Summary
Bu protokolün amacı, anaerobik odacıklar kullanılmadan, özellikle b ve D gerinim tipleri üreten epsilon toksini olmak üzere, yerel olarak satın alınan gıdalarda farklı Clostridium perfringens toksinlerini tespit etmektir.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens)üretken bir toksin üreticisidir ve çeşitli konaklarda çok çeşitli hastalıklara neden olur. C. perfringens beş farklı toksin genleri taşıma dayalı beş farklı toksin tipleri, A ile E, ayrılır. Bu çeşitli toksinotiplerin yaygınlığı ve dağılımı, özellikle Amerikan perakende gıda yaygınlığı, az çalışılmıştır. Bizi özellikle ilgilendiren tip B ve D suşları, epsilon toksin üretmek, son derece ölümcül toksin insanlarda multipl skleroz çevresel tetikleyici olduğu öne sürüldü. Çeşitli gıda örneklerinde farklı C. perfringens toxinotypes varlığını değerlendirmek için, biz seçici sadece üç culturing adımları içeren bir anaerobik konteyner sistemi kullanmadan bu bakterileri kültür için kolay bir yöntem geliştirdi. Gıda yerel bakkallardan satın alınır ve ortam koşullarında laboratuvara taşınır. Numuneler modifiye hızlı perfringens ortama (RPM) doğrlanır ve bir gecede 37 °C'de kapalı, hava geçirmez konik bir tüpiçinde kuluçkaya yatırılır. Gece kültürleri katı Triptose Sülfit Cycloserine bir alt tabaka üzerine aşılanmış (TSC) agar, ve sonra erimiş TSC agar bir üst tabaka ile kaplanmış, bir "sandviç", anaerobik bir ortam yaratmak. Agar plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırılır ve daha sonra siyah, sülfit azaltıcı kolonilerin görünümü için değerlendirilir. C. perfringens-şüpheli koloniler steril göz damlalıkları kullanılarak TSC agar kaldırılır ve RPM içine aşılanmış ve hava geçirmez konik bir tüp içinde 37 °C'de bir gecede alt kültürlü. DNA RPM alt kültüründen çıkarılır ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla C. perfringens toksin genlerinin varlığı için analiz edilir. Örnekalınan gıdanın türüne bağlı olarak, numunelerin tipik olarak %15-20'si C. perfringensiçin pozitif test eder.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens)bir Gram pozitif, anaerobik, spor oluşturan, çevrede her yerde bulunan çubuk şeklinde bakteridir. Bu bakteri türü 17 toksinüzerinde kodlayan genler taşır ve tarihsel olarak, dört farklı toksin geninin varlığına dayanan beş toksin (A-E) olarak karakterize edilmiştir: alfa, beta, epsilon ve iota toksin (Tablo 1)1. Son zamanlarda, bu yazım düzeni C. perfringens enterotoksin (CPE) ve NetB toksin, sırasıyla2liman F ve G, türleri içerecek şekilde genişletilmesi gerektiği ileri sürülmüştür . Ancak, bu entrika sistemi resmen kabul edilmeden önce daha fazla araştırma gereklidir. Alfa toksin geni kesinlikle kromozomal olarak bulunurken, CPE geni hem kromozomda hem de plazmidlerde bulunabilir. Buna karşılık, kalan toksinlerin genleri çeşitli farklı boyutlu plazmidler bulunur. Bu suşlar insanlarda multipl sklerozun (MS) tetiklemede rol oynadığı öne sürülen son derece güçlü, gözenek oluşturan bir toksin olan epsilon toksini ürettiği için C. perfringens tip B ve D'nin yaygınlığı ile özellikle ilgileniyoruz3 ,4,5,6,7. İnsanların bu suşlar tarafından nasıl enfekte veya kolonize hale olduğu bilinmemektedir. Olası bir açıklama kontamine gıda ürünlerinin tüketimi ile. Bu soruyu yanıtlamaya yardımcı olmak için, Amerikan gıda örneklerinde farklı C. perfringens toxinotypes yaygınlığını belirlemek için çalıştı.
Amerikan gıda örneklerinde C. perfringens toxinotypes varlığı az çalışılmıştır ve genellikle anaerobik konteyner sistemleri ve çok sayıda alt culturing adımları8,9,10,11 kullanımını gerektirir . Saflaştırılmış izole elde etmek için çok sayıda alt culturing adım gerekli olmasına rağmen, Bu yöntem zamanla plazmid kaybına yol açabilir12,13,14, muhtemelen plazmid kaynaklı toksin genlerinin tespitini etkileyen epsilon toksin geni de dahil olmak üzere. Biz anaerobik odaları, kavanoz veya çanta kullanmadan seçici kültür C. perfringens için, daha az alt culturing adımları ile kolay bir yöntem geliştirmeye çalıştı. Kısaca, gıda örnekleri Rapid Perfringens Media (RPM) gecede (ON) içine aşılanır, sonra "sandviç" TSC agar içine ve ON inkübe. C. perfringens olduğundan şüphelenilen koloniler daha sonra RPM'ye alt kültürlenir ve tekrar ON'a kuluçkaya yatırılır. DNA çıkarılır ve genotipi belirlemek için PCR yapılır (Şekil 1). Biz diğer daha standart medya15ile karşılaştırıldığında gıda numuneleri C. perfringens suşların kurtarma artırmak için gösterilmiştir olarak RPM kullanmayı seçti. Buna ek olarak, RPM başarıyla bir MS hasta dan tip B suşu üreten bir epsilon toksin izole etmek için kullanılmıştır4. Kolay DNA çıkarma sağlamak için orijinal sürüm yerine RPM değiştirilmiş bir sürümünü kullanın. Bu yöntem, numuneler içinde toksin genlerinin kolayca tanımlanmasını sağlarken, tek bir numunenin birden fazla C. perfringens toxinotype içermesi mümkündür. Yöntemimiz birden fazla saflaştırma turunun kullanılmasıyla saflaştırılmış suşları izole etmediğinden, bir örnekten birden fazla toxinotipin tanımlanması mümkün değildir. Ancak, standart arıtma teknikleri (genellikle TSC plakaları veya kan agar plakaları üzerine streaking) saflaştırılmış kültürleri elde etmek için protokolümüzün sonunda uygulanabilir.
Protocol
NOT: C. perfringens bir biyogüvenlik tehlike düzeyi 2 (BSL2) organizma olarak kabul edilir. Tüm gıda örnekleri C. perfringensiçermese de, tüm kültürlü numuneler bu şekilde ele alınmalıdır. Tüm uygun önlemler ve personel koruyucu ekipman (PPE) her zaman giyilmelidir. Bertaraf edilmeden önce tüm malzemeyi dezenfekte edin.
1. Değiştirilmiş RPM4,15 hazırlayın
- 30 g/L sıvı tiyogliserin orta, 60 g/L jelatin, 5 g/L pepton, 5 g/L glukoz, 5 g/L potasyum fosfat dibasic, 3 g/L maya ekstresi, 1,5 g/L sodyum klorür, 0,5 g/L tuzlu suda eşit olarak dağılana kadar karıştırın. Biz genellikle 1 L toplu olun.
- 15 dk için 121 °C'de otoklav.
- Yaklaşık 40 °C'ye kadar soğumasını bekleyin.
- RPM soğuduktan sonra, 440 mg/L'lik son konsantrasyona D-sikloserin ekleyin.
NOT: Steril suda 50 mg/mL'de çözünmüş D-sikloserin stok konsantrasyonları ileride kullanılmak üzere -20 °C'de saklanabilir. - Aseptik olarak 10 mL RPM'yi 15 mL konik tüplere aktarın. RPM toplu olarak hazırlanabilir ve 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
- Kullanmadan önce 37 °C'ye kadar Sıcak RPM.
2. Örnek toplama ve RPM kuluçka
- 1 saat içinde ortam sıcaklığında laboratuvara gıda taşıma orijinal ambalaj veya steril kaplarda taşınabilir. Hemen test edilmezse, gıdalar kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir. Varsa, ambalaj etiketine ve diğer ilgili bilgilere göre gıda nın türüne ve menşe ülkesine dikkat edin.
- Yaklaşık 1,0-2,0 g gıda yıkın ve steril Petri kabına veya eşdeğerine aktarın. Steril bir jilet veya neşter ile ince kıyılmış.
- 15 mL konik tüpte 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içine inoküle. İyi bir şekilde karıştırın.
- Vektetif hücreler için seçim yapmak için, PBS-gıda karışımının 5 mL'sini 10 mL RPM içeren 15 mL konik tüpe aktarın. Kapağı sıkıca sabitle.
- Sporlar için seçmek için, kalan 5 mL PBS-gıda karışımını 85 °C'de 15 dakika ısıtın ve ardından 10 mL RPM içeren 15 mL konik tüpe aktarın. Kapağı sıkıca sabitle.
- Girdap ve gıda-RPM kültürleri tam karıştırma sağlamak için ters.
- Sıkıca konik tüpler mühür ve parafin film veya plastik şal ile kapaklar sarmak anaerobik bir ortam sağlamak için.
- Gece (ON) 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi sabah RPM tüpleri herhangi bir bulanıklık veya fermantasyon unutmayın.
3. TSC "sandviç" kaplama
- Aşağıda açıklanan "sandviç" tekniği(Şekil 2)kullanarak On RPM kültürlerini TSC agar'a aşılamak.
- Üreticinin talimatlarına göre TSC agar hazırlayın.
- 10 mL erimiş TSC agar'ı steril Petri kaplarına aktararak TSC plakalarının taban tabakasını hazırlayın ve katılaşmaya izin verin. Bunlar ileri derecede hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Plakaların kullanımdan önce oda sıcaklığına Kadar ısıtılmış olduğundan emin olun.
- TSC plakasının üst tabakası için kalan erimiş TSC agarını 40 °C'de muhafaza edin.
NOT: Agar'ın erime noktası 85 °C'nin üzerinde olmasına rağmen erimiş agar 32-45 °C civarında katılaşmaya neden olur.
- ON RPM kültürlerini dikkatlice alın ve 100 μL'yi TSC agar üssüne aktarın. Fermantasyon nedeniyle, bazı kültürler baskı altında olabilir. Tüm uygun PPE giymek emin olun.
- Steril cam boncukveya hücre yayılımı kullanarak RPM inoculum spread.
- RPM oda sıcaklığında 5-10 dakika için TSC agar içine "emilir" izin verin.
- Serolojik pipet kullanarak 20 mL erimiş, 40 °C TSC agar'ı plakaya dikkatlice aktarın.
- Petri kabının kapağını değiştirin ve TSC agar'ın oda sıcaklığında tamamen katılamasını bekleyin.
- Petri kabını ters çevirin ve 37 °C A.Ş.'de kuluçkaya yatırın.
- Seri seyreltmeler isteniyorsa, On RPM kültürlerinin seyreltmelerini TSC agar'a aşılamadan önce taze, önceden ısıtılmış RPM'ye dönüştürün.
4. Sülfit azaltıcı kolonilerin alt culturing
- Ertesi sabah, kuvözden plakaları çıkarın ve bakteri üremesi için inceleyin. Aerobik bakteriler agar yüzeyinde mevcut olabilir. Anaerobik bakteriler agar içinde gömülü büyüyen bulunacaktır. Sülfit azaltıcı bakteriler agar siyahçevreleyen dönecek. Olası C. perfringens kolonileri siyah ve agar gömülü olacaktır.
- C. perfringens şüpheli koloniler sülfit azaltma için pozitif olacak ve siyah görünecektir, agar içinde gömülü. Steril, tek kullanımlık bir göz damlası kullanarak, siyah kolonileri agardan "koparın" ve 15 mL konik tüpte 10 mL taze RPM'ye aktarın. Agar piercing önce göz damlası gelen hava dışarı atılması önemlidir.
- Plaka yüzeyinde aerobik bakteri büyüme yoğun miktarda varsa, seçilen alanlardan kolonileri kaldırmak için steril bir hücre kazıyıcı kullanın. Birden fazla C. perfringens şüpheli koloniler ayrı RPM kültürleri içine aynı TSC plaka örneklenebilir.
- Sıkıca güvenli konik tüp kapakları ve parafin film veya plastik şal sarın. 37 °C'de A.C.
5. DNA Çıkarma
- ON RPM kültürlerini çıkarın ve bulanıklık ve fermantasyon gibi büyüme belirtilerini inceleyin.
- Yavaşça herhangi bir yerleşmiş bakteri dağıtmak ve dikkatlice açık RPM kültürü ters. Kültürün 1 mL'sini mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- En yüksek hızda santrifüj (yaklaşık 15.000 x g) pelet bakterileriçin 10 dakika.
- 1 mL steril PBS ile pelet yıkayın.
- Bazı durumlarda, sindirilmemiş jelatin peletli bakterilerin üstüne yerleşecektir. Jelatinkaldırmak için, bir mikropipet kullanarak PBS ile hafifçe ajitasyon tarafından jelatin kapalı "kabartma". Bu bakteri pelet bozulmadan bırakarak jelatin "kabartmak" olacaktır.
- PBS-jelatin karışımını nazik aspirasyonla çıkarın. 1 mL taze PBS ile kalan bakteriyel peleti yeniden askıya alın.
- Santrifüj 10 dakika boyunca en yüksek hızda resuspended bakteriyel pelet ve dikkatle supernatant aspire.
- Hemen bir DNA çıkarma kiti ve gram-pozitif bakterilerden DNA çıkarma için özel olarak oluşturulan bir protokol kullanarak DNA çıkarma gerçekleştirmek (Malzemeler Tablosubakınız).
- Çıkarılan DNA'yı hemen kullanın veya PCR analizine kadar -20 °C'de saklayın.
6. PCR genotipleme yoluyla C. perfringens tespiti
- Kültürlerin C. perfringens toxinotypes için pozitif olup olmadığını belirlemek için, PCR ile farklı toksin genleri için çıkarılan DNA inceleyin.
NOT: Biz en çok epsilon toksin üreten suşları tip B ve D C. perfringensilgilendiğiiçin, alfa, beta ve epsilon toksin genlerinin varlığını değerlendirmek. Astarlar Tablo 2'delistelenmiştir. 16'lı ribozomal DNA için astarlar DNA çıkarma kontrolü olarak kullanılır. Ek astarlar g ile toksinotipler A için test etmek için kullanılabilir ve yayınlananliteratürdebulunabilir 2,12,13. - Pozitif kontrol olarak daha önce çıkarılan C. perfringens DNA kullanın. Bu denetim, PCR reaksiyonlarının tüm bileşenlerinin çalışmasını sağlar. Pozitif kontrol olarak C. perfringens tip B (ATCC 3626) den elde edilen DNA'yı kullanıyoruz. ATCC 3636 ON'u RPM'de 37 °C'de büyütün ve 5.1-5.7 adımlarında açıklanan yöntemlerle DNA ayıklayın. Çıkarılan DNA'yı kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- PCR koşullarını aşağıdaki şekilde ayarlayın: 3 dk için 94.0 °C; 30 s için 94.0 °C; 30 s için 47.9 °C, 1 dk için 72.0 °C (35 döngü için 2-4 adımları tekrarlayın); 10 dk için 72.0 °C.
- PCR ürünlerini onaylamak için, standart teknikler kullanarak 1.8 g/100 mL agarose jel üzerinde PCR reaksiyonları çalıştırın. Beklenen PCR ürün boyutları Tablo 2'delistelenmiştir. Tipik PCR sonuçları Şekil 3'tegörüntülenir.
Representative Results
Bu yöntemi kullanarak, örneklenmiş gıdalarımızın %15-20'si C. perfringenspozitif tir. Çoğu suş toksinotip A pozitif olmakla birlikte, gıda örneklerinde hem Tip B hem de D'yi başarıyla tespit ettik. Daha önce yayınlanmış bir makalede, New York perakende mağazalarından satın alınan toplam 216 gıda numunesini test ettik16 (Tablo 3). Bu örnekler arasında çeşitli et örnekleri (sığır eti, kuzu, domuz eti ve kuzu eti), kümes hayvanları örnekleri (tavuk ve hindi) ve deniz ürünleri örnekleri (morina, somon, kabuklu deniz ürünleri, snapper, pisi balığı, kalamar, tilapia, ton balığı ve diğer çeşitli balıklar) yer aldı. Ürün ve süt ürünleri de test edildi. 216 örnekte 34 (%16) C. perfringensiçin pozitif ti. 34 C. pozitif numunelerin 31'i (%91,2) alfa toksin, bir örnek (%2.9) içerdiği alfa, beta ve epsilon toksini ve iki örnek (%5.9) içeriyordu. alfa ve epsilon toksiniçeriyordu.
İlginçtir ki, C. perfringens'in bitkisel hücreler olarak sporlara göre daha yaygın olduğunu keşfettik. Vegetatif C. perfringens hücrelerinin veya sporlarının varlığı için 25 örnek karşılaştırıldı. Sporlar 85 °C'de 15 dakika boyunca ısı şok edici numuneler ile seçilmiştir. Test edilen 25 numunenin %16'sı bitkisel C. perfringens suşları, %4'ü ise sporlar için pozitifti. Bu, her ikisi yerine sadece vegetatif hücreler için test etmek için daha uygun maliyetli olabileceğini gösterir.
Şekil 1: Prosedüre genel bakış.
Gıda örnekleri kıyma ve steril PBS içine seyreltilir. PBS-gıda örneğinin yarısı vegetatif hücreler için seçmek için RPM'ye aşılanır. Geri kalan PBS-gıda numunesi, RPM'de aşılamadan önce sporlar için seçilmek üzere 85 °C'de 15 dakika boyunca şokedilmiştir. Kültürler 37 °C'de A.C.'de kuluçkaya yatırılır ve TSC agar'a kaplanır. TSC agar 37 °C'de onda kuluçkaya yatırılır ve siyah, sülfit azaltıcı kültürler taze RPM'ye alt kültürlüdür. Alt kültürlü RPM kültürleri 37 °C'de A.Kupürlenir ve PCR ile genotipleme yapmak için DNA çıkarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TSC agar sandviç tekniği şeması.
C. perfringens bakteri içeren RPM medya anaerobik bir ortam teşvik etmek için TSC agar iki tabaka arasında plakalı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Seçilen PCR sonuçları.
C. perfringens'in yedi farklı gıda türünden elde edilen genotipleme sonuçlarının örnek görüntüleri ve C. perfringens tip B'nin pozitif kontrolü. Baz çiftleri (bp) PCR sonuçlarının boyutunu yaklaşık olarak belirlemek için bir molekül ağırlık merdiveni (her jelin ilk şeridi) kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Toxinotype | Alfa | Beta | Epsilon | ıota | Cpe | NetB | |
| Kurulan | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Yanıt | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + mevcut - mevcut değil +/- mevcut olabilir veya olmayabilir |
|||||||
Tablo 1: C. perfringens genotiplerine genel bakış. Her C. perfringens toxinotype tarafından üretilen toksinlerin kombinasyonları bir grafik.
| Hedef | Astar Çiftleri | Beklenen PCR Ürünü (bp) |
| Alfa | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
~1300 |
Tablo 2: Seçilen toksin genleri için astarlar ve beklenen PCR ürünleri. PCR genotipleme adımında kullanılan astarlar.
| Gıda Türü | A Tipi | B Tipi | C Tipi | D Tipi | C. perf + | |||||||
| alfa toksin pozitif | alfa, beta ve epsilon toksin pozitif | alfa ve beta toksin pozitif | alfa ve epsilon toksin pozitif | |||||||||
| n | n | % | n | % | n | % | n | % | n | % | ||
| Et | Sığır | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| Kuzu | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Domuz | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| Karışık | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| Alt toplam | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| Tavuk | Tavuk | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| Türkiye | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Alt toplam | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| Deniz ürünleri | Cod | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| Karışık | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Somon | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| rafish | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| Balığı | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| Flounder | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| Kalamar | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| Ton balığı | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Diğer | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| Alt toplam | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| Süt | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Keçi | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Süt | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Alt toplam | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Üretmek | Sebze | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| Meyve | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Bitki | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Alt toplam | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| Toplam | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Tablo 3: 216 gıda örneğinde farklı C. perfringens toxinotypes prevalansı. C. perfringensiçin perakende gıda test etmek için bu yöntemi kullanırken elde edilen sonuçlara bir örnek . Bu tablo daha önce yayınlanmış el yazması Regan ve ark.16değiştirilmiştir.
Discussion
Burada, sınırlı subculturing ve anaerobik oda sistemi kullanmadan perakende gıda örneklerinde C. perfringens yaygınlığını belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, gıda numunelerinden C. perfringens belirlenmesini artırmak için tekniklerin bir kombinasyonunu kullanır. RPM ortamının değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak, C. perfringensseçici büyüme için izin verir. TSC agar katmanları arasında aşılanmış RPM sandviç olarak, tespit etmek ve C. perfringensanaerobik, sülfit azaltıcı bakteri karakteristik izole edebiliyoruz. C. perfringensvarlığını onaylamak için, sülfit azaltıcı koloniler taze RPM içine alt kültürlü. Modifiye edilmiş sürüm veya RPM, belirli toksin genlerinin PCR teyidini sağlayarak kültürlerden kolayca DNA çıkarmamızı sağlar. C. perfringens kontamine gıda örnekleri onayı üç gün içinde elde edilebilir.
İlk deneylerde, gıda örnekleri sadece RPM ve DNA ON kültürleri çıkarılan içine aşılanmış edildi. Bu yöntem, sınırlı sayıda örnekte (veriler gösterilmez) C. perfringens'in algılanmasıyla sonuçlandı. RPM C. perfringens büyüme için seçici olmasına rağmen, C. perfringens büyüme için özel değildir. Diğer, gram-pozitif, D-cycolserine dirençli bakteriler hala RPM büyüyebilir. Diğer bakteri türlerinin kontaminasyonunun, ilk ON RPM kültürümüzde PCR analizimizin hassasiyetini azaltarak C. perfringens suşlarının tespitini azaltmış olabileceğini varsaverdik. C. perfringens tespitini artırmada kritik bir adım TSC agar "sandviç" tekniğinin dahil edilmesioldu. Bu bize ayırt etmek ve anaerobik, sülfit azaltıcı koloniler, C. perfringens karakteristik seçmek için izin verdi. Bu süreçte önemli bir adım erimiş TSC agar üst tabakası 40 ° C olmasını sağlamaktır. Bazı C. perfringens suşları artan sıcaklıklarda büyüyebilir rağmen (46-48 °C)15,16, artan sıcaklıklarda erimiş agar eklenmesi büyük ölçüde kurtarılan kültürlerin miktarını azaltır, büyük olasılıkla hücre ölümü nedeniyle .
Bu yöntemiçin çeşitli olası sınırlamalar vardır. Daha önce de belirtildiği gibi, ne RPM ne de TSC agar seçer veya C. perfringens için sadece farklılaştırır, gıda örneklerinde mevcut diğer bakteri türlerinin büyümesine izin. Bu, yalnızca C. perfringens için seçmek için tsay duyarlılığını azaltabilir. Ancak, bu hemen hemen tüm kültür teknikleri ortak bir sınırlamadır. Saflaştırılmış izole lerin genotipleme onayı C. perfringens ve diğer bakteri türlerini kesin olarak tanımlamak için en iyi yöntemdir. Bu çalışmanın bir diğer sınırlaması da saflaştırılmış izolasyonları test etmememizdir. Bunu, plazmid kaybına neden olacak şekilde tekrarlanan subküle atma lardan korktuğu için, subküle etme miktarını sınırlamak için kasıtlı olarak yaptık. Saflığı izole etmediğimiz için, aynı örnek veya alt kültürde birden fazla C. perfringens toxinotypes'un bulunması mümkündür. Araştırmacılar saflaştırılmış izole elde etmek istiyorsanız, standart arıtma yöntemleri bu yöntemde açıklanan son RPM kültürü üzerinde kullanılabilir; bu genellikle anaerobik odaların kullanımını gerektirir. Başlangıçta C. perfringens gıda izole etmek için kullanılan rağmen, bu yöntem tanımlamak ve c. perfringens çok sayıda kaynaktan izole etmek için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntemin bu tür bir uygulama daha iyi enfeksiyon kaynağını anlamak için C. perfringens ile enfekte olduğundan şüphelenilen insanlar (veya hayvanlar) dışkı örnekleri test etmek ve toxinotype bakteri.
Disclosures
Açıklama yok.
Acknowledgments
Bu araştırma kamu, ticari veya kar için olmayan sektörlerden herhangi bir özel fon almadı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
