Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare diversi Clostridium perfringens tossinotipi negli alimenti acquistati localmente, in particolare la tossina epsilon che produce i tipi di ceppo B e D, senza l'uso di camere anaerobiche.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) è un prolifico produttore di tossine e causa una vasta gamma di malattie in vari ospiti. C. perfringens è classificato in cinque diversi tossinotipi di tossinotipi, da A a E, sulla base del carrello di quattro geni della tossina principali. La prevalenza e la distribuzione di questi vari tossinotipi è poco studiata, in particolare la loro pervasività nel cibo al dettaglio americano. Di particolare interesse per noi sono i ceppi di tipo B e D, che producono tossina a epsilon, una tossina estremamente letale suggerita come il trigger ambientale della sclerosi multipla negli esseri umani. Per valutare la presenza di diversi c. perfringens tossinotipi in vari campioni di alimenti, abbiamo sviluppato un metodo semplice per coltivare selettivamente questi batteri senza l'uso di un sistema di contenitori anaerobici che coinvolge solo tre fasi di coltura. Il cibo viene acquistato presso i negozi di alimentari locali e trasportato in laboratorio in condizioni ambientali. I campioni vengono macinati e inoculati in mezzi di perfligitura rapidi modificati (RPM) e incubati durante la notte a 37 gradi centigradi in un tubo conico sigillato e ermetico. Le colture notturne vengono inoculate su uno strato inferiore di solido agar di sulfitto di trytoso (TSC), e poi sovrapposte con uno strato superiore di agar TSC fuso, creando un ambiente anaerobico "sandwiched". Le piastre di agar vengono incubate durante la notte a 37 gradi centigradi e poi valutate per l'aspetto di colonie nere che riducono il solfuro. C. perfringens-presuntocolonie vengono rimossi dall'agar TSC utilizzando contagocce sterili, e inoculato in RPM e sub-colmato durante la notte a 37 gradi centigradi in un tubo conico ermetico. Il DNA viene estratto dalla sottocultura RPM e quindi analizzato per la presenza di c. perfringens i geni della tossina tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). A seconda del tipo di alimento campionato, in genere il 15-20% dei campioni risulta positivo a C. perfringens.
Introduction
Il Clostridium perfringens (C. perfringens) è un batterio a forma di asta grammo positivo, anaerobico, formato spore, che si trova onnipresente nell'ambiente. Questa specie di batteri trasporta geni che codificano per oltre 17 tossine e, storicamente, è stata caratterizzata in cinque tossinotipi (A-E) basati sulla presenza di quattro diversi geni della tossina: alfa, beta, epsilon e tossina iota (Tabella 1)1. Recentemente, è stato suggerito che questo schema di battitura deve essere ampliato per includere i tipi F e G, che ospitano il C. perfringens enterotoxin (CPE) e netB tossina, rispettivamente2. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche prima che questo sistema di intrighi sia formalmente accettato. Mentre il gene della tossina alfa è rigorosamente localizzato in cromosomi, il gene CPE può essere trovato sia sul cromosoma che sui plasmidi. In confronto, i geni rimanenti delle tossine si trovano su vari plasmidi di dimensioni diverse. Siamo particolarmente interessati alla prevalenza di C. perfringens tipi B e D poiché questi ceppi producono tossina a epsilon, una tossina estremamente potente e formata dai pori, che è stata suggerita per svolgere un ruolo nell'innesco della sclerosi multipla (MS) negli esseri umani3 ,4,5,6,7. Come le persone si infettano o colonizzati da questi ceppi è sconosciuto. Una possibile spiegazione è attraverso il consumo di prodotti alimentari contaminati. Per aiutare a rispondere a questa domanda, abbiamo cercato di determinare la prevalenza di diversi tossicotipi di C. perfezione nei campioni alimentari americani.
La presenza di C. perfringens tossinotypes nei campioni alimentari americani è poco studiata e spesso richiede l'uso di sistemi di contenitori anaerobici e numerosi passaggi sub-culturanti8,9,10,11 . Sebbene siano necessarie numerose fasi di sub-coltura per ottenere isolati purificati, questo metodo può portare alla perdita di plasmidi nel tempodi 12,13,14, con possibili effetti di rilevamento di geni di tossina trasmessi da plasmide compreso il gene della tossina epsilon. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo semplice, con meno passaggi sub-coltura, per la coltura C. perfringens selettivamente senza l'uso di camere anaerobiche, barattoli o sacchetti. In breve, i campioni di cibo vengono inoculati in Rapid Perfringens Media (RPM) durante la notte (ON), quindi "sandwiched" in TSC agar e incubato ON. Le colonie sospettate di essere C. perfringens vengono poi sub-coltivate in RPM e incubate di nuovo ON. Il DNA viene estratto e la PCR eseguita per determinare il genotipo (Figura 1). Abbiamo scelto di utilizzare RPM come è stato dimostrato per aumentare il recupero di ceppi C. perfringens da campioni di cibo rispetto ad altri supporti più standard15. Inoltre, l'RPM è stato utilizzato con successo per isolare una tossina epsilon che produce ceppo B di tipo B da un paziente MS4 . Usiamo una versione modificata di RPM invece della versione originale per consentire una facile estrazione del DNA. Sebbene questo metodo consenta una facile identificazione dei geni delle tossine all'interno dei campioni, è possibile che un singolo campione contenga più di un tossinotipo C. perfringens. Poiché il nostro metodo non isola i ceppi purificati utilizzando più cicli di purificazione, l'identificazione di più tossinotipi da un campione non è possibile. Tuttavia, le tecniche standard di purificazione (tipicamente striature su piastre TSC o piastre di agar di sangue) possono essere applicate alla fine del nostro protocollo per ottenere colture purificate.
Protocol
NOTA: C. perfringens è considerato un organismo di livello 2 (BSL2) di pericolo di biosicurezza. Anche se non tutti i campioni di cibo conterranno C. perfringens, tutti i campioni coltivati dovrebbero essere trattati come tali. Tutte le precauzioni adeguate e le attrezzature protettive per il personale (PPE) devono essere indossate in ogni momento. Decontaminare tutto il materiale prima dello smaltimento.
1. Preparare l'RPM modificato4,15
- Unire 30 g/L di tiogolicololate medio, 60 g/L di gelatina, 5 g/l peptone, 5 g/L di glucosio, 5 g/L didiete fosfato dibasic, 3 g/L di estratto di lievito, 1,5 g/L di cloruro di sodio, 0,5 g/L ferrousso solfato in acqua dionizzata fino a disperarsi in modo uniforme. In genere creiamo lotti da 1 L.
- Autoclave a 121 gradi centigradi per 15 min.
- Lasciar raffreddare a circa 40 gradi centigradi.
- Una volta RPM è fresco, aggiungere D-cycloserine ad una concentrazione finale di 440 mg/L.
NOTA: Le concentrazioni di valori di D-cicloserina disciolte in acqua sterile a 50 mg/mL possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un uso futuro. - Trasferire aquanto pareccosa mente 10 mL di RPM a tubi conici da 15 mL. L'RPM può essere preparato in lotti e conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese.
- Caldo RPM a 37 gradi centigradi prima dell'uso.
2. Raccolta di campioni e incubazione RPM
- Trasportare alimenti in laboratorio a temperature ambiente entro 1 h. Gli alimenti possono essere trasportati in imballaggi originali o contenitori sterili. Se non si prova immediatamente, il cibo può essere conservato a -20 gradi centigradi fino all'uso. Prendere nota del tipo di alimento e del paese di origine in base all'etichetta di imballaggio, se disponibile, nonché qualsiasi altra informazione pertinente.
- Rimuovere circa 1,0–2,0 g di cibo e trasferirli nella sterile parabola Petri o equivalente. Tritare finemente con una lama sterile di rasoio o bisturi.
- Inoculare in 10 mL di fosfato buffers salina (PBS) in un tubo conico da 15 mL. Mescolare bene.
- Per selezionare per le cellule vegetative, trasferire 5 mL della miscela PBS-food in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Fissare saldamente il coperchio.
- Per selezionare per le spore, riscaldare i restanti 5 mL di miscela pbS-alimenti a 85 gradi centigradi per 15 min e quindi trasferire in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Fissare saldamente il coperchio.
- Vorticare e invertire le colture food-RPM per garantire una miscelazione completa.
- Sigillare saldamente i tubi conici e avvolgere i coperchi con pellicola di paraffina o pellicola trasparente per garantire un ambiente anaerobico.
- Incubare durante la notte (ON) a 37 .
- La mattina seguente notare qualsiasi torbidità o fermentazione nei tubi RPM.
3. TSC "sandwich" placcatura
- Inoculare le impostazioni cultura RPM ON in TSC agar utilizzando una tecnica "sandwich" (Figura 2) descritta di seguito.
- Preparare l'agar TSC in base alle istruzioni del produttore.
- Preparare lo strato di base delle piastre TSC trasferendo 10 mL di agar TSC fuso a sterili piatti Petri e lasciare solidificare. Questi possono essere preparati in avanzata e conservati a 4 gradi centigradi. Assicurarsi che le piastre siano riscaldate a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Per lo strato superiore della piastra TSC, mantenere l'agar TSC fuso rimanente a 40 gradi centigradi.
NOTA: Anche se il punto di fusione dell'agar è superiore agli 85 gradi centigradi, l'agar fuso si solidifica intorno ai 32-45 gradi centigradi.
- Recuperare con attenzione le colture ON RPM e trasferire 100 l all'agar TSC. A causa della fermentazione, alcune culture possono essere sotto pressione. Assicurarsi di indossare tutto il PPE appropriato.
- Stendere l'inoculo RPM utilizzando perline di vetro sterilizzato o spalmatore cellulare.
- Lasciare che l'RPM venga "assorbito" nell'agar TSC per 5-10 min a temperatura ambiente.
- Trasferire con cura 20 mL di fuso, 40 c'agar tramite piastra utilizzando una pipetta sierologica.
- Sostituire il coperchio della teglia Petri e lasciare che l'agar TSC si solidifichi completamente a temperatura ambiente.
- Invertire il piatto Petri e incubare a 37 gradi centigradi.
- Se si desidera comporre le diluizioni seriali, eseguire le diluizioni delle impostazioni cultura ON RPM in RPM freschi e preriscaldati prima dell'inoculazione nell'agar TSC.
4. Sottocoltura di colonie che riducono il solfato
- La mattina seguente, rimuovere le piastre dall'incubatrice ed esaminare la crescita batterica. I batteri aerobici possono essere presenti sulla superficie dell'agar. I batteri anaerobici saranno trovati in crescita incorporato all'interno dell'agar. I batteri che riducono il solfato diventeranno neri circostanti l'agar. Possibili colonie C. perfringens saranno nere e incorporate nell'agar.
- C. perfezioni colonie sospette saranno positive per la riduzione del solfato e appariranno nere, incorporato all'interno dell'agar. Utilizzando un contagocce sterile e monouso, "pizzicare" le colonie nere dall'agar e trasferire a 10 mL di RPM fresco in un tubo conico da 15 mL. È importante che l'aria dal contagocce venga espulsa prima di perforare l'agar.
- Se c'è una fitta quantità di crescita batterica aerobica sulla superficie della piastra, utilizzare un raschietto a cellule sterili per rimuovere colonie da aree selezionate. Più C. perfringens colonie sospette possono essere campionati dalla stessa piastra TSC in colture RPM separate.
- Coperchi tubo conico strettamente sicuri e avvolgere in pellicola di paraffina o pellicola trasparente. Incubare ON a 37 gradi centigradi.
5. Estrazione del DNA
- Rimuovere le colture RPM ed esaminare i segni di crescita tra cui torbidità e fermentazione.
- Invertire delicatamente la coltura RPM per disperdere eventuali batteri depositati e aprire con attenzione. Trasferire 1 mL della coltura in un tubo di microcentrifuga.
- Centrifuga alla massima velocità (circa 15.000 x g) per 10 min a pellet batteri.
- Lavare il pellet con 1 mL di PBS sterile.
- In alcune circostanze, la gelatina non digerita si deposita sopra i batteri pelletti. Per rimuovere la gelatina, "fluff" dalla gelatina agitando delicatamente con PBS utilizzando una micropipetta. Questo "fluff-up" la gelatina lasciando il pellet batterico intatto.
- Rimuovere la miscela PBS-gelatina con aspirazione delicata. Sospendere nuovamente il restante pellet batterico con 1 mL di PBS fresco.
- Centrifugare il pellet batterico risospeso alla massima velocità per 10 min e aspirare con attenzione il supernatante.
- Eseguire immediatamente l'estrazione del DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA e un protocollo creato appositamente per l'estrazione del DNA dai batteri Gram-positivi (vedere la tabella dei materiali).
- Utilizzare il DNA estratto immediatamente o conservare a -20 gradi centigradi fino all'analisi PCR.
6. Rilevamento di c. perfringens tramite genotipizzazione PCR
- Per determinare se le colture sono positive per i tossinotipi Di C.perfringens, esaminare il DNA estratto per diversi geni di tossina tramite PCR.
NOTA: Poiché siamo più interessati alla tossina epsilon che produce ceppi di tipo B e D C. perfringens, valutiamo la presenza dei geni della tossina alfa, beta ed epsilon. I Primer sono elencati nella Tabella 2. I primer per il DNA ribosomico 16s sono usati come controllo di estrazione del DNA. Ulteriori primer possono essere utilizzati per testare i tossinotipi da A a G e possono essere trovati nella letteratura pubblicata2,12,13. - Utilizzare c. viola il DNA come controllo positivo. Questo controllo assicura che tutti i componenti delle reazioni PCR funzionino. Usiamo il DNA estratto da C. perfringens tipo B (ATCC 3626) come nostro controllo positivo. Coltivare ATCC 3636 ON in RPM a 37 gradi centigradi ed estrarre il DNA utilizzando gli stessi metodi descritti nei passaggi da 5.1 a 5,7. Conservare il DNA estratto a -20 gradi centigradi fino all'uso.
- Impostare le condizioni pcR come segue: 94,0 c per 3 min; 94,0 gradi centigradi per 30 s; 47,9 gradi centigradi per 30 s, 72,0 gradi centigradi per 1 min (ripetere i passaggi da 2 a 4 per 35 cicli); 72,0 gradi centigradi per 10 min.
- Per confermare i prodotti PCR, eseguire le reazioni PCR su un gel di agarose da 1,8 g/100 mL utilizzando tecniche standard. Le dimensioni previste per i prodotti PCR sono elencate nella tabella 2. I tipici risultati PCR vengono visualizzati nella Figura 3.
Representative Results
Utilizzando questo metodo, il 15-20% dei nostri alimenti campionati risulta positivo a C. perfringens. Mentre la maggior parte dei ceppi sono positivi per il tossinotipo A, abbiamo rilevato con successo sia il tipo B che il D nei campioni di alimenti. In un articolo pubblicato in precedenza abbiamo testato un totale di 216 campioni di cibo acquistati dai negozi al dettaglio di New York16 (Tabella 3). Questi campioni includevano vari campioni di carne (manzo, agnello, maiale e agnello), campioni di pollame (pollo e tacchino) e campioni di pesce (baccalà, salmone, crostacei, dentice, passera, calamari, tilapia, tonno e vari altri pesci). Sono stati testati anche campioni di prodotti e latticini. Su 216 campioni, 34 (16%) sono stati positivi per C. perfringens. Dei 34 campioni positivi perfringens, 31 campioni (91,2%) contiene la tossina alfa, un campione (2,9%) conteneva la tossina alfa, beta ed epsilon, e due campioni (5,9%) contenente la tossina alfa ed epsilon.
È interessante notare che abbiamo anche scoperto che C. perfringens era più prevalente come cellule vegetative rispetto alle spore. Venticinque campioni sono stati confrontati per la presenza di cellule o spore C. perfezionive. Le spore sono state selezionate per campioni di shock termico a 85 gradi centigradi per 15 min. Dei 25 campioni testati, il 16% era positivo per i ceppi di C. perfringens vegetativi contro il 4% per le spore. Ciò indica che può essere più conveniente testare solo per le cellule vegetative invece di entrambi.
Figura 1: Panoramica della procedura.
I campioni di cibo vengono macinati e diluiti in PBS sterili. La metà del campione di alimenti PBS viene inoculata in RPM per selezionarla per le cellule vegetative. Il restante campione di PBS-food è scioccato a 85 gradi centigradi per 15 minuti per selezionare le spore prima dell'inoculazione in RPM. Le colture vengono incubate ON a 37 gradi centigradi e poi placcate in agar TSC. L'agar TSC è incubato ON a 37 gradi centigradi e le colture nere che riducono il solfato sono sottocoltivate in nuovi RPM. Le colture RPM subcoltivate sono incubate su a 37 gradi centigradi e il DNA viene estratto per eseguire la genotipizzazione tramite PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schematica della tecnica di panino agar TSC.
I supporti RPM contenenti i batteri C. perfringens sono placcati tra due strati di agar TSC al fine di promuovere un ambiente anaerobico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati PCR selezionati.
Immagini di esempio dei risultati di genotipizzazione di C. perfringens from seven different types of food, e un controllo positivo di C. perfringens tipo B. Per approssimare le dimensioni dei risultati PCR in coppie di basi (bp) è stata utilizzata una scala di peso molecolare (prima corsia di ogni gel). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tossinotipo | alfa m inv f inv | Beta | Epsilon | Iota | Cpe | Rete | |
| dimostrare | un | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| sec | + | + | - | - | + | - | |
| d | + | - | + | - | + | - | |
| E (in questo modo | + | - | - | + | + | - | |
| Proposto | F | + | - | - | - | + | - |
| grammo | + | - | - | - | - | + | |
| - presente - non presente Può essere presente o meno |
|||||||
Tabella 1: Panoramica di C. perfringens genotipi. Un grafico delle combinazioni di tossine prodotte da ogni C. perfezioni tossinotipo.
| bersaglio | Coppie Primer | Prodotto PCR previsto (bp) |
| alfa m inv f inv | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
1300 DOLLARI |
Tabella 2: Primer e prodotti PCR previsti per determinati geni tossini. Primer utilizzati nel passaggio di genotipizzazione PCR.
| Tipo di cibo | Tipo A | Tipo B | Tipo C | Tipo D | C. perf | |||||||
| tossina alfa positiva | tossina alfa, beta ed epsilon positiva | tossina alfa e beta positiva | tossina alfa ed epsilon positiva | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| carne | manzo | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| agnello | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| maiale | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| misto | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| totale m parziale | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| pollame | pollo | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| Turchia | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| totale m parziale | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| pesce | merluzzo | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| misto | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| salmone | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| shelfish | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| Snapper | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| dibatte | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| calamaro | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| tonno | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Altro | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| totale m parziale | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| caseificio | mucca | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| capra | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| latte | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| totale m parziale | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| produrre | verdura | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| frutto | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| erba aromatica | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| totale m parziale | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| totale | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Tabella 3: Prevalenza di diversi C. perfezione tossinotipi di tossinotipi in 216 campioni di alimenti. Un esempio dei risultati ottenuti quando si utilizza questo metodo per testare il cibo al dettaglio per C. perfringens. Questa tabella è stata modificata dal manoscritto pubblicato in precedenza Regan et al.16.
Discussion
Qui descriviamo un metodo per identificare la prevalenza di C. perfringens nei campioni di alimenti al dettaglio con subcultura limitata e senza l'uso di un sistema di camere anaerobiche. Questo metodo utilizza una combinazione di tecniche per aumentare l'identificazione di C. perfringens da campioni di cibo. Utilizzando una versione modificata dei supporti RPM, permettiamo la crescita selettiva di C. perfringens. Inserendo l'RPM inoculato tra strati di agar TSC, siamo in grado di identificare e isolare i batteri anaerobici che riducono il solfato caratteristico di C. perfringens. Per confermare la presenza di C. perfringens, le colonie che riducono il solfato sono sub-coltivate in RPM freschi. La versione modificata o RPM ci permette di estrarre facilmente il DNA dalle colture, consentendo la conferma PCR di specifici geni tossini. La conferma di C. perfringens campioni di alimenti contaminati può essere raggiunto entro tre giorni.
Nei primi esperimenti, i campioni di cibo sono stati semplicemente inoculati in RPM e il DNA estratto dalle colture ON. Questo metodo ha portato al rilevamento di C. perfringens in un numero limitato di campioni (dati non mostrati). Anche se l'RPM è selettivo per la crescita di C. perfringens, non è esclusivo per la crescita di C. perfringens. Altri batteri resistenti al Gram-positive, D-cycolserine possono ancora crescere in RPM. Abbiamo ipotizzato che la contaminazione da altre specie batteriche possa aver diminuito la nostra rilevazione dei ceppi di C. perfringens diminuendo la sensibilità della nostra analisi PCR nella nostra prima coltura ON RPM. Un passo critico nell'aumentare il rilevamento di C. perfringens è stata l'inclusione della tecnica "sandwich" di agar TSC. Questo ci ha permesso di differenziare e selezionare per colonie anaerobiche che riducono il solfato, caratteristica di C. perfringens. Un passo chiave in questo processo è garantire che lo strato superiore di agar fuso TSC sia a 40 gradi centigradi. Anche se alcuni ceppi di C. perfringens possono crescere a temperature aumentate (46-48 gradi centigradi)15,16, l'aggiunta di agar fuso a temperature aumentate riduce notevolmente la quantità di colture recuperate, per lo più probabilmente a causa della morte cellulare .
Esistono diverse limitazioni potenziali a questo metodo. Come accennato in precedenza, né l'RPM né l'agar TSC selezionano o differenziano esclusivamente per C. perfringens, consentendo la crescita di altre specie batteriche presenti nei campioni di alimenti. Questo può ridurre la sensibilità del saggio da selezionare solo per C. perfrangens. Tuttavia, questa è una limitazione comune in quasi tutte le tecniche di coltura. La conferma di genotipizzazione degli isolati purificati è il metodo migliore per identificare definitivamente C. perfringens e altre specie batteriche. Un'altra limitazione di questo studio è che non testiamo gli isolati purificati. Abbiamo fatto questo intenzionalmente per limitare la quantità di subcultura, come subcolturing ripetuto si teme di provocare perdita di plasmide. Poiché non si isola alla purezza, è possibile che più C. perfringens tossinotypes possano essere presenti nello stesso campione o sottocultura. Se i ricercatori desiderano ottenere isolati purificati, i metodi di purificazione standard possono essere utilizzati sull'ultima coltura RPM descritta in questo metodo; questo richiede in genere l'uso di camere anaerobiche. Anche se originariamente usato per isolare C. perfringens dal cibo, questo metodo può essere utilizzato per identificare e isolare C. perfrangens da una moltitudine di fonti. In particolare, una di queste applicazioni di questo metodo è quella di testare campioni fecali provenienti da esseri umani (o animali) che sono sospettati di essere infettati da C. perfrangenti e tossinotipo dei batteri per comprendere meglio la fonte dell'infezione.
Disclosures
Nessuna divulgazione.
Acknowledgments
Questa ricerca non ha ricevuto alcun finanziamento specifico da parte del settore pubblico, commerciale o senza scopo di lucro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
