |
| כבש | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| חזיר | 15 | 2 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 13 | |
| מעורב | 1 | 1 | 100% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 100% | |
| יניים | 64 | 11 | 17 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 19 | |
| עופות | עוף | 19 | מיכל 5 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | מיכל 5 | 26 |
| טורקיה | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| יניים | 26 | מיכל 5 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | מיכל 5 | 19 | |
| פירות ים | קלה | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| מעורב | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| סלמון | 11 | 2 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18 | |
| מיכל שלפיש | 32 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | |
| כיש | 4 | 3 | 75% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75% | |
| פלאונדר | 12 | 4 | 33% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 33% | |
| דיונון | 4 | 1 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
| אמנון | 21 | 2 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 10 | 4 | 19 | |
| טונה | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| אחרים | 8 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 13 | |
| יניים | 100 | 14 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 16 | 16 | |
| חלב | פרה | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| עז | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| חלב | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| יניים | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| ייצר | ירקות | 12 | 1 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| פירות | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| הרב | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| יניים | 16 | 1 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | |
| כולל | 216 | 31 | 14 | 1 | 0.50% | 0 | 0 | 2 | 0.90% | 34 | 16 | |
שולחן 3: השכיחות של הפרזגנים השונים של ה-C. בדיקות רעלים ב-216 מזון. דוגמה לתוצאות שהתקבלו בעת שימוש בשיטה זו כדי לבדוק מזון קמעונאי עבור C. פרשגנס. טבלה זו שונתה מתוך כתב היד הקודם של ריגן ואח '16.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה כדי לזהות את השכיחות של C. שכיחות בדגימות מזון קמעונאי עם subculturing מוגבלת, ללא שימוש במערכת קאמרית אנאירובית. שיטה זו משתמשת בשילוב של טכניקות כדי להגביר את הזיהוי של C. פרסוגנים מדגימות מזון. על-ידי שימוש בגירסה ששונתה של מדיית RPM, אנו מאפשרים את התפתחותם הסלקטיבית של C. פרמיגנס. על ידי sandwiching את סל ד מחוסן בין שכבות של TSC אגר, אנחנו מסוגלים לזהות ולבודד אנאירובית, סולפיט הפחתת חיידקים מאפיין של C. פרצוגנים. כדי לאשר את נוכחותו של C. pergens, סולפיט המושבות מושבות הם תת-תרבותית לתוך סל ד טרי. הגרסה ששונתה או RPM מאפשר לנו בקלות לחלץ DNA מתרבויות, המאפשר אישור PCR של גנים הרעלן ספציפיים. אישור לקבלת דגימות מזון מזוהם ניתן להשיג בתוך שלושה ימים.
בניסויים מוקדמים, דגימות מזון היו פשוט מחוסן לתוך RPM ו-DNA שחולצו מן התרבויות. שיטה זו הביאה לגילוי של C. פרסוגנים במספר מצומצם של דגימות (נתונים לא מוצגים). למרות RPM הוא סלקטיבי לצמיחה c. pergens , זה לא בלעדי עבור c. פרמיגנס צמיחה. אחר, גראם חיובי, D-cycolserine חיידקים עמידים עדיין יכול לגדול RPM. אנו שיערו כי זיהום על ידי מינים חיידקים אחרים אולי ירדו הגילוי שלנו של C. pergens זנים על ידי הפחתת רגישות של ניתוח ה-PCR שלנו הראשון שלנו בתרבות RPM. צעד מכריע בהגברת הזיהוי של הטכניקה הייתה הכללה של טכניקת ה סנדוויץ ' של tsc אגר. זה איפשר לנו להבדיל ולבחור עבור המושבות אנאירובית, סולפיט הפחתת מושבות, מאפיין של C. פרסגנס. צעד מפתח בתהליך זה הוא להבטיח כי השכבה העליונה של TSC אגר מותכת הוא ב 40 ° c. למרות שזנים של C. pergens יכול לצמוח בטמפרטורות מוגברת (46 – 48 ° c)15,16, תוספת של אגר מותכת בטמפרטורות מוגברת מפחית במידה ניכרת את כמות התרבויות ששוחזרו, בעיקר כנראה בשל מוות התאים .
קיימות מספר מגבלות פוטנציאליות לשיטה זו. כפי שהוזכר קודם לכן, לא RPM או TSC אגר בוחרת או מבדיל עבור C. פרצוגנים באופן בלעדי, המאפשר צמיחה של זנים חיידקיים אחרים להיות בדגימות מזון. זה עשוי להפחית את הרגישות של האפשרות לבחור עבור C. הפרגנים בלבד. עם זאת, זוהי מגבלה נפוצה כמעט כל טכניקות culturing. אימות הגנוזה של מבודד מטוהר הוא השיטה הטובה ביותר לזיהוי בוודאות של C. פרפיגנס ומינים חיידקיים אחרים. מגבלה נוספת של מחקר זה היא כי אנחנו לא לבדוק את הבודד מטוהר. במתכוון עשינו את זה כדי להגביל את כמות subculturing, כמו subculturing חוזרת הוא חשש לגרום הפסד פלמיד. מכיוון שאיננו מבודדים לטוהר, ייתכן כי מספר רב של מרבית הרעלים עלולים להיות נוכחים באותה דוגמית או תת-תרבות. אם החוקרים רוצים לקבל מבודד מטוהרים, שיטות טיהור סטנדרטי ניתן להשתמש בתרבות RPM האחרון שמתואר בשיטה זו; זה דורש בדרך כלל את השימוש של תאים אנאירובית. למרות ששימש במקור לבידוד c. פרסוגנים ממזון, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולבודד c. פרסוגנים מהמון מקורות. במיוחד, יישום אחד כזה של שיטה זו היא לבדוק דגימות צואה של בני אדם (או בעלי חיים) כי הם חשודים נגועים עם C. פרצוגנים ורעלים החיידקים כדי להבין טוב יותר את מקור הזיהום.
Disclosures
אין הגילויים.
Acknowledgments
מחקר זה לא קיבל שום מימון ספציפי ממגזר הציבורי, המסחרי או לא-למטרות רווח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
