Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59933

Summary

في هذا الإجراء، يتم تعطيل الرباط الظهاري القائم على DsRed لإنتاج راتنج تقارب انتقائي للغاية لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة من مستخلصات النباتات الخام أو اللاتابات ثقافة الخلية، كبديل للبروتين A.

Abstract

عادة ما يتم تحقيق تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) من خلال البروتين A الكروماتوغرافيا تقارب، والتي يمكن أن تمثل ما يصل إلى 25٪ من تكاليف العملية الإجمالية. وبالتالي، فإن خطوات الالتقاط البديلة والفعالة من حيث التكلفة ذات قيمة بالنسبة للصناعة التحويلية على نطاق صناعي، حيث يتم إنتاج كميات كبيرة من الكمية الواحدة من الكمية. هنا نقدم طريقة لشل حركة النعت الظهاري ة المستندة إلى DsRed إلى راتنج أجاروز مرتبط ة عبر يسمح بالتقاط انتقائي للجسم المضاد 2F5 الذي يبطل مفعول فيروس نقص المناعة البشرية من مستخلصات النباتات الخام دون استخدام البروتين A. تم دمج ELDKWA الظهارة الخطية لأول مرة وراثيا إلى البروتين الفلورسنت DsRed وتم التعبير عن البروتين الانصهار في التبغ المعدلوراثيا(Nicotiana tabacum) النباتات قبل تنقية عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية أيونتقارب المعطلة. وعلاوة على ذلك، تم تحسين طريقة تقوم على الأجاروز المتصلة بتنشيط لكثافة الأربطة العالية، واقتران فعال وتكلفة منخفضة. وكانت درجة الحموضة وتكوين المخزن المؤقت وتركيز الرباط القابل للذوبان أهم المعلمات خلال إجراء الاقتران، الذي تم تحسينه باستخدام نهج تصميم التجارب. وقد تم اختبار الراتنج تقارب الناتجة عن قدرتها على ربط انتقائي mAb الهدف في استخراج مصنع الخام وتم تحسين العازلة elution لاسترداد mAb عالية، نشاط المنتج والاستقرار الراتنج تقارب. ويمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع الأجسام المضادة الأخرى مع epitopes الخطية. الراتنجات الجديدة تسمح ظروف الإلتواء ألطف من البروتين A ويمكن أيضا أن تقلل من تكاليف خطوة التقاط الأولي لإنتاج mAb.

Introduction

المنتجات الصيدلانية الحيوية مهمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض في كل فرع تقريبا من فروع الطب1. الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) تهيمن على سوق الأدوية الحيوية، مع المبيعات في جميع أنحاء العالم من المتوقع أن تصل إلى ما يقرب من 110 مليار يورو في عام 20202. منصة التعبير المفضلة لmAbs هي خطوط الخلايا المبيض الهامستر الصينية، والتي تنتج عادة titers mAb عالية تصل إلى 10 g∙L-1 في ثقافة supernatant3،4. ومع ذلك، فإن إنتاج mAbs في الثقافات الخلايا الثدييات مكلفة بسبب ارتفاع تكلفةالمتوسطة والحاجة إلى التخمير المعقمة 5. منصات التعبير البديلة مثل النباتات يحتمل أن تقدم نهجا أسرع وأبسط وأقل تكلفة وأكثر قابلية للتطوير للتصنيع الصناعي7.

بالإضافة إلى التكاليف المرتبطة بثقافات الخلايا الثدييات، والاستخدام الواسع النطاق للبروتين A الكروماتوغرافيا تقارب لالتقاط المنتج هو محرك تكلفة رئيسية للإنتاج الصناعي من mAbs. البروتين A موجود بشكل طبيعي على سطح الخلايا المكورات العنقودية وربطت بجزء من التبلور (Fc) المنطقة من بعض المورين والأجسام المضادة البشرية، وبالتالي بمثابة آلية دفاعية للتهرب من الجهاز المناعي الفكاهي8. البروتين A أصبح معيار الذهب الصناعة لالتقاط mAbs من supernatants ثقافة الخلية ويستخدم أيضا على نطاق واسع من قبل مجتمع البحوث لأنه انتقائي للغاية، وعادة ما تحقق نقاء mAb من ~ 95٪ في خطوة واحدة8. ومن غير المستغرب أن مبيعات البروتين A على مدى العقدين الماضيين قد عكست بشكل وثيق مبيعات mAbs8. اعتمادا على مقياس الإنتاج، وتكاليف البروتين A يمكن أن تتوافق مع أكثر من 25٪ من إجمالي تكاليف العملية وبالتالي تؤثر على سعر السوق من mAbs العلاجية، والتي يمكن أن تصل إلى 2000 غرام-19. ولذلك، فإن راتنجات الكروماتوغرافيا البديلة مع أداء تنقية مماثل لديها القدرة على خفض تكاليف الإنتاج إلى حد كبير، مما يجعل العلاجات المستندة إلى الأجسام المضادة في متناول عدد أكبر من المرضى10،11 ،12. هذه البدائل قد تتحايل أيضا على مساوئ البروتين A اللونية، بما في ذلك ظروف الإلتواء القاسية عند درجة الحموضة المنخفضة (عادة <3.5) التي يمكن أن تسبب mAbs للخضوع لتغيرات مطابقة تعزز التجميع13 . الأهم من ذلك، البروتين A هو انتقائي فقط لمنطقة Fc من بعض الفئات الفرعية IgG، لذلك الجزيئات غير وظيفية مع نطاقات ملزمة مقتطعة قد تشارك في تنقية مع المنتج سليمةفي حين أن مشتقات mAb مثل شظايا متغير سلسلة واحدة لا تربط البروتين A على الإطلاق.

هنا، ونحن نصف الراتنج الكروماتوغرافيا تقارب بديل لالتقاط mAb 2F5 تحييد فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الكتابة الخطية ELDKWA (حرف واحد رمز الأحماض الأمينية)5،14. نحن وراثيا تنصهر الظهارة 2F5 إلى C-محطة من البروتين الفلورسنت DsRed، الذي كان يعمل كناقل وجزيء مراسل، وأنتجت البروتين الناتج DsRed-2F5-Epitope (DFE) في التبغ المعدل وراثيا ( نيكوتيانا تاباكوم) النباتات. تم تنقية DFE من قبل خطوة واحدة شلت المعادن أيون تقارب اللونية (IMAC). تم تحقيق تجميد الرباط التقارب DFE النقي على راتنج أجاروز عبر مرتبطة عن طريق اقتران الكيميائية باستخدام N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS) تنشيط عبر الأعمدة agarose. ثم استخدمت التصاميم التجريبية الإحصائية لتحسين إجراء التعطيل واقتران الكفاءة15. تم تقييم استراتيجية تنقية mAb 2F5 من حيث نقاء الأجسام المضادة، والغلة والاستقرار في الأربطة. على النقيض من البروتين A، الذي يربط منطقة Fc، DFE ملزمة منطقة تحديد التكامل من 2F5، وضمان تنقية الجزيئات مع paratope سليمة. مفهومنا يمكن بسهولة تكييفها مع أي mAb مع epitope خطي أو غيرها من الأربطة التقارب القائم على الببتيد التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل الدراسات microarray16.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تدفق العمليات لإعداد راتنجات تقارب الظهارة التي يمكن استخدامها لالتقاط mAbs من مستخلصات النباتات الخام أو المنائج ثقافة الخلية. (أ) تم التعبير عن تقارب الرباط DFE في مصانع التبغ المعدلة وراثيا. تم تضمين خطوة هطول الأمطار الحرارية (B) قبل أن يتم تجانس الأوراق المقطوعة (C). (D) تم توضيح استخراج النبات الخام عن طريق الترشيح كيس، والترشيح عمق و0.2 م الترشيح المعقمة. (E) ثم تم تنقية DFE من قبل IMAC. (واو،ز) تم تعطيل ربط تقارب DFE المنقى على أعمدة أغاروز المرتبطة بـ EDC/NHS. (H) استخدمت الثقافات البكتيرية التي تحمل T-DNA ترميز الأجسام المضادة 2F5 للتعبير العابر في النباتات N. بنتهامايانا (I) نمت في phytotron. (ي) تم حصاد أوراق ن. بنتامايانا ومعالجتها كما هو موضح في D. (K) تم تنقية mAb 2F5 من استخراج أوضح باستخدام أعمدة تقارب DFE(L). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. زراعة نباتات التبغ المعدلة وراثيا

ملاحظة: يتم وصف تصميم بروتين الانصهار DFE وتوليد النباتات المعدلة وراثيا في مكان آخر5،17.

  1. إنبات شتلات التبغ المعدلة وراثيا في التربة. ري النباتات مع 1.0 غرام · L-1 حل الأسمدة. نقل النباتات إلى واحد، 100 مم × 100 مم × 60 مم (الطول والعرض والارتفاع) الأواني عندما تنمو إلى قطر ~ 0.04 م.
  2. زراعة نباتات التبغ المعدلة وراثيا في الدفيئة مع فترة ضوئية 16 ساعة (25/22 درجة مئوية ضوء / نظام درجة الحرارة المظلمة)، مع الرطوبة النسبية 70٪ والإخصاب الآلي مع 1.0 غرام · L-1 حل الأسمدة لمدة 15 دقيقة كل ساعة.
  3. بعد 7 أسابيع، حصاد جميع الأوراق باستثناء أوراق cotyledon الأربعة في قاعدة الجذعية النباتية. قم بمعالجة الأوراق المقطوعة على الفور على النحو الموضح أدناه.

2. هطول الأمطار الحرارة من بروتينات الخلية المضيفة

  1. إعداد حمام مائي مع حجم العمل 20 L في وعاء ساخنة الفولاذ المقاوم للصدأ (0.3 م × 0.3 م × 0.3 م). في البداية، وضع مضخة مغناطيسية في حمام المياه لإثارة السائل بشكل دائم مع تدفق 5 L دقيقة-1. قم بتركيب ترموستات قابل للتعديل على حمام الماء للتحكم في درجة الحرارة (الخطوتان 2.4 و2.8).
    تحذير: جميع الخطوات التالية تصل إلى 2.10 تنطوي على التعامل مع السائل الساخن. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك قفازات معزولة حراريا ونظارات واقية.
  2. أضف 15 لترًا من الماء منزوع الأيونات إلى حمام الماء وسخن السائل إلى 70 درجة مئوية.
  3. ضع دلو 10 لتر مملوء بـ 5 لتر من الماء منزوع الأيونات على النمام المغناطيسي. إضافة فوسفات الصوديوم إلى تركيز نهائي من 120 MM. ضبط الحموضة إلى 8.14 باستخدام 10 M حمض الهيدروكلوريك. عندما تذوب جميع المكونات، أضف المخزن المؤقت المركز الناتج (5 لتر) إلى حمام الماء من الخطوة 2.2.
  4. تحريك حمام الماء حتى تصل درجة الحرارة إلى 70 درجة مئوية. استخدام حمض الهيدروكلوريك 10 M لضبط الحموضة إلى 8.14 إذا لزم الأمر. مواصلة التحريض لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ودرجة الحموضة لضمان أن التجمع بأكمله في التوازن الحراري.
  5. إعداد دلو 20 لتر (0.3 م × 0.3 م × 0.3 م) مليئة بالماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة ~ 17 درجة مئوية (مطلوب للخطوة 2.9).
  6. إعداد 400 غرام aliquots من أوراق التبغ المقطوع من الخطوة 1.3. ضع aliquot واحد في سلة مثقبة (0.2 م × 0.2 م × 0.2 م؛ عرض المسام على الأقل 0.02 م × 0.02 م). تجنب ملء السلة بالمواد النباتية أو تعبئة الأوراق بإحكام شديد لتجنب إتلاف الأنسجة.
  7. غمر السلة بالكامل في المخزن المؤقت الساخن من الخطوة 2.4 وتأكد من أن جميع الأوراق تبقى تحت السطح السائل. استخدام ملعقة سيليكون ثيرمتا إلى عقد الأوراق تحت السطح إذا لزم الأمر.
  8. حضانة أوراق التبغ لمدة 1.5 دقيقة في السائل الغسل في حين أن المضخة لا تزال تثير السائل. مراقبة درجة حرارة السائل خلال فترة الحضانة بأكملها. تجنب سد مدخل المضخة مع أوراق التبغ.
  9. إزالة سلة أوراق التبغ من المخزن المؤقت واستنزاف العازلة المتبقية من الأوراق لمدة 30 ق. نقل السلة إلى دلو مليئة بالماء البارد (من الخطوة 2.5) وتزج الأوراق لمدة 30 ق. إزالة سلة واستنزاف المياه المتبقية من le aves لمدة 30 ق قبل التجانس (الخطوة 3).
  10. كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.9 مع aliquots الطازجة من 2.6 حتى تتم معالجة الكتلة الحيوية المقطوعة بالكامل. مراقبة باستمرار وضبط درجة الحموضة ودرجة حرارة العازلة ابيضاض في حمام المياه.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد النباتية المقشرة على الجليد لمدة تصل إلى 30 دقيقة عندما تكون هناك حاجة إلى عدة دورات ابيضاض لمعالجة الكتلة الحيوية بأكملها. كما يمكن تخزين الأوراق المقشرة في أكياس مختومة بالفراغ عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع على الأقل. ومع ذلك، يوصى بالمعالجة الفورية لأن التخزين المطول يمكن أن يقلل من عائد DFE.

3. استخراج البروتين وتوضيحه

تحذير: تتضمن الخطوات التالية خلاط مع شفرات دوارة. لا تعمل في وعاء الخلاط عند تشغيل أو تركيبها على وحدة المحرك.

  1. وضع 150 غرام (كتلة الرطب) من أوراق التبغ المقشرة (الخطوة 2.9) في وعاء خلاط وإضافة 450 مل من العازلة استخراج (50 مل فوسفات الصوديوم، 500 مل كلوريد الصوديوم، 10 مل ديسولفيت الصوديوم، درجة الحموضة 7.5). أغلق غطاء الخلاط بإحكام لمنع تسرب المواد النباتية أو المخزن المؤقت.
  2. تجانس الأوراق لمدة 3X لمدة 30 ثانية، مع فواصل 30 ثانية بين كل نبضة. تأكد من أن جميع الأوراق متجانسة وأن لا أحد التمسك الجزء العلوي من وعاء خلاط. إذا لزم الأمر، فتح الخلاط خلال فواصل ودفع أسفل الأوراق التي عصا في الجزء العلوي من السفينة، وذلك باستخدام ملعقة سيليكون نظيفة.
  3. بعد التجانس، خذ عينة 1.0 مل من التجانس للتحليل اللاحق (الخطوة 7).
  4. جمع التجانس في وعاء من حجم كاف (على سبيل المثال إذا كان العمل مع الكتلة الحيوية الإجمالية من 1.0 كجم، واستخدام سفينة بسعة لا تقل عن 5 لتر). كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.3 حتى يتم تجانس كافة الكتلة الحيوية المقشرة.
  5. قم بتركيب فلتر كيس في حامل فلتر ووضع وعاء آخر بحجم مناسب (انظر 3.4) أسفل التجميع. تطبيق التجانس على مرشح كيس بمعدل ~ 0.15 L دقيقة-1. أخذ عينات من filtrate كيس بعد كل لتر للتحليل اللاحقة (الخطوة 7) وقياس عكر تجمع filtrate حقيبة كما تخفيف 1:10 في العازلة استخراج باستخدام مقياس العكر أو جهاز مماثل.
  6. مزيد من التوضيح تجمع filtrate حقيبة باستخدام 0.02 م2 من K700 (أعلى) وKS50 (أسفل) عمق مرشح طبقة الجمع لكل لتر من تجمع كيس filtrate. تطبيق معدل تدفق من 3.0 لتر دقيقة-1·m-2 تصل إلى أقصى ضغط من 0.2 MPa. ثم إزالة الجسيمات المتبقية عن طريق تمرير filtrate أوضح من خلال مرشح معقمة 0.2 م كما هو موضح سابقا5.

4. تنقية من DFE التقارب Ligand

  1. إعداد نظام الكروماتوغرافيا السائل ة البروتين السريع عن طريق التنظيف مع عازلة الإلوتيون (10 مل فوسفات الصوديوم، 300 مليون متر إيميدازول، PH 7.4)، العازلة غسل (10 مليون متر فوسفات الصوديوم، والحموضة 7.4) والعازلة الاعتدال (20 مليون متر فوسفات الصوديوم، 500 مل كلوريد الصوديوم، PH 7.4). جبل عمود يحتوي على ~ 50 مل من الراتنج الأجاروز عبر المرتبطة مخلب لكل كيلوغرام من الكتلة الحيوية ورقة (~ 2.5 لتر عمق filtrate).
  2. شحن العمود مع أيونات النيكل عن طريق تطبيق 5 أحجام العمود (السيرة الذاتية) من 200 مل محلول كبريتات النيكل وغسله مع 5 السيرة الذاتية من العازلة elution. استخدام معدل تدفق من 50 سم ح-1 ورصد إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 260، 280 و 558 نانومتر لجميع الخطوات الكروماتوغرافيا اللاحقة.
  3. معادلة العمود مع 10 السيرة الذاتية للمخزن المؤقت للتوازن. ثم تحميل 50 السيرة الذاتية من استخراج النبات أوضح (من الخطوة 3.6) على العمود مشروط.
  4. اغسل العمود بـ 10 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للغسيل. Elute البروتين الانصهار DFE مع 5 السيرة الذاتية elution العازلة وجمع الكسر التي تحتوي على المنتج مرة واحدة في إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر و 558 نانومتر قد زادت إلى أكثر من 5 مليون أودو فوق خط الأساس.
  5. أخذ عينة قدرها 0.2 مل من كسر الإلوتيون من أجل قياس تركيز البروتين القابل للذوبان الكلي (ملعقة صغيرة) (الخطوة 7.1)، تركيز DFE (الخطوتين 7.2 و7.3)، ونقاء DFE (الخطوة 7.4).
  6. قم بتركيب عمود يحتوي على حوالي 50 مل من راتنج الديإكسترون المرتبط عبر الموجات فوق نظام كروماتوغرافيا. معادلة العمود مع 5 السيرة الذاتية من اقتران العازلة (200 MM HEPES، 500 مل كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8.5). حقن 10 مل من كسر elution DFE (الخطوة 4.4) لتبادل العازلة ورصد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 و 558 نانومتر.
  7. جمع الكسر التي تحتوي على DFE مرة واحدة في إشارات الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر و 558 نانومتر قد زادت إلى أكثر من 5 موالا فوق خط الأساس. أخذ عينة 0.2 مل وتحديد تركيز TSP، تركيز DFE، ونقاء DFE (الخطوة 7).
  8. ركز عينة DFE النقية (من الخطوة 4.7) إلى 15 غرام L-1 باستخدام أنبوب تركيز الطرد المركزي في 3000 × ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في جهاز طرد مركزي. متابعة مع رد فعل اقتران (الخطوة 5).
    ملاحظة: تخزين الحل DFE في 4 درجة مئوية إذا كان لا يمكن تنفيذ خطوات التركيز أو اقتران على الفور.

5. اقتران DFE إلى تنشيط عبر مرتبطة الراتنج أجاروز

ملاحظة: لا تحل محل isopropanol المستخدمة لتخزين الأعمدة التي تعمل NHS حتى تكون جميع المعدات والحلول لاقتران جاهزة. لا تدع الأعمدة تجف أبداً.

  1. إعداد نموذج تصميم التجارب (DoE) لتحسين اقتران DFE بالراتنج المنشط، مع درجة الحموضة، وتكوين المخزن المؤقت، وتركيز DFE كعوامل. يتم وصف تفاصيل أسلوب DoE في مكان آخر15.
  2. إعداد محلول الأربطة المتقاربة (من الخطوة 4.8) في نطاق تركيز يتراوح بين 0.5-15 غرام· L-1 أو كما هو محدد في DoE وتخزينها على الجليد حتى رد فعل اقتران جاهزة (الخطوة 5.5). ملء ما لا يقل عن عشرة محاقن 2 مل مع الحل DFE وإعداد محول لتركيب المحاقن على NHS تنشيط عبر ربط أعمدة agarose مع حجم السرير من 1.0 مل.
  3. لكل 10 أعمدة تستخدم لاقتران، وإعداد 30 مل من محلول التعطيل (0.5 M الإيثانولامين، 0.5 M كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8.3)، 30 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة (0.1 م خلات الصوديوم، 0.5 M كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 4.0) و 10 مل من محلول التخزين (0.05 M فوسفات الصوديوم ، 0.1٪ (م / الخامس) أزيد الصوديوم، والحموضة 7.0).
  4. إعداد 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 مل في أنبوب واحتضانه على الجليد لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  5. افتح عمود agarose مختوم مُفعّل بـ NHS ويحمّل محول الحقنة في مدخل العمود. منع أي الهواء دخول العمود عن طريق تطبيق قطرة من المخزن المؤقت على مدخل المحول قبل توصيله إلى المحاقن.
  6. اغسل العمود بـ 6 مل من حمض الهيدروكلوريك المثلج بنصف لتر 1 مل (من الخطوة 5.4) بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة-1 ثم انتقل على الفور إلى الخطوة 5.7.
  7. حقن 1.5 مل من محلول DFE (الخطوة 5.2) باستخدام حقنة 2 مل بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة-1 وجمع كسر التدفق من خلال مقياس الدقة (الخطوة 5.4) للتحليل اللاحق (الخطوة 7). أغلق العمود في كلا الطرفين واحتضن لمدة 15-45 دقيقة عند 22 درجة مئوية، اعتمادا على إعداد وزارة المعدات.
  8. حقن 6 مل من محلول التعطيل متبوعاً بـ 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفض بمعدل تدفق قدره <1 مل دقيقة-1 لإزالة الأربطة غير المقيدة بشكل مشترك من الراتنج. ثم حقن 6 مل من حل التعطيل واحتضان العمود لمدة 15 دقيقة.
  9. حقن 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة في العمود، متبوعاً بـ 6 مل من محلول التعطيل. ثم حقن آخر 6 مل من محلول درجة الحموضة المنخفضة في العمود.
  10. حقن 2 مل من محلول التخزين في العمود وتخزينها في 4 درجة مئوية.

6. اختبار تنقية mAbs من مستخلصات النباتات أوضح

  1. إعداد 100 مل من استخراج النبات واضحة تحتوي على 2F55 أو supernatant من نظام التعبير القائم على الخلية المفضلة، والتي تحتوي أيضا على 2F5.
  2. إعداد عازلة للتوازن (20 مليون متر من فوسفات الصوديوم، و500 مليون متر من كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4)، وحاجز إيلوتيون منخفض الحموضة (0.05 مليون سيترات، 0.05 م كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 4.0-3.25)، وحاجز إلوتيون عالي القوة (1.0-4.0 M كلوريد المغنيسيوم، 0.1 م HEPES، pH 8.0)
  3. مسح نظام الكروماتوغرافيا مع المخازن المؤقتة. قم بتحميل عمود تقارب DFE (من الخطوة 5.10) على نظام الكروماتوغرافيا ومعادل مع 5 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للتوازن بمعدل تدفق قدره 1.0 مل دقيقة-1. مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر.
    ملاحظة: تحميل استخراج النبات أو خلية الثقافة supernatant على العمود يمكن أن يسبب زيادة في الضغط الخلفي. تعيين تنبيه الضغط العالي في 0.2 MPa لتجنب الأضرار التي لحقت نظام الكروماتوغرافيا أو عمود DFE.
  4. تحميل 80 مل من استخراج النبات أوضح أو supernatant (الخطوة 6.1) على العمود بمعدل تدفق قدره 0.5 مل دقيقة-1 لضمان وقت الاتصال من 2 دقيقة. تخزين عينات التدفق من خلال في 4 درجة مئوية إذا كان التحليل الفوري عينة غير ممكن.
  5. اغسل العمود بـ 6 السيرة الذاتية للمخزن الاحتياطي للتوازن. جمع عينة من غسل في بداية ووسط ونهاية هذه الخطوة.
  6. Elute mAb 2F5 مع 5 السيرة الذاتية من منخفض الحموضة الإلتصاق العازلة أو عالية الأيونية قوة الإلتثال العازلة (0.1 M HEPES، 1.25 M كلوريد المغنيسيوم، درجة الحموضة 8.0). جمع كسر DFE عندما زادت إشارة الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر إلى 5 mAU فوق خط الأساس.
    1. تحسين المخزن المؤقت للإلتبيلة لكل زوج من الأجسام المضادة للepitope. بالنسبة لـ 2F5، حقق كلوريد المغنيسيوم 1.25 M توازنًا مثاليًا بين استرداد المنتج واستقرار الأربطة.
      ملاحظة: محلول كلوريد المغنيسيوم عرضة لهطول الأمطار. لذلك، حل كلوريد المغنيسيوم في ~ 700 مل من الماء. إذابة HEPES بشكل منفصل في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8.0. أضف محلول كلوريد المغنيسيوم المذاب إلى محلول HEPES وأضف الماء إلى الحجم النهائي من 1.0 لتر. لا تقم بضبط الحموضة بعد حل كلوريد المغنيسيوم لأن هذا سوف يسبب هطول الأمطار.
  7. تحليل جميع العينات التي اتخذت خلال الخطوات 6.4-6.6 باستخدام طريقة برادفورد، وليثيوم دوديسيلسلفات بوليأكريلاميد هلام الكهربائي (LDS-PAGE) وصدى بلازمون السطح (SPR) مطيافية (الخطوة 7).

7. تحليل العينات

  1. قياس تركيز TSP باستخدام طريقة برادفورد18،19.
    1. في ثلاثة أضعاف، ماصة 2.5 ميكرولتر من كل عينة في بئر واحد من لوحة 96 جيدا. استخدام ثمانية معايير الزلال المصل البقري (BSA) في ثلاثة أضعاف تغطي نطاق 0-2000 ملغ · L-1.
    2. إضافة 200 درجة مئوية من الكاشف برادفورد إلى كل بئر ومزيج من قبل الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. الحفاظ على مستوى الماصات لتجنب تشكيل الفقاعات التي تشوه القراءة اللاحقة.
    3. احتضان لوحة لمدة 10 دقيقة في 22 درجة مئوية وقياس امتصاص في 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي. حساب تركيز TSP في العينات استناداً إلى منحنى قياسي من خلال النقاط المرجعية BSA.
  2. قياس DFE عن طريق قياس الفلورة
    1. في ثلاثة أضعاف، ماصة 50 درجة مئوية من كل عينة في آبار واحدة من لوحة سوداء 96 جيدا نصف منطقة. تشمل ستة معايير DsRed تغطي نطاق 0-225 ملغ · L-1.
    2. قياس الفلورة مرتين باستخدام 530 ± 30 نانومتر مرشح الإثارة و 590 ± 35 نانومتر مرشح الانبعاثات في مقياس الطيف. حساب تركيز DFE في العينات استناداً إلى منحنى قياسي من خلال النقاط المرجعية DsRed.
  3. قياس تركيز 2F5 بواسطة التحليل الطيفي SPR20.
    1. إعداد المخزن الاحتياطي تشغيل HBS-EP (10 m4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic Acid (HEPES), 3 m ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 150 mM كلوريد الصوديوم, 0.005% v/v توين-20, p H 7.4) وتصفية تعقيمه من خلال تمريره من خلال فراغ 0.2 ميكرومتر زجاجة أعلى مرشح. Degas العازلة لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بتوصيل المخزن المؤقت لتشغيل HBS-EP بأداة SPR قبل إرساء رقاقة سطح dextran carboxymethylated ومعادلة النظام باستخدام الوظيفة الرئيسية. بدء تشغيل يدوي مع معدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة-1 وشرط سطح رقاقة عن طريق حقن بالتناوب 30 مل حمض الهيدروكلوريك و هيدروكسيد الصوديوم 25 M (حقنتين لكل منهما) على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة-1 لمدة 1 دقيقة.
    3. إعداد 300 درجة مئوية من 500 ملغ · L-1 بروتين حل في خلات الصوديوم 10 MM (درجة الحموضة 4.0). قنينات الذوبان التي تحتوي على 0.4 م 1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروديميد هيدروكلوريد (EDC) و 0.1 M NHS والطرد المركزي في 16,000 × غرام لمدة دقيقة واحدة قبل خلط 70 ميكرولتر من EDC و 70 ميكرولتر من NHS.
    4. نقل خليط EDC / NHS والبروتين A الحل إلى 7 مم قارورة عينة بلاستيكية ووضعها في رف العينة. قم بتنشيط سطح رقاقة dextran من كاربوكسيميثيلاتيد عن طريق حقن خليط EDC/NHS على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق قدره 10 ميكرولتردقيقة -1 لمدة 10 دقائق.
    5. الزوجين البروتين A إلى سطح dextran carboxymethylated المنشط عن طريق حقن البروتين حل على خلية التدفق 2 بمعدل تدفق 15 ميكرولتردقيقة -1 لمدة 15 دقيقة.
    6. أثناء اقتران البروتين A، إذابة قارورة من 1.0 M إيثانولامين هيدروكلوريد (درجة الحموضة 8.5) والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة دقيقة واحدة. نقل 150 ميكرولتر إلى قارورة بلاستيكية 7 مم ومكان في الصك. عند اكتمال الخطوة 7.3.5، قم بإلغاء تنشيط سطح الرقاقة عن طريق حقن محلول الإيثانولامين على خلايا التدفق 1 و2 بمعدل تدفق قدره 10 ميكرولتردقيقة -1 لمدة 7 دقائق.
    7. حالة سطح رقاقة عن طريق حقن بالتناوب 30 مل حمض الهيدروكلوريك و هيدروكسيد الصوديوم 25 M (حقنتين لكل منهما) على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة-1 لمدة 0.5 دقيقة.
    8. إعداد معايير الأجسام المضادة 2F5 في المخزن الاحتياطي تشغيل HBS-EP بتركيز 500 درجة مئوية · L-1 وعينات مخففة تحتوي على 2F5 في HBS-EP إلى تركيز نهائي في نطاق 20-1000 ميكروغرام· L-1. حقن العينات والمعايير على خلايا التدفق 1 و 2 بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة-1 لمدة 3 دقائق.
    9. طرح إشارة الوحدات النسبية (RU) لخلية التدفق 1 (الخلية المرجعية) من إشارة خلية التدفق 2 (خلية القياس) لكل عينة وحساب تركيز الأجسام المضادة استناداً إلى إشارة RU من الحقن القياسية 2F5.
    10. بعد كل عينة أو حقن القياسية، وتجديد سطح رقاقة عن طريق حقن حمض الهيدروكلوريك 30 مل بمعدل تدفق 30 ميكرولتر دقيقة-1 لمدة 0.5 دقيقة على خلايا التدفق 1 و 2.
    11. رسم تركيز 2F5 لكل عينة تدفق من خلال من الخطوة 6.4 ضد تدفق من خلال حجم للحصول على منحنى اختراق 2F5. حساب كمية حقن 2F5 عندما تم التوصل إلى 10٪ من تركيز التحميل 2F5 للحصول على قدرة الربط الديناميكي 10٪ (DBC).
  4. تحليل عينات البروتين من قبل LDS-PAGE.
    1. افتح جل بوليأكريلاميد BisTris LDS جاهز الاستخدام 4-12% وضعه في وحدة الكهربائي. نقل 800 مل من المخزن المؤقت قيد التشغيل (50 مل MES، 50 mM Tris base، 0.1٪ (م / الخامس) SDS، 1 MM EDTA، pH 7.3) في وحدة وإضافة 0.5 مل من محلول مضاد للأكسدة.
    2. في أنبوب رد فعل 1.5 مل، مزيج 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت التحميل مع 4 ميكرولتر من عامل الحد و 26 ميكرولتر من عينة البروتين. احتضان الأنبوب في كتلة الحرارة لمدة 10 دقائق في 80 درجة مئوية. الطرد المركزي الأنبوب في 500 × ز لمدة 30 ث.
    3. قم بتحميل جل البولي أكريلاميد LDS (10 ميكرولتر من العينة لكل حارة) وتحميل 5 ميكرولتر من معيار البروتين الملطخ مسبقًا (10-180 كيلوداً) في ممر منفصل.
    4. أغلق غرفة الكهربائي وقم بتوصيل مصدر الطاقة. وينبغي تشغيل الكهربائي لمدة 40 دقيقة وثابت 200 V.
    5. إزالة هلام من غرفة الكهربائي. فتح تغليف هلام وغسل هلام لمدة 15 دقيقة في الماء على شاكر في 19 دورة في الدقيقة. وصمة عار هلام لمدة 1 ساعة في حل تلطيخ على شاكر في 19 دورة في الدقيقة.
    6. Destain هلام لمدة 1 ساعة في الماء على شاكر في 19 دورة في الدقيقة. امسح الجل ضوئيًا باستخدام ماسح ضوئي للأفلام.

Representative Results

التعبير وتنقية الرباط التقارب

تم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا نمت في الدفيئة. وكان العائد ~ 120 mg·kg-1 كتلة ورقة مع متوسط الكتلة الحيوية من ~ 130 غرام لكل مصنع. وكان نقاء DFE <5% من ملعقة صغيرة في مستخلصات النباتات الخام قبل الغسل ولكن زادت إلى ~ 40٪ بعد المعالجة الحرارية في 70 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة، والتي عجلت > 97٪ من بروتينات الخلية المضيفة. تم دمج خطوة الغسل بسهولة في روتين الحصاد والاستخراج (الشكل1) واستغرق أقل من 2 ساعة من الوقت الإضافي، بما في ذلك إعداد حمام المياه. وكان الانتعاش العام من DFE 23.5 ملغ كجم1 مع نقاء > 90٪. وكانت الخطوات المسؤولة عن فقدان المنتج هي الغسل، والترشيح العمق، وIMAC، مع خسائر محددة من 40٪ و 27٪ و 45٪، على التوالي. كان عمق مرشح قدرة في المتوسط 135 ± 36 L م-2 (± SD، n = 3) وبالتالي في النطاق العلوي من القيم المبلغ عنها في الأدب21. زيادة غلة DFEمع عمر النبات (الشكل 2).

تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية

خلال اختبارات الاقتران الأولية، وجدنا أن المخزن المؤقت HEPES (درجة الحموضة 8.3) زيادة كفاءة اقتران إلى 89 ± 6٪ (± SD، n = 3) مقارنة مع 78 ± 9٪ (± SD، n = 3) للحاجز بيكربونات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. ولذلك، تم استخدام HEPES لجميع تجارب الاقتران اللاحقة. تم اختيار نهج وزارة الطاقة لتحسين كفاءة اقتران DFE إلى راتنج الآغاروز المرتبط بـ NHS. ازدادت الكمية المطلقة من DFE المعطلة على الراتنج مع كتلة DFE حقن في العمود واستقرت في ~ 15 غرام · L-1 في حين انخفض العائد اقتران باستمرار كماتم حقن المزيد من DFE (الشكل 2). وكان العائد اقتران أيضا > 50٪ أقل في المخزن المؤقت الحمضية، مما يدل على الحاجة إلى فحص لظروف اقتران مناسبة لكل ligand على أساس كل حالة على حدة. تم تحديد الظروف المثالية من حيث العائد اقتران، والكمية المطلقة من DFE المعطلة وتكاليف العمود باستخدام أداة التحسين العددي لبرنامج DoE. وكانت أكثر الظروف استصواباً (درجة الحموضة 9.0 و7.0 ملغم من DFE لكل 1 مل من راتنج الأجاروز المترابط) موجودة على هضبة كبيرة وبالتالي كانت قوية. الجزيئات DFE الاحتفاظ الفلورة الحمراء حتى بعد اقتران، وكثافة اللون تتوافق معالكمية الإجمالية من DFE المعطلة (الشكل 2). لذلك، يمكن استخدام لون العمود كمعلمة مراقبة جودة بسيطة لتقدير كفاءة الاقتران وجودة العمود. وأكد الفلورة أيضا أن DFE البروتين الانصهار تجميعها في حالة رباعية من DsRed الأصلي.

Figure 2
الشكل 2: تحسين تجميد DFE إلى راتنج الأجاروز المرتبط بـ NHS. (A) LDS-PAA هلام مع تراكب وصمة عار الغربية من عينات التجانس وelution من مقتطفات مصنع DFE المعدلة وراثيا unblanched وبلانش. تم حصاد النباتات بعد 38 أو 45 أو 52 يوما من البذر. تم تنفيذ البقع الغربية باستخدام المضادة له6-الأجسام المضادة5. (B) المبلغ الإجمالي للربط تقارب DFE المقترنة في الاعتماد إذا اقتران درجة الحموضة والكتلة الإجمالية من DFE تنقية حقن على NHS تنشيط عبر ربط أعمدة agarose. تشير النقاط الحمراء إلى التجارب الفعلية التي أجريت لإنشاء نموذج سطح الاستجابة. (C) أعمدة تقارب DFE بعد إجراء الاقتران. الأرقام تتوافق مع شروط اقتران أبرز في لوحة B. dps = أيام بعد البذر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE

تم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلف 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنتاميانا المزروعة في فيتوترون5. تم اختبار التقاط 2F5 من استخراج النبات الخام باستخدام أعمدة تقارب إلى جانب ~ 7.0 ملغ DFE تنقية (الخطوة 6). الإلواء من راتنجات البروتين A عادة ما ينطوي على العازلة الحمضية (درجة الحموضة ~ 3.3)13. لذلك، قمنا في البداية بتقييم مختلف المخازن المؤقتة للانخفاض في درجة الحموضة (pH 6.0-3.25) لأعمدة DFE. وقد نجح الإنعلاث من 2F5 في قيم درجة الحموضة أقل من 4.5 مع أعلى انتعاش من ~ 35٪ في درجة الحموضة 3.25. ومع ذلك، فإن انخفاض درجة الحموضة تعطيل كل من الأجسام المضادة (كما أكد ذلك قياس الطيف SPR) وLigand DFE (كما هو مبين في فقدان اللون وانخفاض DBC، الشكل3). وكان من المتوقع أن هذا الأخير نظرا لأن التشوهات DsRed الأصلي في درجة الحموضة <4.022,23. لتجنب المنتج وdenaturation ligand، اختبرنا كلوريد المغنيسيوم كعامل الإلتاءب البديل لأنه قد تم استخدامه سابقا لelute mAbs من راتنجات التقارب الأخرى24. وكان تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 M كافية لelute 2F5 من الراتنج تقارب DFE مع استرداد 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، ن = 3). وكان هذا الأداء مماثلة للبروتين A الراتنجات25،26. وكان ثابت تفكك التوازن(K D) من DFE تنقية 2F5 الأجسام المضادة وFuzeon ligand الاصطناعية 791 pM في حين أن من البروتين A-تنقية النظير كان 763 PM5. وعلاوة على ذلك، لم يلاحظ فقدان كبير للألوان في الراتنج على مدى ما مجموعه 25 دورة ربط وelute. انخفض DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق خطيا على مدى 25 دوراتإلى ~ 15٪ من القيمة الأولية (الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3: اختبار عزل 2F5 من المستخلصات النباتية الواضحة باستخدام راتنجات DFE المتقاربة. (أ) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة من الإلتاءب باستخدام المخازن المؤقتة ذات قيم الحموضة المختلفة في النطاق 4.0-3.0 ونفس الراتنجات بعد خطوة تحييد عند درجة الحموضة 6.0. (B) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة وست دورات من تنقية 2F5 باستخدام 1.25 M أو 4.00 M كلوريد المغنيسيوم كما eluent. (C) كروماتوغرام من تجارب التحميل الأمامي (منحنيات كسر من خلال) لتحديد القدرة ملزمة ديناميكية تعتمد على دورة من الراتنج DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم كما eluent. تم قياس منحنيات كسر من خلال ل4.0 M و 1.25 M المخازن العازلة كلوريد المغنيسيوم elution وأرقام دورة مختلفة. (D) القدرة الملزمة الديناميكية المعتمدة على الدورة من DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم 1.25 M كما eluent. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تطبيقات من الرواية تقارب راتينج

لقد أظهرنا أن راتنجات الكروماتوغرافيا المتقاربة المخصصة لالتقاط mAbs يمكن تصنيعها عن طريق تعطيل الرباط الذي يحتوي على epitope خاص بـ mAb إلى agarose عبر المرتبطة بـ NHS. لتصميم مثل هذا الراتنج، كان من الضروري معرفة تسلسل الظهارة واستخدام epitope خطي. الراتنجات الناتجة مفيدة لالتقاط mAbs لأنها يمكن أن تحل محل مكلفة البروتين A خطوات الكروماتوغرافيا تقارب. التفاعل بين 2F5 و DFE في دراسة الحالة لدينا تم التوسط من قبل النعت الربية-paratope ملزمة، لذلك يجب أن يكون لدينا ligand أكثر انتقائية من البروتين A، الذي يربط إلى منطقة Fc من معظم المورين وIgGs الإنسان. لأن هناك حاجة إلى الأربطة الفردية لكل mAb، قد تبدو طريقتنا في البداية مناسبة أساسا للأجسام المضادة التي يتم إنتاجها على نطاق واسع جدا. ومع ذلك، من خلال الجمع بين نهجنا مع التعبير السريع البروتين العابر القائم على النبات، يمكن إعداد الأربطة تقارب جديدة في أقل من 2 أسابيع27 مع الحد الأدنى من الجهد28. وبالتالي، فإن الطريقة هي أيضا مناسبة لتنقية mAb على نطاق صغير.

الإنتاج والتحسينات المحتملة للربط التقارب

النباتات تقدم منصة إنتاج سريعة وآمنة للربط التقارب29،30،مثل بروتين الانصهار DFE واردة في دراسة الحالة لدينا. وقلّل غسل المواد النباتية إلى حد كبير كمية بروتينات الخلايا المضيفة في خطوة واحدة، وتم دمجها بسهولة في روتين توضيح قياسي. ومع ذلك، كان استرداد ligand منخفضة في الإعداد الحالي، وربما يرجع ذلك إلى استقراره الحراري المعتدل وبعض غير محددة ملزمة لطبقات فلتر، كما ذكرت للمنتجات الأخرى31،32،33. هندسة الناقل لزيادة استقراره الحراري قد يساعد بالتالي على تحسين غلة الرباط في المستقبل، كما هو موضح لمرشح لقاح الملاريا CCT، إنزيم مضاد للورم PpADI أو mesophilic β-glucosidase34، 35و36. وينطبق الشيء نفسه على خطوة الترشيح العمق، حيث هندسة البروتين قد تساعد على الحد من غير محددة ملزمة لمادة فلتر37. ويمكن أيضا خفض تكاليف الإنتاج لDFE وligands مماثلة عن طريق تحسين الكفاءة العامة للتوضيح باستخدام flocculants أو إضافات فلتر38،39.

عندما يتم استخدام DsRed كناقل، فإنه يشكل مجمع رباعي. وهذا مفيد لأنه يزيد من عدد الepitopes لكل ligand، ولكنه قد يجعل أيضا الرباط أكثر عرضة للتفكيك أو denaturation أثناء الكروماتوغرافيا تقارب. بروتين الناقل الأحادي مثل mCherry قد يكون من الأفضل، لأنه مستقر عند درجة الحموضة منخفضة40،وإدراج تكرار جنبا إلى جنب من epitope من شأنه أن يزيد من متعطشا للربط وبالتالي زيادة قدرة الراتنج 26 , 41- وبالنسبة للبروتينات البسيطة التي تحمل الموجات الإنقلت (أي تلك التي ليس لها روابط ثنائيكبريتيد أو تعديلات ما بعد الترجمة) فإن نظم الإنتاج الميكروبية قد تقلل من تكاليف التصنيع وتجعل الأربطة أكثر قدرة على المنافسة مع البروتين ألف. على سبيل المثال، تم التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر في الخلايا البكتيرية مع العائد من ~ 1 غرام · كجم-1 الكتلة الحيوية، والتي من شأنها أن تقلل بشكل كبير من تكاليف إنتاج الأربطة42.

بغض النظر عن المضيف التعبير، كان مطلوبا ربط تقارب تنقية أثناء اقتران لتقليل تجميد بروتينات الخلية المضيفة أو مكونات وسائل الإعلام التي يمكن أن تقلل خلاف ذلك انتقائية الراتنج والقدرة. إدراج علامة بولي الهيستيدين لتنقية IMAC زيادة النقاء إلى ~ 90٪ في خطوةواحدة، وتسهيل إنتاج ligand سريع وغير مكلفة 5،43،44. ومع ذلك، فإن موقف علامة الانصهار مهم لأنه لديه القدرة على إعاقة بشكل معقم ملزم الظهارية أو للحث على انشقاق إما العلامة أو epitope من الناقل45،46.

تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية

وقد تم التعطيل يدويا أو باستخدام نظام كروماتوغرافيا. ويبدو أن أحجام التخزين المؤقت الصغيرة لكل عمود تفضل المناولة اليدوية (على سبيل المثال، بسبب الحد الأدنى من أحجام النفايات). ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى أعمدة متعددة/أكبر، فإن نظام الكروماتوغرافيا يجعل من السهل التحكم في ظروف الاقتران (مثل معدلات التدفق المنظمة) وبالتالي فمن الأرجح أن يحقق نتائج قابلة للاستنساخ من حيث DBC. تشير بياناتنا إلى أن المخزن المؤقت للاقتران ودرجة الحموضة لها تأثير هام على كفاءة الاقتران وتكاليف العمود الإجمالية. عوامل الفرز التي تؤثر على رد فعل اقتران وتعديلها لكل بروتين الناقل (أو حتى لكل الناقل ligand الانصهار) يمكن بالتالي تحسين كفاءة اقتران وأداء الراتنج، ونحن نوصي هذا النهج.

اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE

إنتاج المنتج والنقاء هي جوانب هامة من أداء الراتنج، وفي حالة DFE حققنا العائد من 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، n = 3)، وهو ما يمكن مقارنته مع أداء الراتنجات البروتين A القياسية25 ،26. مؤشر أداء رئيسي آخر للراتنجات بشكل عام (وخاصة بالنسبة لتلك التي تقوم على ربط اتّصال التقاربيّة) هو DBC عند 10% من المنتجات، لأن هذه المعلمة تؤثر على كمية الراتنج المطلوبة لعملية محددة وبالتالي التكاليف. ل ال [دف] [ليغد], كان ال [دبك] أوّليّة حوالي 4 [غ]· L-1 الراتنج، وهو ~ 13٪ من القيمة المقابلة للبروتين A في ظل ظروف مماثلة (فقط 2 دقيقة وقت الاتصال)25،47 ولكن حوالي 15 أضعاف أعلى بالمقارنة مع راتنجات التقارب مخصصة أخرى مثل المضادة للFSH المناعية ligand باستخدام نفس وقت الإقامة من 2 دقيقة48. انخفض DBC من DFE إلى 15٪ من قيمة البداية بعد 25 دورات الربط وelute، في حين أن هناك حاجة إلى أكثر من 50 دورات لنفس الخسارة من DBC في الراتنجات البروتين A التجارية49. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الناقل لدينا لم يتم تحسينها حتى الآن إلى نفس المدى كما البروتين A، الذي تم التحقيق بشكل شامل وتحسينعلى مدى العقود الأربعة الماضية8.

حتى الآن قمنا بتحسين استقرار الراتنج واستعادة المنتج عن طريق التحول من العازلة انخفاض درجة الحموضة elution إلى تركيز عال من كلوريد المغنيسيوم (الشكل3)، كما أوصى في الدراسات السابقة13. اللون الأحمر المميز للربط تقارب لم تتلاشى إلى حد كبير خلال 25 دورات ربط وelute، لذلك نحن نتكهن بأن البروتياز النباتية الذاتية في استخراج النبات أوضح31 قد يكون اقتطاع وبالتالي تعطيل epitope من الليغاان. ولذلك، فإن تصميم الوصلات المقاومة للبروتياز لربط الناقل والظهارية قد يساعد على الحفاظ على DBC الأولي على مدى عدد موسع من الدورات. وبالنظر إلى التعبير السريع والبسيط وتنقية الرباط DFE، واقترانه مباشرة إلى راتنجات الكروماتوغرافيا التجارية، وغلة منتجاتها الممتازة ونقاءها، نعتقد أن أسلوبنا يوفر بديلا ً مناسباً للبروتين A لل تنقية mAbs ومشتقات الأجسام المضادة التي لا تربط البروتين A، وخاصة إذا كان التحسينات على الناقل والرابط يمكن تحسين DBC واستقرار ligand. وقد أيد هذا الافتراض من قبل الفرق الصغير في ثابت التفكك من DFE تنقية والبروتين A-تنقية 2F5 الأجسام المضادةمما يشير إلى أن لدينا ربط تقارب جديد يسمح باستعادة mAbs عالية الجودة.

الفوائد والقيود الحالية للطريقة

إنتاج الرباط تقارب كاندماج وراثي مع بروتين الناقل يزيد من الذوبان في المخازن المؤقتة المائية وبالتالي التوافق مع ظروف اقتران ligand نموذجية. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون الببتيدات الفارغة المستمدة من تركيب الببتيد المرحلة الصلبة الذوبان محدودة في ظل هذه الظروف بسبب تسلسلها50، والتي لا يمكن تغييرها لأنها تمليها سلسلة الأحماض الأمينية من epitope المعترف بها من قبل mAb ل أن تكون تنقية. لذلك استخدم آخرون توليف على الراتنج من الأربطة الببتيد51. وكانت قدرة الربط ثابت من الراتنج الناتجة عالية (~ 80 غرام · L-1)،ولكن عملية إعداد الراتنج طويلة، لم يتم الإبلاغ عن قدرة ملزمة ديناميكية والنقاء والانتعاش التي تم الحصول عليها كانت أقل مما كانت عليه في نهجنا. ميزة إضافية من ربط البروتين الانصهار في نطاق المختبر هو أن ligand والمتغيرات منها يمكن أن تنتج بسرعة، وتنقية واختبارها مع الحد الأدنى من الجهد في سهلة الاستخدام عالية من خلال نظام التعبير52.

والقيود الحالية للطريقة المعروضة هنا هي القدرة الدينامية المنخفضة للربط البالغة 3 ز· L-1 وخفضه 90٪ على مدى 25 دورات ربط وelute5. ويمكن معالجة هذه القيود في المستقبل عن طريق تطبيق شروط تحميل أقل صرامة واستبدال الناقل DsRed الحالي بمتغير هندسي أكثر استقرارا ً على التوالي. على سبيل المثال، مضاعفة وقت الاتصال الحالي من 2 إلى 4 دقائق لديه القدرة على مضاعفة قدرة الربط الديناميكي كما هو مبين لبعض راتنجات البروتين A26.

استكشاف الاخطاء

يسلط الجدول التالي الضوء على المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها أثناءهذا البروتوكول ويوفر تلميحات حول كيفية حلها (الجدول 1).

الجدول 1: المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها والإصلاحات الممكنة.
خطوة البروتوكول المشكله Couse اصلاح
1 النباتات لا تنمو ظروف النمو المهددة التحقق من الحموضة والموصلية من الأسمدة
التحقق من درجة الحرارة وظروف الضوء
2 و 3 كميات كبيرة من بروتينات الخلية المضيفة موجودة بعد استخراج هطول الأمطار غير الكامل تحقق من درجة الحرارة أثناء الغسل
تحقق من التحريض في حمام الغسل
2 و 3 لم يتم العثور على أي منتج في مستخلص النبات درجة حرارة عالية جداً التحقق من درجة الحرارة ودرجة الحموضة أثناء الغسل
درجة الحموضة في المخزن المؤقت ابيضاض منخفضة جدا
3 تبقى أجزاء الجذعية أو الأوراق الكبيرة بعد الاستخراج خلط غير كامل في الخلاط تأكد من أن المواد النباتية لا تشكل المكونات في الخلاط
3 زيادة الضغط السريع أثناء الترشيح العمق تحديد عامل التصفية و/أو الاتجاه غير صحيح التحقق من نوع عامل التصفية واتجاهه
4 القليل من البروتين الانصهار خلال الإلتوى / الكثير من البروتين الانصهار في التدفق من خلال لم يتم شحن راتنج IMAC بالأيونات المعدنية تحقق مما إذا كان راتنج IMAC مشحونًا بشكل صحيح بالأيونات
فقدت بروتين الانصهار علامة التقارب تجنب أشعة الشمس الشديدة وارتفاع درجات الحرارة أثناء زراعة النباتات
4 بروتين الانصهار المفقود أثناء التركيز بروتين الانصهار المرتبط بالغشاء التحقق من نوع الغشاء
تأكد من أن عامل التركيز لم يكن مرتفعاً جداً
5 انخفاض العائد اقتران تسلسل غير صحيح من اقتران الكاشف إضافة التحقق من تسميات الكواشف وتسلسل الإضافة
إعداد غير صحيح للأعمدة قبل اقتران التحقق من شروط preparaiton العمود
5 و 6 انخفاض مباب العائد انخفاض التعبير mAb في الكتلة الحيوية النباتية اختبار التعبير mAb في الكتلة الحيوية
انخفاض كثافة الرباط تحقق من نقاء إعداد البروتين الانصهار
7 تركيزات بروتين منخفضة جدا / عالية في برادفورد حسب تشكيل فقاعة أثناء الأنابيب تحقق من وجود فقاعات في بالت 96 جيدا
7 تركيز منخفض من الماب أثناء قياس موارد البرنامج الخاصة بروتين للخطر رقاقة مقارنة مع نتائج mAb القياسية مع التركيز المعروف
تخفيف عينة غير صحيحة التحقق من معدل التخفيف والمخزن المؤقت

الجدول 1: إطلاق النار من المتاعب.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

نود أن نعترف بإبراهيم العامدي لزراعة نباتات التبغ المعدلة وراثياً والدكتور توماس راديماشر لتوفيره ناقلات تعبير التبغ. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور ريتشارد م. تويمان على المساعدة التحريرية وماركوس ساك على المناقشات المثمرة بشأن هيكل ربط الأربطة المتقاربة في إطار التعليم الإنمائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرامج الداخلية Fraunhofer-Gesellschaft في إطار المنحة رقم. جذب 125-600164 والدولة من [نورث-رهين-وستفليا] تحت [ليستثنززنترم] منحة رقم 423 "شبكة, إنتاج متكيّفة". وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة المالية الألمانية في إطار منحة فريق التدريب البحثي "تسليم المخدرات المستهدفة بالأورام" 331065168. دعمت شركة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية نشر هذه المقالة المفتوح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 L/20 L Bucket n/a n/a Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
ÄKTApure GE Helthcare 29018226 Chromatography system
Allegra 25R Beckman Coulter 369434 Centrifuge
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Antibody 2G12 Fraunhofer IME n/a Standard for SPR quantification
Blender Waring 800EG Blender
BP-410 Fuhr 2632410001 Bag filter
CanoScan 5600F Canon 2925B009 Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chelating Sepharose FF GE Helthcare 17-0575-01 Chromatography resin
Cond 3320 WTW EKA 3338 Conductometer
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n/a DoE software
Discovery Compfort Gilson F81029 Multichannel pipette
Disodium phosphate Carl Roth GmbH 4984.3 Media component
Diverse bottles Schott Duran n/a Glas bottles
Dri Block DB8 Techne Z381373 Heat block
DsRed Fraunhofe IME n/a Standart
EDTA Carl Roth GmbH 8043.2 Buffer component
EnSpire Perkin Elmer 2390-0000 Plate reader
ETHG-912 Oregon Scientific 086L001499-230 Thermometer
F9-C GE Helthcare 29027743 Fraction collector
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200 Hettich 2400 Centrifuge
HiPrep 26/10 GE Helthcare GE17-5087-01 Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL GE Helthcare 17-0716-01 Chromatography columns
Hydrochloric acid Carl Roth GmbH 4625.1 Buffer component
Imidazole Carl Roth GmbH 3899.2 Buffer component
K700 Pall 5302305 Depth filter layer
KM02 basic IKA n/a Magnetic stirrer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
L/S 24 Masterflex SN-06508-24 Tubing
Lauda E300 Lauda Dr Wobser GmbH Z90010 Immersion circulator
Magnesium chloride Carl Roth GmbH KK36.2 Buffer component
Masterflex L/S Masterflex HV-77921-75 Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm Sartorius 16534K Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter Thermo Fischer Scientific 595-4520 Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate Carl Roth GmbH T111.1 Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels Invitrogen NP0336BOX LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell Invitrogen EI0001 PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer Invitrogen NP0002 Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant Invitrogen NP0005 Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa) Invitrogen 26616 Protein standart
Perforated bucked n/a n/a Blanching
PH 3110 WTW 2AA110 PH meter
PowerPac HC Biorad 1645052 Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich P7837-5MG Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran GE Helthcare 17003301 Chromatography resin
Silicone spoon n/a n/a Spoon
Simply Blue SafeStain Invitrogen LC6060 Gel staining solution
Sodium acetate Carl Roth GmbH 6773.1 Buffer component
Sodium acetate Carl Roth GmbH X891.1 Media component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-100G Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Buffer component
Sodium citrate Carl Roth GmbH HN13.2 Buffer component
Sodium bisulfite Carl Roth GmbH 243973-100G Media component
Sodium phosophate Carl Roth GmbH T877.2 Media component
SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics SPR-AS-HCA SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics n/a SPR device
SSM3 Stuart 10034264 Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L Clatronic n/a Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL B. Braun 4606027V Syringes
Syringe adpter (Union Luer F) GE Helthcare 181112-51 Syringe adapter
TE6101 Sartorius TE6101 Precision scale
Tween-20 (Polysorbate) Merck 8170721000 Buffer component
Unicorn 6.4 GE Helthcare 29056102 Chromatography software
Vacuum bags Ikea 203.392.84 Plant storge
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Vortex-Genie 2 Scientific industries SI-0236 Vortex
XK-26/20 column housing GE Helthcare 28-9889-48 Chromtography column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kesik-Brodacka, M. Progress in biopharmaceutical development. Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (3), 306-322 (2018).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Jayapal, K., Wlaschin, K. F., Hu, W. S., Yap, M. G. S. Recombinant Protein Therapeutics from CHO Cells - 20 Years and Counting. Chemical Engineering Progress. 103, 40-47 (2007).
  4. Kunert, R., Reinhart, D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (8), 3451-3461 (2016).
  5. Rühl, C., Knödler, M., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. A linear epitope coupled to DsRed provides an affinity ligand for the capture of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1571, 55-64 (2018).
  6. Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R., Sack, M. Antibodies from plants for bionanomaterials. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1462 (2017).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Very-large-scale production of antibodies in plants: The biologization of manufacturing. Biotechnology Advances. 35 (4), 458-465 (2017).
  8. Bolton, G. R., Mehta, K. K. The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnology Progress. 32 (5), 1193-1202 (2016).
  9. Kelley, B. Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 1 (5), 443-452 (2009).
  10. Brochier, V., Ravault, V. High throughput development of a non protein A monoclonal antibody purification process using mini-columns and bio-layer interferometry. Engineering in Life Sciences. 16 (2), 152-159 (2016).
  11. Arakawa, T., Futatsumori-Sugai, M., Tsumoto, K., Kita, Y., Sato, H., Ejima, D. MEP HyperCel chromatography II: binding, washing and elution. Protein Expression and Purification. 71 (2), 168-173 (2010).
  12. Barroso, T. B., Aguiar-Ricardo, R. J., Roque, A. C. Structural evaluation of an alternative Protein A biomimetic ligand for antibody purification. Journal of Computer-aided Molecular Design. 28 (1), 25-34 (2014).
  13. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A. 1415, 83-90 (2015).
  14. Sack, M., et al. Functional analysis of the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5 produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB Journal. 21 (8), 1655-1664 (2007).
  15. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. Journal of Visualized Experiments. (83), 51216 (2014).
  16. Trasatti, J. P., Woo, J., Ladiwala, A., Cramer, S., Karande, P. Rational design of peptide affinity ligands for the purification of therapeutic enzymes. Biotechnology Progress. 34 (4), 987-998 (2018).
  17. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochemical Engineering Journal. 88, 162-170 (2014).
  18. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Current Protocols in Molecular Biology. 76 (Chapter 10), (2006).
  19. Buyel, F. J., Kaever, T., Buyel, J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotchnology and Bioengeneering. 110 (2), 471-483 (2013).
  20. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods in Molecular Biology. 503, 65-88 (2009).
  21. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnology Journal. 9 (3), 415-425 (2014).
  22. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  23. Vrzheshch, P. V., Akovbian, N. A., Varfolomeyev, S. D., Verkhusha, V. V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters. 487 (2), 203-208 (2000).
  24. Firer, M. A. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 433-442 (2001).
  25. Pabst, T. M., et al. Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamic binding capacity. Journal of Chromatography A. 1362, 180-185 (2014).
  26. Müller, E., Vajda, J. Routes to improve binding capacities of affinity resins demonstrated for Protein A chromatography. Journal of Chromatography B. 1021, 159-168 (2016).
  27. Shamloul, M., Trusa, J., Vadim, M., Vidadi, Y. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. Journal of Visualized Experiments. (86), 51204 (2014).
  28. Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  29. Saxena, L., Iyer, B. K., Ananthanarayan, L. Purification of a bifunctional amylase/protease inhibitor from ragi (Eleusine coracana) by chromatography and its use as an affinity ligand. Journal of Chromatography. B. 878 (19), 1549-1554 (2010).
  30. Kurppa, K., Reuter, L. J., Ritala, A., Linder, M. B., Joensuu, J. J. In-solution antibody harvesting with a plant-produced hydrophobin-Protein A fusion. Plant Biotechnology Journal. 16 (2), 404-414 (2018).
  31. Menzel, S., et al. Optimized Blanching Reduces the Host Cell Protein Content and Substantially Enhances the Recovery and Stability of Two Plant-Derived Malaria Vaccine Candidates. Frontiers in Plant Science. 7 (159), 1-7 (2016).
  32. Yigzaw, Y., Piper, R., Tran, M., Shukla, A. A. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnology Progress. 22 (1), 288-296 (2006).
  33. Menzel, S., et al. Downstream processing of a plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate. Protein Expression and Purification. 152, 122-130 (2018).
  34. Vöpel, N., Boes, A., Edgü, G., Beiss, V. Malaria vaccine candidate antigen targeting the pre-erythrocytic stage of Plasmodium falciparum produced at high level in plants. Biotechnology Journal. 9 (11), 1435-1445 (2014).
  35. Lee, C. W., Wang, H. J., Hwang, J. K., Tseng, C. P. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study. PLoS ONE. 9 (11), e112751 (2014).
  36. Zhu, L., Cheng, F., Piatkowski, V., Schwaneberg, U. Protein engineering of the antitumor enzyme PpADI for improved thermal resistance. Chembiochem. 15 (2), 276-283 (2014).
  37. Khanal, O., et al. Contributions of depth filter components to protein adsorption in bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1938-1948 (2018).
  38. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5 (2), 138-142 (2014).
  39. Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. Journal of Visualized Experiments. (110), e53940 (2016).
  40. Fink, D., et al. Ubiquitous expression of the monomeric red fluorescent protein mCherry in transgenic mice. Genesis. 48 (12), 723-729 (2010).
  41. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. Journal of Chromatography A. 1221, 57-70 (2012).
  42. Figueira, M., Laramée, L., Murrell, J. C., Groleau, D., Míguez, C. Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 195-200 (2001).
  43. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in enzymology. 326, 245-254 (2000).
  44. Sainsbury, F., Jutras, P. V., Vorster, J., Goulet, M., Michaud, D. A. Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science. 7, 141-141 (2016).
  45. Krupka, M., et al. The Position of His-Tag in Recombinant OspC and Application of Various Adjuvants Affects the Intensity and Quality of Specific Antibody Response after Immunization of Experimental Mice. PLoS ONE. 11 (2), e0148497 (2016).
  46. Goel, A., et al. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. Biochimica et Biophysica Acta. 1523 (1), 13-20 (2000).
  47. Tustian, A. D., et al. Development of a novel affinity chromatography resin for platform purification of bispecific antibodies with modified protein a binding avidity. Biotechnology Progress. , (2018).
  48. Zandian, M., Jungbauer, A. An immunoaffinity column with a monoclonal antibody as ligand for human follicle stimulating hormone. Journal of Separation Science. 32 (10), 1585-1591 (2009).
  49. Kelley, B. Very large scale monoclonal antibody purification: the case for conventional unit operations. Biotechnology Progress. 23 (5), 995-1008 (2007).
  50. Petrou, C., Sarigiannis, Y. Ch. 1. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering. S, K. outsopoulos , Woodhead Publishing. Cambridge. 1-21 (2018).
  51. Menegatti, S., et al. Design of protease-resistant peptide ligands for the purification of antibodies from human plasma. Journal of Chromatography A. 1445, 93-104 (2016).
  52. Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , 1-7 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 150، بدائل البروتين A، راتنج الكروماتوغرافيا، المعالجة النهائية (DSP)، تصميم التجارب (DoE)، المستحضرات الصيدلانية المصنعة (PMPs)، الانتعاش الأولي
تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knödler, M., Rühl, C.,More

Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter