Summary
Syftet med detta protokoll är att detektera olika typer av Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt inköpta livsmedel, särskilt Epsilon-toxin som producerar stamtyper B och D, utan användning av anaeroba kammare.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) är en produktiv toxin producent och orsakar ett brett spektrum av sjukdomar i olika värdar. C. perfringens kategoriseras i fem olika toxinotypes, A till E, baserat på transporten av fyra stora toxin gener. Prevalensen och fördelningen av dessa olika toxinotyper är understuderas, särskilt deras genomträngande i amerikanska detaljhandeln livsmedel. Av särskilt intresse för oss är typ B och D stammar, som producerar Epsilon toxin, ett extremt dödligt toxin föreslog att vara miljö trigger av multipel skleros hos människor. För att utvärdera närvaron av olika C. perfringens toxinotypes i olika matprover, utvecklade vi en enkel metod för att selektivt odla dessa bakterier utan användning av en anaerob containersystem endast med tre odlings steg. Mat köps från lokala livsmedelsbutiker och transporteras till laboratoriet under omgivningsförhållanden. Proverna mals och inokuleras i modifierad snabb perfringens media (RPM) och inkuberas över natten vid 37 ° c i ett förseglat, lufttät koniskt rör. Över natten kulturer inokuleras på ett bottenskikt av solid Tryptose sulfite Cykloserin (TSC) agar, och sedan överlagras med ett toppskikt av smält TSC agar, skapa en "inklämt", anaerob miljö. Agar plattorna inkuberas över natten vid 37 ° c och utvärderas sedan för utseendet av svarta, sulfit-reducerande kolonier. C. perfringens-misstänkta kolonier avlägsnas från TSC-agar med hjälp av sterila ögondroppers, och INOKULERAS i rpm och sub-odlade över natten vid 37 ° c i ett lufttät koniskt rör. DNA utvinns ur subkulturen rpm, och sedan analyseras för närvaron av C. perfringens toxin gener via polymeras kedjereaktion (PCR). Beroende på vilken typ av livsmedel som provtas, är typiskt 15 – 20% av proverna positiva för C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) är en grampositiv, anaerob, sporbildande, stavformad bakterie som påträffas överallt i omgivningen. Denna art av bakterier bär gener som kodar för över 17 gifter och, historiskt, har karakteriserats i fem toxinotypes (A-E) baserat på närvaron av fyra olika toxin gener: alfa, beta, Epsilon, och IOTA toxin (tabell 1)1. Nyligen har det föreslagits att detta typnings system måste utvidgas till att omfatta typer F och G, som hyser C. perfringens av (CPE) och NetB toxin, respektive2. Emellertid, mer forskning behövs innan detta intrigning systemet formellt accepteras. Medan alfa-toxin genen är strikt kromosomalt belägna, CPE genen kan hittas både på kromosom och plasmider. I jämförelse, de återstående toxiner gener finns på olika olikt stora plasmider. Vi är särskilt intresserade av prevalensen av C. perfringens typer B och D eftersom dessa stammar producerar Epsilon toxin, en extremt potent, Porbildande toxin, som har föreslagits att spela en roll i att utlösa multipel SKLEROS (MS) hos människor3 ,4,5,6,7. Hur människor blir smittade eller koloniseras av dessa stammar är okänd. En möjlig förklaring är genom konsumtion av förorenade livsmedelsprodukter. För att besvara denna fråga försökte vi fastställa prevalensen av olika C. perfringens toxinotypes i amerikanska livsmedelprover.
Närvaron av C. perfringens toxinotypes i amerikanska livsmedelprover är understuderat och kräver ofta användning av anaerob containersystem och många sub-odling steg8,9,10,11 . Även om många sub-odling steg behövs för att få renade isolat, denna metod kan leda till förlust av plasmider över tiden12,13,14, möjligen påverkar upptäckten av plasmid-burna toxin gener inklusive Epsilon toxin genen. Vi försökte utveckla en enkel metod, med färre sub-odling steg, att selektivt kultur C. perfringens utan användning av anaeroba kammare, burkar, eller påsar. Kortfattat, matprover inokuleras i snabb perfringens media (RPM) över natten (på), sedan "inklämt" i TSC-agar och inkuberas på. Kolonier som misstänks vara C. perfringens är sedan sub-odlade i rpm och inkuberas igen. DNA extraheras och PCR utförs för att bestämma genotyp (figur 1). Vi valde att använda RPM eftersom det har visats sig öka återhämtningen av C. perfringens stammar från matprover jämfört med andra mer standardmedier15. Dessutom användes RPM framgångsrikt för att isolera ett Epsilon-toxin som producerar typ B-stam från en MS-patient4. Vi använder en modifierad version av RPM i stället för den ursprungliga versionen för att möjliggöra enkel DNA-extraktion. Även om denna metod möjliggör enkel identifiering av toxingener inom prover, är det möjligt att ett enskilt prov kommer att innehålla mer än en C. perfringens toxinotyp. Eftersom vår metod inte isolerar renade stammar med hjälp av flera omgångar av rening, identifiering av flera toxinotypes från ett prov är inte möjligt. Men standard reningsteknik (vanligtvis strimmor på TSC plattor eller blod agar plattor) kan tillämpas i slutet av vårt protokoll för att uppnå renade kulturer.
Protocol
Anmärkning: C. perfringens anses vara en organism för biosäkerhets risknivå 2 (BSL2). Även om inte alla matprover kommer att innehålla C. perfringens, bör alla odlade prover behandlas som sådana. Alla lämpliga försiktighetsåtgärder och personal skyddsutrustning (PPE) ska bäras hela tiden. Dekontaminera allt material före bortskaffandet.
1. Förbered modifierad rpm4,15
- Kombinera 30 g/L Fluid thioglycolate medium, 60 g/L gelatin, 5 g/L Peptone, 5 g/L glukos, 5 g/L kaliumfosfat dibasic, 3 g/L jästextrakt, 1,5 g/L natriumklorid, 0,5 g/L järnsulfat i avjoniserat vatten tills jämnt spridda. Vi gör vanligtvis 1 L batchar.
- Autoklav vid 121 ° c i 15 min.
- Låt svalna till ca 40 ° c.
- När RPM är svalt, tillsätt D-Cykloserin till en slutlig koncentration av 440 mg/L.
Notera: Lagerkoncentrationerna av D-Cykloserin upplöst i sterilt vatten vid 50 mg/mL kan förvaras vid-20 ° c för framtida bruk. - Överför aseptiskt 10 mL RPM till 15 mL koniska rör. RPM kan beredas i omgångar och förvaras vid 4 ° c i upp till en månad.
- Varmt varvtal till 37 ° c före användning.
2. provuppsamling och VARVTALS inkubation
- Transportera livsmedel till laboratoriet under omgivningstemperaturer inom 1 h. livsmedel får transporteras i originalförpackning eller sterila behållare. Om du inte testar omedelbart kan maten förvaras vid-20 ° c fram till användning. Anteckna typen av livsmedel och ursprungsland enligt förpackningsetiketten, om sådan finns, samt annan relevant information.
- Ta bort cirka 1,0 – 2,0 g mat och överför till steril petriskål eller motsvarande. Finhacka med ett sterilt rakblad eller skalpell.
- Inokulera i 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett 15 mL koniskt rör. Blanda väl.
- För att välja för vegetativa celler, överför 5 mL av PBS-matblandningen till ett 15 mL koniskt rör som innehåller 10 mL RPM. Fäst locket ordentligt.
- För att välja sporer, värm resterande 5 mL PBS-matblandning vid 85 ° c i 15 min och överför sedan till ett 15 mL koniskt rör innehållande 10 mL RPM. Fäst locket ordentligt.
- Vortex och Invertera mat-RPM kulturer för att säkerställa fullständig blandning.
- Tätt försegla de koniska rören och Linda lock med paraffin film eller plastfolie för att säkerställa en anaerob miljö.
- Inkubera över natten (på) vid 37 ° c.
- Följande morgon notera eventuell grumlighet eller jäsning i RPM-rör.
3. TSC "Sandwich" plätering
- Inokulera på RPM-kulturer i TSC-agar med hjälp av en "Sandwich"-teknik (figur 2) som beskrivs nedan.
- Förbered TSC-agar enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered basskiktet av TSC plattorna genom att överföra 10 mL av smält TSC agar till sterila petriskålar och låt stelna. Dessa kan förberedas i Avancerat och förvaras vid 4 ° c. Säkerställ att plattorna värms till rumstemperatur före användning.
- För det översta skiktet på TSC-plattan, Behåll de kvarvarande smält TSC-agar vid 40 ° c.
Observera: även om agar Smältpunkt ligger över 85 ° c, stelnar smält agar runt 32 – 45 ° c.
- Hämta försiktigt på RPM-kulturerna och överför 100 μL till TSC-agar basen. På grund av jäsning, vissa kulturer kan vara under tryck. Var noga med att bära all lämplig personlig skyddsutrustning.
- Fördela rpm inokulum med steriliserade glaspärlor eller cell spridaren.
- Låt RPM vara "absorberas" i TSC-agar i 5 – 10 minuter vid rumstemperatur.
- Överför försiktigt 20 mL smält, 40 ° c TSC-agar till plattan med hjälp av en serologisk pipett.
- Byt ut petriskål och låt TSC-agar helt stelna vid rumstemperatur.
- Vänd petriskål och inkubera vid 37 ° c på.
- Om seriella utspädningar önskas, utföra spädningar av på RPM kulturer i färskt, förvärmda RPM före inympning i TSC-agar.
4. subodling av sulfite-reducerande kolonier
- Följande morgon, ta bort plattorna från inkubator och undersöka för bakterietillväxt. Aeroba bakterier kan förekomma på agarytan. Anaeroba bakterier kommer att hittas växer inbäddade i agar. Sulfit-reducerande bakterier kommer att vända omgivande agar svart. Möjliga C. perfringens kolonier kommer att vara svarta och inbäddade i agar.
- C. perfringens misstänkta kolonier kommer att vara positiva för sulfit reduktion och kommer att visas svart, inbäddad i agar. Använd en steril pipettpipett, "plocka" de svarta kolonierna från agar och överför till 10 mL färskt RPM i ett 15 mL koniskt rör. Det är viktigt att luften från pipetten utvisas före piercing agar.
- Om det finns en tät mängd aerob bakterietillväxt på ytan av plattan, Använd en steril cell skrapa för att ta bort kolonier från utvalda områden. Multipla C. perfringens misstänkta kolonier kan samplas från samma TSC-platta till separata rpm-kulturer.
- Tätt säkra koniska rör lock och wrap i paraffin film eller plastfolie. Inkubera på 37 ° c.
5. DNA-extraktion
- Ta bort på RPM kulturer och undersöka för tecken på tillväxt inklusive grumlighet och jäsning.
- Försiktigt Invertera RPM kultur för att skingra alla kvittade bakterier och försiktigt öppna. Överför 1 mL av kulturen till ett microcentrifugerör.
- Centrifugera i toppfart (ca 15 000 x g) i 10 min till pellets bakterier.
- Tvätta pelleten med 1 mL steril PBS.
- I vissa fall, osmält gelatin kommer att bosätta sig ovanpå pelleterade bakterier. För att ta bort gelatin, "ludd" av gelatin genom att försiktigt agitera med PBS med en micropipett. Detta kommer att "fluff-up" gelatin samtidigt som den bakteriella pelleten intakt.
- Ta bort PBS-gelatin blandningen med mild aspiration. Återsuspendera den kvarvarande bakterie pelleten med 1 mL färsk PBS.
- Centrifugera den återsuspenderade bakteriella pelleten i toppfart i 10 minuter och aspirera försiktigt på supernatanten.
- Utför omedelbart DNA-extraktion med hjälp av en DNA-extraktionssats och ett protokoll specifikt skapat för extrahering av DNA från grampositiva bakterier (se tabellen med material).
- Använd omedelbart extraherat DNA eller förvara vid-20 ° c till PCR-analys.
6. detektion av C. perfringens via PCR-genotypning
- För att avgöra om kulturer är positiva för C. perfringens toxinotypes, undersöka extraherat DNA för olika toxin gener via PCR.
Obs: eftersom vi är mest intresserade av Epsilon toxin som producerar stammar typ B och D C. perfringens, vi utvärderar för närvaron av alfa, beta, och Epsilon toxin gener. Primers listas i tabell 2. Primers för 16s ribosomal DNA används som en DNA-extraktion kontroll. Ytterligare primrar kan användas för att testa toxinotyper A till G och finns i publicerad litteratur2,12,13. - Använd tidigare extraherade C. perfringens DNA som en positiv kontroll. Denna kontroll säkerställer att alla komponenter i PCR-reaktionerna fungerar. Vi använder DNA som utvinns från C. perfringens typ B (atcc 3626) som vår positiva kontroll. Odla ATCC 3636 på i RPM vid 37 ° c och extrahera DNA med samma metoder som beskrivs i steg 5.1 – 5.7. Förvara extraherat DNA vid-20 ° c fram till användning.
- Ange PCR-villkor enligt följande: 94,0 ° c i 3 min; 94,0 ° c för 30 s; 47,9 ° c för 30 s, 72,0 ° c i 1 min (Upprepa steg 2 – 4 för 35 cykler); 72,0 ° c i 10 min.
- För att bekräfta PCR-produkter, kör PCR-reaktioner på en 1,8 g/100 mL aguppkom gel med standardtekniker. Förväntade PCR-produktstorlekar listas i tabell 2. Typiska PCR-resultat visas i figur 3.
Representative Results
Med den här metoden testar 15 – 20% av våra prov livsmedel positiva för C. perfringens. Medan de flesta stammar är positiva för toxinotyp A, har vi lyckats upptäcka både typ B och D i matprover. I ett tidigare publicerat papper testade vi totalt 216 matprover köpta från New York-butiker16 (tabell 3). Dessa prover inkluderade olika köttprover (nötkött, lamm, fläsk och lamm), fjäderfä prov (kyckling och kalkon), och skaldjur prover (torsk, lax, skaldjur, snapper, skrubbskädda, bläckfisk, tilapia, tonfisk och diverse andra fiskar). Produkter och mejeri prov testades också. Av 216 prover, 34 (16%) var positiva för C. perfringens. Av de 34 C. perfringens positiva prover, 31 prover (91,2%) innehöll alfa-toxin, ett prov (2,9%) innehöll alfa-, beta-och Epsilon-toxin och två prover (5,9%) innehöll alfa-och Epsilon-toxin.
Intressant, upptäckte vi också att C. perfringens var vanligare som vegetativa celler jämfört med sporer. Tjugofem prover jämfördes för förekomst av vegetativa C. perfringens celler eller sporer. Sporer valdes för att värma chockerande prover vid 85 ° c i 15 min. Av de 25 testade proverna var 16% positiva för vegetativa C. perfringens stammar jämfört med 4% för sporer. Detta indikerar att det kan vara mer kostnadseffektivt att testa endast vegetativa celler i stället för båda.
Figur 1: översikt över förfarandet.
Matproverna mals och späds till steril PBS. Hälften av PBS-matprovet inokuleras i RPM för att välja för vegetativa celler. Resterande PBS-matprov är värme chockad vid 85 ° c i 15 min för att välja för sporer före inympning i RPM. Kulturer inkuberas på vid 37 ° c sedan pläteras i TSC agar. TSC-agar inkuberas på 37 ° c och svart, sulfit-reducerande kulturer är sub-odlade i färskt RPM. Sub-odlade RPM kulturer inkuberas på vid 37 ° c och DNA extraheras för att utföra genotypning via PCR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av TSC-agar Sandwich-teknik.
RPM-media som innehåller C. perfringens bakterier är pläterade mellan två skikt av TSC-agar för att främja en anaerob miljö. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: valda PCR-resultat.
Exempel bilder av genotypande resultaten av c. perfringens från sju olika typer av livsmedel, och en positiv kontroll av c. perfringens typ B. En molekyl vikts stege (första körfältet i varje gel) användes för att approximera storleken på PCR-resultaten i baspar (BP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Toxinotyp | Alpha | Beta | Epsilon | Dugg | Cpe | Licens | |
| Etablerade | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Föreslagna | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + present -inte närvarande +/-kan förekomma |
|||||||
Tabell 1: översikt av C. perfringens genotyper. Ett diagram över kombinationer av toxiner som produceras av varje C. perfringens toxinotyp.
| Mål | Primer par | Förväntad PCR-produkt (BP) |
| Alpha | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: KCT CTG ATA KATT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT KATT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT AGERA AAC |
655 |
| 16s RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
~ 1300 |
Tabell 2: primers och förväntade PCR-produkter för utvalda toxin gener. Primers som används i PCR-genotypsteget.
| Mat typ | Skriv ett | Typ B | Typ C | Typ D | C. perf + | |||||||
| Alfa-toxin positivt | Alfa, beta och Epsilon toxin positiva | alfa-och beta-toxin positiva | alfa och Epsilon toxin positiva | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| Kött | Nötkött | 38 | 8 | 21 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 9 | 24 |
| Lamm | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Fläsk | 15 | 2 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 13 | |
| Blandade | 1 | 1 | 100% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 100% | |
| Delsumma | 64 | 11 | 17 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 19 | |
| Fjäderfä | Kyckling | 19 | 5 | 26 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 26 |
| Turkiet | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsumma | 26 | 5 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 19 | |
| Skaldjur | Torsk | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Blandade | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Lax | 11 | 2 | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 18 | |
| shelfish | 32 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | |
| Snapper | 4 | 3 | 75% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 75% | |
| Flundra | 12 | 4 | 33% | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 33% | |
| Squid | 4 | 1 | 25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 10 | 4 | 19 | |
| Tonfisk | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Andra | 8 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 13 | |
| Delsumma | 100 | 14 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 | 16 | 16 | |
| Mejeri | Ko | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Get | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mjölk | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsumma | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Producera | Vegetabiliska | 12 | 1 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 8 |
| Frukt | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Ört | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Delsumma | 16 | 1 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 6 | |
| Totala | 216 | 31 | 14 | 1 | 0,50% | 0 | 0 | 2 | 0,90% | 34 | 16 | |
Tabell 3: prevalensen av olika C. perfringens toxinotypes i 216 matprover. Ett exempel på de resultat som erhålls vid användning av denna metod för att testa dagligvaruhandeln för C. perfringens. Denna tabell har modifierats från det tidigare publicerade manuskriptet Regan et al.16.
Discussion
Här beskriver vi en metod för att identifiera prevalensen av C. perfringens i detaljhandelsingredienser med begränsad subodling och utan användning av ett anaerob kammar system. Denna metod använder en kombination av tekniker för att öka identifieringen av C. perfringens från matprover. Genom att använda en modifierad version av RPM-Media tillåter vi en selektiv tillväxt av C. perfringens. Genom att sandwiching inokulerade RPM mellan lager av TSC-agar, kan vi identifiera och isolera anaeroba, sulfit-reducerande bakterier karakteristiska för C. perfringens. För att bekräfta närvaron av C. perfringens, sulfite-reducerande kolonier är sub-odlade i färskt RPM. Den modifierade versionen eller RPM gör det möjligt för oss att enkelt extrahera DNA från kulturer, vilket möjliggör PCR-bekräftelse av specifika toxgener. Bekräftelse av C. perfringens kontaminerade livsmedelprover kan uppnås inom tre dagar.
I tidiga experiment inokulerades matproverna helt enkelt i RPM och DNA som extraherades från kulturer. Denna metod resulterade i detektion av C. perfringens i ett begränsat antal prover (data ej visad). Även om RPM är selektiv för c. perfringens tillväxt, är det inte exklusivt för c. perfringens tillväxt. Andra, grampositiva, D-cycolserine resistenta bakterier kan fortfarande växa i RPM. Vi hypotesen att kontaminering av andra bakteriearter kan ha minskat vår detektion av C. perfringens stammar genom att minska känsligheten hos vår PCR-analys i vår första on rpm-kultur. Ett kritiskt steg i att öka detekteringen av C. perfringens var införandet av TSC-agar "Sandwich"-tekniken. Detta tillät oss att differentiera och välja för anaeroba, sulfit-reducerande kolonier, karakteristiska för C. perfringens. Ett avgörande steg i denna process är att säkerställa att det översta lagret av smält TSC-agar är vid 40 ° c. Även om vissa C. perfringens stammar kan växa vid förhöjda temperaturer (46 – 48 ° c)15,16, tillsats av smält agar vid förhöjda temperaturer minskar kraftigt mängden av kulturer återvinns, mest sannolikt på grund av celldöd .
Det finns flera potentiella begränsningar för denna metod. Som tidigare nämnts, varken RPM eller TSC-agar väljer eller differentierar för C. perfringens uteslutande, vilket möjliggör tillväxt av andra bakteriearter som finns i livsmedelsprov. Detta kan minska känsligheten hos analysen för att välja endast C. perfringens . Detta är dock en gemensam begränsning i nästan alla odlingstekniker. Genotypning bekräftelse av renade isolat är den bästa metoden för att slutgiltigt identifiera C. perfringens och andra bakteriearter. En annan begränsning av denna studie är att vi inte testar de renade isolaterna. Vi gjorde avsiktligt detta för att begränsa mängden subkultur, som upprepad subkultur befaras att resultera i plasmid förlust. Eftersom vi inte isolerar till renhet, är det möjligt att flera C. perfringens toxinotypes kan förekomma i samma prov eller subkultur. Om forskare vill erhålla renade isolat, kan standard reningsmetoder användas på den senaste RPM-kulturen som beskrivs i denna metod. Detta kräver vanligtvis användning av anaeroba kammare. Även om den ursprungligen användes för att isolera c. perfringens från livsmedel, kan denna metod användas för att identifiera och isolera c. perfringens från en mängd olika källor. Specifikt, en sådan tillämpning av denna metod är att testa fekal prover från människor (eller djur) som misstänks vara smittade med C. perfringens och toxinotype bakterierna att bättre förstå källan till infektionen.
Disclosures
Inga avslöjanden.
Acknowledgments
Denna forskning har inte fått någon särskild finansiering från offentliga, kommersiella eller icke-vinstdrivande sektorer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
