Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59933

Summary

I denne procedure, en dsred-baserede epitop ligand er immobiliseret til at producere en meget selektiv affinitet harpiks til opsamling af monoklonale antistoffer fra rå planteekstrakter eller cellekultur supernatants, som et alternativ til protein a.

Abstract

Oprensning af monoklonale antistoffer (mAbs) opnås almindeligvis ved protein en affinitets kromatografi, som kan tegner sig for op til 25% af de samlede procesomkostninger. Alternative, omkostningseffektive fangst trin er derfor værdifulde for industriel produktion, hvor der produceres store mængder af en enkelt mAb. Her præsenterer vi en metode til immobilisering af en dsred-baserede epitop ligand til en cross-linked agopstået harpiks tillader selektiv opsamling af hiv-neutraliserende antistof 2f5 fra rå planteekstrakter uden at bruge protein a. Den lineære epitop eldkwa blev først genetisk smeltet til fluorescerende protein dsred og fusions proteinet blev udtrykt i transgene tobak (Nicotiana Nicotiana tabacum) planter før rensning ved immobiliseret metalionaffinitets kromatografi. Desuden blev en metode baseret på aktiveret tvær kædet agopstået optimeret til høj ligand tæthed, effektiv kobling og lave omkostninger. PH-og buffer sammensætningen og den opløselige ligand-koncentration var de vigtigste parametre under koblings proceduren, som blev forbedret ved hjælp af en metode til design af eksperimenter. Den resulterende affinitet harpiks blev testet for sin evne til selektivt binde Target mAb i en rå plante-ekstrakt og elueringsbuffer blev optimeret til høj mAb opsving, produkt aktivitet og affinitet harpiks stabilitet. Metoden kan let tilpasses andre antistoffer med lineære epitoper. De nye harpiks giver mulighed for blidere elueringsforhold end protein A og kan også reducere omkostningerne ved et indledende erobrings trin for Mab-produktion.

Introduction

Biofarmaceutiske produkter er vigtige for behandlingen af et bredt spektrum af sygdomme i næsten alle grene af medicin1. Monoklonale antistoffer (mAbs) dominerer det biofarmaceutiske marked, med verdensomspændende salg forventes at nå næsten €110.000.000.000 i 20202. Den favoriserede udtryks platform for MABS er ovarie cellelinjer fra kinesisk hamster, som typisk producerer høje Mab-titre på op til 10 g ∙ L-1 i kultur supernatanten3,4. Men, produktionen af mAbs i pattedyr cellekulturer er dyrt på grund af de høje omkostninger ved mediet og behovet for steril gæring5. Alternative udtryks platforme såsom planter kan tilbyde en hurtigere, enklere, billigere og mere skalerbar tilgang til industriel produktion6,7.

Ud over de omkostninger, der er forbundet med pattedyrscelle kulturer, er den udbredte brug af protein en affinitets kromatografi til produkt opsamling en stor omkostningsfaktor for industriel produktion af mAbs. Protein A findes naturligt på overfladen af Staphylococcus aureus celler, og det binder sig til fragment crystallizable (FC) regionen af visse murine og humane antistoffer, og dermed fungere som en forsvarsmekanisme til at omgå det humorale immunsystem8. Protein A er blevet branchens guld standard for opsamling af MABS fra cellekultur supernatanter og er også meget udbredt af forskersamfundet, fordi det er meget selektivt, typisk opnå Mab renheds på ~ 95% i et enkelt trin8. Ikke overraskende har salget af protein A i løbet af de sidste to årtier nøje afspejlet salget af mAbs8. Afhængigt af produktions skalaen kan omkostningerne til protein A svare til mere end 25% af de samlede procesomkostninger og dermed påvirke markedsprisen for terapeutiske MABS, som kan være op til €2.000 g-15,9. Derfor har alternative kromatografi harpiks med en lignende rensnings evne potentiale til at reducere produktionsomkostningerne betydeligt, hvilket gør antistof baserede terapier tilgængelige for et større antal patienter10,11 ,12. Sådanne alternativer kan også omgå ulemperne ved protein en kromatografi, herunder de barske elueringsforhold ved lav pH-værdi (typisk < 3.5), der potentielt kan forårsage, at mAbs undergår konformationsmæssige ændringer, der fremmer sammenlægning13 . Det er vigtigt, at protein A kun er selektivt for FC-regionen i visse IgG-underklasser, så ikke-funktionelle molekyler med trunkerede bindings domæner kan være co-rense med det intakte produkt5, hvorimod Mab-derivater såsom enkelt kædede variable fragmenter må ikke binde til protein A overhovedet.

Her beskriver vi en alternativ affinitets kromatografi harpiks til opsamling af hiv-neutraliserende Mab 2f5 ved hjælp af sin lineære epitop eldkwa (et bogstav aminosyre kode)5,14. Vi genetisk smeltet 2f5 epitop til C-endestation af det fluorescerende protein dsred, som fungerede som en bærer og reporter molekyle, og producerede den resulterende protein Dsred-2F5-Epitope (DFE) i transgene tobak ( Nicotiana Nicotiana tabacum) planter. DFE blev renset ved en enkelt trins immobiliseret metalionaffinitets kromatografi (IMAC). Immobilisering af den rensede DFE affinitets ligand på en tværbundet agopat harpiks blev opnået ved kemisk kobling ved hjælp af N-hydroxysuccinimide (NHS)-aktiverede Cross-linked aghas kolonner. Statistiske eksperimentelle design blev derefter brugt til at optimere immobilisering procedure og kobling effektivitet15. Rensnings strategien for mAb 2F5 blev evalueret med hensyn til antistof renhed, udbytte og ligand-stabilitet. I modsætning til protein A, som binder FC-regionen, er DFE bundet til den komplementaritets bestemmende region 2F5, der sikrer rensning af molekyler med en intakt paratope. Vores koncept kan nemt tilpasses til enhver Mab med en lineær epitop eller til andre peptidbaserede affinitets-ligander, som let kan identificeres ved mikroarray undersøgelser16.

Figure 1
Figur 1: proces flow skema til fremstilling af epitop affinitet harpiks, der kan anvendes til opsamling af MABS fra rå planteekstrakter eller cellekultur supernatants. A) tilhørsforholdet LIGAND DFE blev udtrykt i transgene tobaksplanter. Et varme udfældnings trin (B) blev inkluderet, før de høstede blade blev homogeniseret (C). (D) den rå planteekstrakt blev præciseret ved posefiltre ring, dybde filtrering og 0,2 μm steril filtrering. (E) DFE blev derefter RENSET af iMac. (F, G) Den rensede DFE Affinity ligand blev immobiliseret på EDC/NHS-aktiverede Cross-linked aghas kolonner. (H) bakteriekulturer, der transporterer T-DNA-kodnings antistof 2F5, blev anvendt til forbigående ekspression i N. benthamiana -planter (i) dyrket i en phytotron. J) blade af N. benthamiana blev høstet og forarbejdet som beskrevet i D. (K) Mab 2f5 blev renset fra det afklarede uddrag ved hjælp af DFE-tilknytnings kolonnerne (L). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Dyrk de transgene tobaksplanter

Bemærk: Designet af DFE fusionsprotein og generering af transgene planter er beskrevet andetsteds5,17.

  1. At spire de transgene tobaks frøplanter i jorden. Skyl planterne med en 1,0 g · L-1 gødnings opløsning. Overfør planterne til enkelt, 100 mm x 100 mm x 60 mm (længde, bredde, højde) Potter, når de vokser til en diameter på ~ 0,04 m.
  2. Dyrke de transgene tobaksplanter i et drivhus med en 16-h fotoperiode (25/22 °c lys/mørk temperatur regime), med 70% relativ luftfugtighed og automatiseret befrugtning med en 1,0 g · L-1 gødning løsning til 15 min hver time.
  3. Efter 7 uger, høst alle blade undtagen de fire cotyledonarter blade i bunden af planten stammen. Behandl straks de høstede blade som beskrevet nedenfor.

2. varme udfældning af Host celle proteiner

  1. Sæt et vandbad med en 20 L arbejdsvolumen i en rustfri-stål opvarmet fartøj (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). I starten skal du placere en magnetisk pumpe i vandbad for at agitere væsken permanent med et flow på 5 L min-1. Monter en justerbar termostat på vandbad til temperaturstyring (trin 2,4 og 2,8).
    Forsigtig: Alle følgende trin op til 2,10 involverer håndtering af varm væske. Bær passende personlige værnemidler, herunder termisk isolerede handsker og beskyttelsesbriller.
  2. Tilsæt 15 L deioniseret vand til vandbad og Opvarm væsken til 70 °C.
  3. Placer en 10 L spand fyldt med 5 L deioniseret vand på en magnetisk omrører. Tilsæt natriumfosfat til en slutkoncentration på 120 mM. PH-værdien justeres til 8,14 med 10 M saltsyre. Når alle komponenterne er opløst, tilsættes den resulterende koncentrerede blanchering buffer (5 L) til vandbad fra trin 2,2.
  4. Omrør vandbad, indtil temperaturen når 70 °C. Brug 10 M saltsyre til at justere pH-værdien til 8,14, hvis det er nødvendigt. Fortsæt omrygende i mindst 15 minutter efter den ønskede temperatur og pH er nået for at sikre, at hele samlingen er i termisk ligevægt.
  5. Forbered en 20 L spand (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) fyldt med deioniseret vand ved en temperatur på ~ 17 °C (påkrævet for trin 2,9).
  6. Forbered 400 g aliquoter af de høstede tobaksblade fra trin 1,3. En alikvot placeres i en perforeret kurv (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; pore bredde på mindst 0,02 m x 0,02 m). Undgå at overfylde kurven med plantemateriale eller pakning af bladene for stramt for at undgå at beskadige vævet.
  7. Helt Nedsænk kurven i den varme blanchering buffer fra trin 2,4 og sørg for, at alle blade forbliver under den flydende overflade. Brug en termo stabil silikone skeen til at holde bladene under overfladen, hvis det er nødvendigt.
  8. Inkuber tobaksbladene i 1,5 min i blanchvæsken, mens pumpen stadig agiterer væsken. Overvåge væske temperaturen i hele inkubationsperioden. Undgå at blokere pumpeindløbet med tobaksblade.
  9. Fjern kurven af tobaksblade fra blanchering buffer og dræne rest buffer fra bladene i 30 s. Overfør kurven til spanden fyldt med koldt vand (fra trin 2,5) og sænk bladene i 30 s. Fjern kurven, og Tøm vand fra i 30 s før homogenisering (trin 3).
  10. Gentag trin 2,6 til 2,9 med friske aliquoter fra 2,6, indtil hele den høstede biomasse forarbejdes. Konstant overvåge og justere pH og temperaturen af blanchering buffer i vandbad.
    Bemærk: Blanched plantemateriale kan opbevares på is i op til 30 minutter, når flere blanchering cyklusser er nødvendige for at behandle hele biomassen. Blancherede blade kan også opbevares i vakuum forseglede poser ved – 80 °C i mindst 3 uger. Øjeblikkelig behandling anbefales dog, fordi længerevarende opbevaring kan reducere DFE-udbyttet.

3. protein udvinding og afklaring

Forsigtig: Følgende trin involverer en blender med roterende knive. Du må ikke arbejde i Blender beholderen, når den er tændt eller monteret på motorenheden.

  1. Placer 150 g (våd masse) af blancherede tobaksblade (trin 2,9) i Blender beholderen, og tilsæt 450 mL ekstraktions buffer (50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumchlorid, 10 mM natriumdisulfit, pH 7,5). Luk blender hætten stramt for at forhindre spild af plantemateriale eller buffer.
  2. Homogeniser bladene til 3x for 30 s, med 30 s pauser mellem hver puls. Sørg for, at alle blade er homogeniserede, og at ingen holder sig til toppen af blender beholderen. Hvis det er nødvendigt, åbne blenderen under pauser og skubbe ned blade, der sidder på den øvre del af fartøjet, ved hjælp af en ren silikone ske.
  3. Efter homogenisering udtages en 1,0 mL prøve af homogenatet til efterfølgende analyse (trin 7).
  4. Homogeniseres i et fartøj af passende størrelse (f. eks. Hvis der arbejdes med en total biomasse på 1,0 kg, anvendes et fartøj med en kapacitet på mindst 5 liter). Gentag trin 3,1 til 3,3, indtil al den blancherede biomasse er homogeniseret.
  5. Monter et pose filter i et filter beslag, og Placer et andet fartøj med passende størrelse (Se 3,4) under samlingen. Anvend homogenatet til pose filteret med en hastighed på ~ 0,15 L min-1. Tag prøver af posen filtrat efter hver liter til efterfølgende analyse (trin 7) og måle turbiditet af posen filtrat pulje som en 1:10 fortynding i ekstraktions buffer ved hjælp af en turbidimeter eller lignende anordning.
  6. Yderligere afklare posen filtrat pulje ved hjælp af 0,02 m2 af en K700 (top) og KS50 (bottom) dybde filter lag kombination per liter pose filtrat pulje. Anvend en strømningshastighed på 3,0 L min-1· m-2 op til et maksimalt tryk på 0,2 MPa. Fjern derefter restpartikler ved at passere det afklarede filtrat gennem et 0,2 μm sterilt filter som tidligere beskrevet5.

4. rensning af DFE Affinity ligand

  1. Forbered et hurtigt protein flydende kromatografi system ved at skylle med elueringsbuffer (10 mM natriumfosfat, 300 mM imidazol, pH 7,4), vaskebuffer (10 mM natriumfosfat, pH 7,4) og equilibrationbuffer (20 mM natriumfosfat, 500 mM natriumchlorid, pH 7,4). Der monteres en søjle med ~ 50 mL chelaterende, tværbundet agateret harpiks pr. kg blad biomasse (~ 2,5 L dybde filtrat).
  2. Kolonnen skal oplades med nikkel ioner ved at anvende 5 kolonne volumener (CV) på 200 mM nikkelsulfat opløsning og vaske den med 5 CV af elueringsbuffer. Brug en strømningshastighed på 50 cm h-1 og Overvåg UV-signalerne ved 260, 280 og 558 nm for alle efterfølgende kromatografi trin.
  3. Ækvibrere søjlen med 10 CV af ækvibrationsbuffer. Indlæs derefter 50 CV af det afklarede planteekstrakt (fra trin 3,6) på den konditionerede kolonne.
  4. Vask søjlen med 10 CV af vaskebuffer. Elute DFE-fusions proteinet med 5 CV-elueringsbuffer og Saml den produkt indeholdende fraktion, når UV-signalerne ved 280 Nm og 558 nm er steget til mere end 5 mAU over basislinjen.
  5. Der udtages en 0,2 mL prøve fra elueringsfraktionen for at måle koncentrationen af total opløselig protein (TSP) (trin 7,1), DFE-koncentration (trin 7,2 og 7,3) og DFE-renhed (trin 7,4).
  6. En kolonne, der indeholder ~ 50 mL tværbundet dextran harpiks, monteres på et kromatografi system. Kolonnen med 5 CV af koblings buffer (200 mM HEPES, 500 mM natriumchlorid, pH 8,5) er ækvibreret. 10 mL af DFE-elueringsbrøken (trin 4,4) indsprøjtes for buffer udveksling, og UV-absorbansen overvåges ved 280 og 558 nm.
  7. Den DFE-holdige fraktion opsamles, når UV-signalerne ved 280 Nm og 558 nm er steget til mere end 5 mAU over baseline. Tag en 0,2 mL prøve, og bestem TSP-koncentrationen, DFE-koncentrationen og DFE-renhed (trin 7).
  8. Den rensede DFE-prøve koncentreres (fra trin 4,7) til 15 g L-1 ved hjælp af et centrifugal koncentratorrør ved 3.000 x g ved 4 °c i 30 minutter i en centrifuge. Fortsæt med koblings reaktionen (trin 5).
    Bemærk: DFE-opløsningen opbevares ved 4 °C, hvis koncentrationen eller koblings trinnene ikke kan udføres med det samme.

5. kobling af DFE til den aktiverede, tvær tilknyttede Agopstået harpiks

Bemærk: Den isopropanol, der anvendes til opbevaring af NHS-aktiverede kolonner, må ikke udskiftes, før alt udstyr og alle løsninger til kobling er klar. Lad aldrig kolonnerne løbe tør.

  1. Opsæt et design af eksperimenter (DoE) model til at optimere koblingen af DFE til den aktiverede harpiks, med pH, buffer sammensætning og DFE koncentration som faktorer. Detaljerne i DoE-metoden er beskrevet andetsteds15.
  2. Forbered Affinity ligand-opløsningen (fra trin 4,8) i et koncentrationsområde fra 0,5 til 15 g · L-1 eller som defineret i Doe og opbevar den på is, indtil koblings reaktionen er klar (trin 5,5). Fyld mindst ti 2 mL sprøjter med DFE-opløsningen, og Forbered en adapter til montering af sprøjterne på NHS-aktiverede tvær kædede agopstod kolonner med en seng volumen på 1,0 mL.
  3. For hver 10 kolonner, der anvendes til kobling, klargøre 30 mL deaktiveringsvæske (0,5 M ethanolamin, 0,5 M natriumchlorid, pH 8,3), 30 mL lav-pH opløsning (0,1 M natriumacetat, 0,5 M natriumchlorid, pH 4,0) og 10 mL opbevaringsløsning (0,05 M Dinatriumphosphat , 0,1% (m/v) natriumazid, pH 7,0).
  4. Der fremstilles 20 mL 1 mM saltsyre i et rør, og det inkuberes på is i mindst 20 minutter. Forbered en præcisions skala til at overvåge gennemstrømnings fraktioner for alle trin under koblings reaktionen (trin 5,7).
  5. Åbn en forseglet NHS-aktiveret tvær kædet agopstået kolonne og monter sprøjteadapteren ved spalte indløbet. Undgå, at der kommer luft ind i kolonnen ved at påføre en dråbe buffer på adapter indløbet, før du tilslutter den til sprøjten.
  6. Kolonnen vaskes med 6 mL iskold 1 mM saltsyre (fra trin 5,4) med en strømningshastighed på < 1 mL min-1 og fortsættes straks til trin 5,7.
  7. Injicer 1,5 mL DFE-opløsning (trin 5,2) ved hjælp af en 2 mL sprøjte med en strømningshastighed på < 1 mL min-1 , og saml gennemstrømnings fraktionen på en præcisions skala (trin 5,4) til efterfølgende analyse (trin 7). Forsegl søjlen i begge ender og Inkuber i 15 – 45 minutter ved 22 °C, afhængigt af DoE setup.
  8. Der indsprøjtes 6 ml deaktiveringsvæske efterfulgt af 6 ml lav-ph-opløsning med en strømningshastighed på < 1 ml min-1 for at fjerne ikke-kovalent bundne ligander fra harpiksen. Injicer derefter 6 mL deaktiveringsvæske og Inkuber kolonnen i 15 minutter.
  9. 6 mL lavph-opløsning indsprøjtes i kolonnen efterfulgt af 6 mL deaktiveringsvæske. Injicer derefter yderligere 6 mL lav-pH-opløsning i kolonnen.
  10. 2 mL opbevaringsløsning indsprøjtes i kolonnen og opbevares ved 4 °C.

6. afprøvning af rensning af mAbs fra afklarede planter ekstrakter

  1. Forbered 100 mL af præciseret planteekstrakt indeholdende 2F55 eller supernatanten fra det foretrukne cellebaserede ekspressionssystem, der også indeholder 2f5.
  2. Forbered ligevægt buffer (20 mM natriumfosfat, 500 mM natriumchlorid, pH 7,4), lav-pH elueringsbuffer (0,05 M citrat, 0,05 M natriumchlorid, pH 4,0 – 3,25), og High-ionisk styrke elueringsbuffer (1,0 – 4,0 M magnesium klorid, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
  3. Skyl kromatografisystemet med bufferne. Monter en DFE-tilknytnings kolonne (fra trin 5,10) på kromatografisystemet, og ækvibrere med 5 CV af ækvibrationsbuffer ved en strømningshastighed på 1,0 mL min-1. Overvåge UV-absorbans ved 280 Nm.
    Bemærk: Lastning planteekstrakt eller cellekultur supernatanten på søjlen kan forårsage en stigning i modtrykket. Indstil en højtryks-alarm ved 0,2 MPa for at undgå beskadigelse af kromatografisystemet eller DFE-søjlen.
  4. Læg 80 mL af det afklarede planteekstrakt eller supernatanten (trin 6,1) på søjlen med en strømningshastighed på 0,5 mL min-1 for at sikre en kontakttid på 2 min. Saml gennemstrømnings prøverne i 2 ml fraktioner for genopbygning af banebrydende kurver (trin 7,3). Gennemstrømnings prøverne opbevares ved 4 °C, hvis det ikke er muligt at analysere en umiddelbar prøve.
  5. Vask søjlen med 6 CV af ækvibrationsbuffer. Saml en prøve af vasken i begyndelsen, midten og slutningen af dette trin.
  6. Elute mAb 2F5 med 5 CV med lav-pH-elueringsbuffer eller højionsstyrke-elelueringsbuffer (0,1 M HEPES, 1,25 M magnesiumchlorid, pH 8,0). DFE-fraktionen opsamles, når UV 280 Nm-signalet er steget til 5 mAU over baseline.
    1. Optimer elueringsbufferen for hvert epitope-antistof par. For 2F5, 1,25 M magnesium chlorid opnået en optimal balance mellemprodukt opsving og ligand stabilitet.
      Bemærk: Magnesium klorid opløsningen er tilbøjelig til at blive udfældet. Derfor opløses magnesium klorid i ~ 700 mL vand. HEPES opløses separat i 100 mL vand, og pH justeres til 8,0. Tilsæt opløsningen af opløst magnesiumchlorid til HEPES-opløsningen, og tilsæt vand til en endelig volumen på 1,0 L. PH-værdien må ikke justeres efter opløsning af magnesium klorid, da dette vil medføre udfældning.
  7. Analysér alle prøver taget under trin 6.4 – 6.6 ved hjælp af Bradford-metoden, lithiumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (LDS-side) og overflade Plasmon resonans (SPR) spektroskopi (trin 7).

7. analyse af prøver

  1. Mål TSP-koncentrationen ved hjælp af Bradford-metoden18,19.
    1. I tre eksemplarer afpipetteres 2,5 μL af hver prøve i en enkelt brønd på en 96-brønd plade. Brug otte serumalbumin-standarder (BSA) i tre eksemplarer, der dækker intervallet 0 – 2000 mg · L-1.
    2. Tilsæt 200 μL Bradford reagens til hver brønd og bland ved forsigtigt at pipettere op og ned. Hold pipette niveauet for at undgå dannelse af bobler, der forvrænger den efterfølgende udlæsningen.
    3. Pladen inkubates i 10 minutter ved 22 °C, og absorbansen måles ved 595 nm i et spektrofotometer. TSP-koncentrationen i prøverne beregnes på basis af en standardkurve gennem BSA-referencepunkterne.
  2. Kvantificering af DFE ved fluorimetri
    1. I tre eksemplarer afpipetteres 50 μL af hver prøve i enkelt brønde af en sort 96-brønd med halv-område. Indeholder seks DsRed-standarder, der dækker intervallet 0 – 225 mg · L-1.
    2. Fluorescensen måles to gange ved hjælp af et 530 ± 30 nm excitation-filter og et 590 ± 35 nm-emissions filter i et spektrofotometer. DFE-koncentrationen beregnes i prøverne på basis af en standardkurve gennem DsRed-referencepunkterne.
  3. Mål 2F5 koncentrationen ved SPR spectroskopi20.
    1. Forbered HBS-EP-løbe bufferen (10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfonsyre (HEPES), 3 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 150 mM natriumchlorid, 0,005% v/v Tween-20, pH 7,4) og filter sterilisere det ved at passere det gennem en 0,2 μm vakuum flaske-Top filter. Degas bufferen i 15 min.
    2. Tilslut HBS-EP-løbe bufferen til SPR-instrumentet, før du docerer en carboxymethyleret dextran-overflade chip, og ækvibrere systemet ved hjælp af Prime-funktionen. Start en manuel kørsel med en strømningshastighed på 30 μL min-1 og betonen spån overfladen ved skiftevis at injicere 30 mm saltsyre og 25 mm natriumhydroxid (to injektioner hver) over flow cellerne 1 og 2 ved en strømningshastighed på 30 μl min-1 i 1 min.
    3. Forbered 300 μL af en 500 mg · L-1 protein en opløsning i 10 mm natriumacetat (pH 4,0). Tø hætteglas indeholdende 0,4 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) og 0,1 M NHS og centrifuge ved 16.000 x g i 1 min før blanding 70 ΜL af edc og 70 ΜL af NHS.
    4. Overfør EDC/NHS-blandingen og proteinet en opløsning til 7 mm plastik prøve hætteglas og Placer i prøve stativet. Aktiver den carboxymethylerede dextran-chip overflade ved at injicere EDC/NHS-blandingen over flow cellerne 1 og 2 ved en strømningshastighed på 10 μL min-1 i 10 min.
    5. Par protein A til den aktiverede carboxymethylerede dextran overflade ved at injicere proteinet en opløsning over flowcelle 2 ved en strømningshastighed på 15 μL min-1 i 15 min.
    6. Mens du tilkobling af proteinet A, tø et hætteglas med 1,0 M ethanolaminhydrochlorid (pH 8,5) og centrifugeres ved 16.000 x g i 1 min. Overfør 150 μl til et 7 mm plastik hætteglas, og Anbring det i instrumentet. Når trin 7.3.5 er fuldført, deaktiveres chip overfladen ved at injicere ethanolaminopløsningen over flow cellerne 1 og 2 ved en strømningshastighed på 10 μL min-1 i 7 min.
    7. Tilstand chip overfladen ved skiftevis at injicere 30 mM saltsyre og 25 mM natriumhydroxid (to injektioner hver) over flow cellerne 1 og 2 ved en strømningshastighed på 30 μL min-1 for 0,5 min.
    8. Forbered standarderne for antistof 2F5 i HBS-EP-løbe buffer i en koncentration på 500 μg · L-1 og fortyndede prøver indeholdende 2F5 i HBS-EP til en endelig koncentration i intervallet 20 – 1000 μg · L-1. Injicér prøver og standarder over flow cellerne 1 og 2 ved en strømningshastighed på 30 μL min-1 i 3 min. Injicer en 2F5-standard efter hver 15 prøver.
    9. Træk det relative enheder (RU) signal af flowcelle 1 (reference celle) fra signalet fra flowcelle 2 (målecelle) for hver prøve og Beregn antistofkoncentrationen baseret på RU-signalet på 2F5 standard injektioner.
    10. Efter hver prøve eller standard injektion, regenerere chip overfladen ved at injicere 30 mM saltsyre med en strømningshastighed på 30 μL min-1 for 0,5 min over flow cellerne 1 og 2.
    11. Plot 2F5 koncentrationen for hver gennemstrømnings prøve fra trin 6,4 mod strømmen gennem volumen for at opnå 2F5 banebrydende kurve. Beregn den injicerede mængde 2F5, når 10% af belastningen 2F5 blev nået for at opnå en 10% dynamisk bindings kapacitet (DBC).
  4. Analysér protein prøver på LDS-side.
    1. Åbn en klar-til-brug 4 – 12% BisTris LDS polyacrylamid gel og anbring den i et elektroforese-modul. Overfør 800 mL køre buffer (50 mM MES, 50 mM Tris base, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) ind i modulet og tilsæt 0,5 mL antioxidant opløsning.
    2. I et 1,5 mL reaktions slange blandes 10 μL indlæsnings buffer med 4 μL reduktionsmiddel og 26 μL af protein prøven. Slangen inkubates i en varmeblok i 10 minutter ved 80 °C. Centrifuger røret ved 500 x g i 30 s.
    3. Læg LDS polyacrylamid gel (10 μL prøve pr. vognbane) og læg 5 μL præ-farvet protein standard (10 – 180 kDa) i en separat vognbane.
    4. Luk elektroforese kammeret og Tilslut strømforsyningen. Elektroforesen skal køre i 40 min og ved konstant 200 V.
    5. Tag gelen ud af elektroforese kammeret. Åbn gel kappe og vask gelen i 15 minutter i vand på en shaker ved 19 rpm. Du plette gelen i 1 time i Farvningsopløsningen på en shaker ved 19 rpm.
    6. Destain gelen i 1 time i vand på en shaker ved 19 rpm. Scan gelen ved hjælp af en film scanner.

Representative Results

Udtryk og oprensning af affinitets ligand

Fusions proteinet DFE blev udtrykt i transgene tobaksplanter dyrket i et drivhus. Udbyttet var ~ 120 mg · kg-1 bladmasse med en gennemsnitlig biomasse på ~ 130 g pr. plante. DFE-renheden var < 5% af TSP i rå planteekstrakter før blanchering, men steg til ~ 40% efter varmebehandling ved 70 °C i 1,5 min, hvilket udfældede > 97% af værtscelle proteinerne. Den blanchering trin var let integreret i høst og udvinding rutine (figur 1) og tog mindre end 2 h ekstra tid, herunder opsætning af vandbad. Den samlede restitution af DFE var 23,5 mg kg1 med en renhed på > 90%. De trin, der er ansvarlige for produkt tabet, var blanching, dybde filtrering og IMAC med specifikke tab på henholdsvis 40%, 27% og 45%. Dybden filterkapaciteten var i gennemsnit 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) og dermed i det øvre område af værdier, som er rapporteret i litteraturen21. DFE-udbyttet steg med plantens alder (figur 2).

Immobilisering af Affinity ligand på NHS-aktiverede kromatografikolonner

Under de indledende koblings tests konstaterede vi, at HEPES-buffer (pH 8,3) forøgede koblings effektiviteten til 89 ± 6% (± SD, n = 3) sammenlignet med 78 ± 9% (± SD, n = 3) for den bicarbonatbuffer, som producenten anbefalede. Derfor blev HEPES anvendt til alle efterfølgende koblings eksperimenter. En DoE tilgang blev valgt for at optimere koblings effektiviteten af DFE til NHS-aktiveret Cross-linked agopstået harpiks. Den absolutte mængde af DFE immobiliseret på harpiksen steg med massen af DFE injiceres i kolonnen og plateaued på ~ 15 g · L-1 mens koblings udbyttet faldt kontinuerligt, da der blev injiceret mere DFE (figur 2). Koblings udbyttet blev også > 50% lavere i en sur buffer, hvilket indikerer behovet for at screene for passende koblings betingelser for hvert ligand fra sag til sag. Ideelle betingelser med hensyn til koblings udbytte, absolut mængde af immobiliseret DFE og kolonne omkostninger blev identificeret ved hjælp af den numeriske optimering værktøj af DoE software. De mest ønskværdige betingelser (pH 9,0 og 7,0 mg DFE pr. 1 mL tværbundet agopstået harpiks) var placeret på et stort plateau og var derfor robuste. DFE-molekylerne bevarede deres røde fluorescens selv efter koblingen, og farveintensiteten svarede til den totale mængde immobiliseret DFE (figur 2). Derfor kan kolonne farve bruges som en simpel kvalitetskontrol parameter til at estimere koblings effektiviteten og kolonne kvaliteten. Fluorescensen bekræftede også, at DFE fusion protein samlet i den tetrameriske tilstand af indfødte DsRed.

Figure 2
Figur 2: optimering af DFE immobilisering til NHS-aktiveret tværbundet agopstået harpiks. A) LDS-paa gel med Western blot overlay af homogeniterings-og elueringsproever fra ublancherede og blancherede TRANSGENE DFE-planteekstrakter. Høst af planter blev udført 38, 45 eller 52 dage efter såning. Western blots blev udført ved hjælp af en anti-hans6-antistoffer5. B) samlet mængde koblet DFE-affinitets ligand i afhængighed, hvis koblings-ph og den samlede masse af renset DFE INJICERES på NHS-aktiverede tvær tilknyttede aghas-kolonner. Røde prikker angiver de faktiske eksperimenter, der er udført for at opbygge respons overflade modellen. (C) DFE-tilknytningskolonner efter koblings proceduren. Numrene svarer til de koblings betingelser, som er fremhævet i panel B. DPS = dage efter såning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Test 2F5 isolation ved hjælp af DFE affinitet harpiks

Det rekombinante 2F5-antistof blev transitivt fremstillet i Nicotiana benthamiana -planter dyrket i en phytotron5. Erobringen af 2F5 fra den rå planteekstrakt blev testet ved hjælp af affinitets kolonner kombineret med ~ 7,0 mg renset DFE (trin 6). Eluering fra protein A harpiks indebærer normalt en sur buffer (pH ~ 3,3)13. Derfor evaluerede vi i første omgang forskellige lavph-elueringsbuffere (pH 6.0 – 3,25) for DFE-kolonnerne. Elueringen af 2F5 lykkedes ved pH-værdier under 4,5 med den højeste bedring på ~ 35% ved pH 3,25. Imidlertid inaktiverede Low-pH eluering både antistoffet (som bekræftet af SPR spectrometri) og DFE ligand (som indikeret ved tab af farve og den nedre DBC, figur 3). Sidstnævnte blev forudset i betragtning af, at de indfødte dsred denaturerede ved pH < 4,022,23. For at undgå produkt-og ligand-denaturering testede vi magnesiumchlorid som et alternativt elueringsmiddel, fordi det tidligere er blevet brugt til at belyse mAbs fra andre affinitets harpiks24. En koncentration af magnesiumchlorid på 1,25 M var tilstrækkelig til at elueres 2f5 fra DFE affinitets harpiks med et opsving på 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhed på 97 ± 3% (± SD, n = 3). Denne præstation var sammenlignelig med protein A harpiks25,26. Ligevægts dissociations konstanten (KD) af DFE-renset 2F5-antistof og det syntetiske ligand Fuzeon var 791 PM, hvorimod et protein a-renset modstykke var 763 PM5. Desuden blev der ikke observeret noget væsentligt farvesab i harpiksen over i alt 25 binde-og elutecyklusser. DBC af DFE affinitet harpiks ved 10% 2F5 gennembrud faldt lineært i løbet af 25 cyklusser til ~ 15% af den oprindelige værdi (figur 3).

Figure 3
Figur 3: afprøvning af isoleringen af 2F5 fra afklarede planteekstrakter ved hjælp af DFE-affinitets harpiks. (A) DFE-affinitets harpiks efter en elueringscyklus med buffere med forskellige pH-værdier i området 4,0 – 3,0 og den samme harpiks efter et neutraliserings trin ved pH 6,0. B) DFE-affinitets harpiks efter en og seks cyklusser med 2F5 rensning med 1,25 m eller 4,00 m magnesiumchlorid som eluent. C) kromatogrammer af forsøg til frontal lastning (gennembryde kurver) til bestemmelse af den cyklus afhængige dynamiske bindingsevne for DFE-harpiks ved hjælp af magnesiumchlorid som eluent. De gennembrud kurver blev målt for 4,0 M og 1,25 M magnesiumchlorid elueringsbuffere og forskellige cyklus numre. D) cyklus afhængig dynamisk bindingsevne for DFE med 1,25 M magnesiumchlorid som eluent. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Anvendelser af den nye affinitets harpiks

Vi har vist, at brugerdefinerede affinitets kromatografi harpiks til opsamling af MABS kan fremstilles ved at immobilisere en ligand indeholdende en Mab-specifik epitop til NHS-aktiveret Cross-linked agopstod. At designe en sådan harpiks, var det nødvendigt at kende epitop sekvens og til at bruge en lineær epitop. De resulterende harpiks er fordelagtige for erobring af mAbs, fordi de potentielt kunne erstatte dyre protein en affinitets kromatografi trin. Interaktionen mellem 2F5 og DFE i vores casestudie blev medieret af epitope – paratope binding, så vores ligand bør være mere selektiv end protein A, som binder til FC-regionen af de fleste murine og humane IgGs. Fordi individuelle ligander er nødvendige for hver Mab, kan vores metode i første omgang synes egnet primært til antistoffer, der produceres på en meget stor skala. Men ved at kombinere vores tilgang med hurtige plante-baserede forbigående protein udtryk, kan nye affinitets ligander forberedes på mindre end 2 uger27 med minimal indsats28. Derfor er metoden også velegnet til små mAb rensning.

Produktion og potentielle forbedringer af affinitets ligand

Planter tilbyder en hurtig og sikker produktionsplatform for Affinity ligander5,29,30, såsom DFE fusion protein featured i vores casestudie. Blanching plantematerialet reducerede i høj grad mængden af værtscelle proteiner i et enkelt trin og blev let integreret i en standard afklarings rutine. Men, inddrivelse af ligand var lav i den nuværende opsætning, sandsynligvis på grund af sin moderat termisk stabilitet og nogle ikke-specifik binding til filter lagene, som rapporteret for andre produkter31,32,33. Ingeniør luftfartsselskabet til at øge sin termiske stabilitet kan derfor bidrage til at forbedre ligand udbytte i fremtiden, som beskrevet for malariavaccine kandidat CCT, antitumor enzym PpADI eller en mesofile β-glucosidase34, 35af36. Det samme gælder for dybde filtrerings trinnet, hvor protein teknik kan medvirke til at reducere den ikke-specifikke binding til Filtermaterialet37. Produktionsomkostningerne for DFE og lignende ligander kunne også reduceres ved at forbedre den generelle effektivitet af præciseringen ved hjælp af flokkulanter eller filter additiver38,39.

Når DsRed bruges som transportør, danner det et tetramerisk kompleks. Dette er fordelagtigt, fordi det øger antallet af epitoper per ligand, men det kan også gøre ligand mere modtagelig for demontering eller denaturering under affinitets kromatografi. Et monomere bære protein som mcherry kan derfor være at foretrække, fordi det er stabilt ved lav pH-værdi40, og inkluderingen af tandem gentagelser af epitop vil øge lydens aviditet og dermed øge harpiks kapaciteten5, 26 , 41. for simple bære-epitope proteiner (dvs. dem uden disulfid obligationer eller post-translationelle modifikationer) mikrobielle produktionssystemer kan reducere fremstillingsomkostningerne og gøre ligander mere konkurrencedygtige med protein A. For eksempel er grøn fluorescerende protein blevet udtrykt i bakterieceller med et afkast på ~ 1 g · kg-1 biomasse, hvilket i væsentlig grad ville reducere ligand produktionsomkostninger42.

Uanset udtryks værten, en renset affinitet ligand var påkrævet under koblingen for at minimere immobilisering af Host celle proteiner eller mediekomponenter, der ellers kan reducere harpiks selektivitet og kapacitet. Optagelsen af en poly-histidine tag til iMac rensning øget renhed til ~ 90% i et enkelt trin, lette hurtig og billig ligand produktion5,43,44. Fusions tagens position er imidlertid vigtig, fordi den har potentialet til at hæmme epitop binding eller til at inducere spalningen af enten tagget eller epitop fra bæreren45,46.

Immobilisering af Affinity ligand på NHS-aktiverede kromatografikolonner

Immobilisering blev udført manuelt eller ved hjælp af et kromatografi system. De små buffer mængder pr. kolonne syntes at favorisere manuel håndtering (f. eks. på grund af den minimale affaldsmængde). Hvis der er behov for flere/større kolonner, gør kromatografisystemet imidlertid det lettere at styre koblings forholdene (f. eks. regulerede strømningshastigheder) og er derfor mere tilbøjelige til at opnå reproducerbare resultater med hensyn til DBC. Vores data tyder på, at koblings bufferen og pH har en vigtig effekt på koblings effektiviteten og de samlede kolonne omkostninger. Screenings faktorer, der påvirker koblings reaktionen og justerer dem for hvert bære protein (eller endda for hvert luftfartsselskab – ligand fusion), kan derfor forbedre koblings effektiviteten og harpiks ydeevnen, og vi anbefaler denne fremgangsmåde.

Test 2F5 isolation ved hjælp af DFE affinitet harpiks

Produkt udbytte og renhed er vigtige aspekter af harpiks ydeevne, og i tilfælde af DFE opnåede vi et afkast på 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhed på 97 ± 3% (± SD, n = 3), som er sammenlignelig med ydeevnen af benchmark protein A harpiks25 ,26. En anden vigtig Præstationsindikator for harpiks i almindelighed (og især for dem, der er baseret på Affinity ligands) er DBC ved 10% produkt gennembrud, fordi denne parameter påvirker mængden af harpiks, der kræves for en bestemt proces og dermed omkostningerne. For DFE ligand, den oprindelige DBC var ~ 4 g · L-1 harpiks, som er ~ 13% af den tilsvarende værdi for protein A under lignende betingelser (kun 2 min kontakttid)25,47 men ca. 15 gange højere sammenlignet med andre brugerdefinerede affinitet harpiks såsom anti-FSH-immun affinitet ligand bruger den samme opholdsperiode på 2 min48. Dfe'en af DFE faldt til 15% af startværdien efter 25 binde-og elute cyklusser, hvorimod der kræves mere end 50 cyklusser for samme tab af DBC i kommercielt protein A harpiks49. Det er dog vigtigt at bemærke, at vores luftfartsselskab endnu ikke er blevet optimeret i samme omfang som protein A, som er blevet grundigt undersøgt og forbedret i løbet af de sidste fire årtier8.

Hidtil har vi forbedret harpiks stabilitet og produkt genvinding ved at skifte fra en lav-pH elueringsbuffer til en høj koncentration af magnesiumchlorid (figur 3), som anbefalet i tidligere undersøgelser13. Den karakteristiske røde farve af affiniteten ligand ikke falmer væsentligt under de 25 binde-og-elute cyklusser, så vi spekulerer på, at endogene plante proteaser i de afklarede planteekstrakter31 kan have afkortet og dermed inaktiveret epitop af ligand. Derfor, designe proteaseresistente linkers til at forbinde bæreren og epitop kan bidrage til at opretholde den oprindelige DBC over et udvidet antal cyklusser. I betragtning af den hurtige og enkle ekspression og oprensning af DFE ligand, dens ligetil kobling til kommerciel kromatografi harpiks, og dens fremragende produkt udbytte og renhed, mener vi, at vores metode tilbyder et passende alternativ til protein A for rensning af mAbs og antistof derivater, som ikke binder sig til protein A, især hvis forbedringer af bæreren og linker kan forbedre DBC og ligand stabilitet. Denne antagelse blev understøttet af den lille forskel i dissociationskonstant af DFE-renset og protein A-renset 2F5 antistof5, hvilket indikerer, at vores nye affinitet ligand tillader genopretning af høj kvalitet MABS.

Fordele og nuværende begrænsninger af metoden

Produktion af affinitet ligand som en genetisk fusion med et bære protein øger Opløselighed i vandige buffere og dermed kompatibilitet med typiske ligand kobling betingelser. I modsætning hertil kan blind peptider afledt af fast fase peptidsyntese have begrænset opløselighed under disse forhold på grund af deres sekvens50, som ikke kan ændres, fordi det er dikteret af aminosyren sekvens af epitop anerkendt af Mab til renses. Andre har derfor brugt en on-harpiks syntese af peptidligands51. Den statiske bindings kapacitet for den resulterende harpiks var høj (~ 80 g · L-1), men processen med harpiks forberedelse er langvarig, en dynamisk bindende kapacitet blev ikke rapporteret, og den opnåede renhed og nyttiggørelse var lavere end i vores tilgang. En yderligere fordel ved en fusion protein ligand i laboratorieskala er, at ligand og varianter deraf kan hurtigt produceres, renses og testes med minimal indsats i en nem at bruge High-through Expression system52.

De to nuværende begrænsninger af den metode, der præsenteres her, er den lave dynamiske bindingsevne på 3 g · L-1 og dens 90% reduktion i løbet af 25 binde-og-elute cyklusser5. Disse begrænsninger kan håndteres i fremtiden ved at anvende mindre strenge laste betingelser og erstatte den nuværende DsRed carrier med en konstrueret, mere stabil variant hhv. For eksempel har en fordobling af den aktuelle kontakttid fra 2 til 4 minutter potentialet til at fordoble den dynamiske bindings kapacitet, som det blev vist for nogle proteiner A-harpiks26.

Fejlfinding

Følgende tabel fremhæver potentielle problemer, der kan opstå i løbet af denne protokol, og giver tips til, hvordan du løser dem (tabel 1).

Tabel 1: potentielle problemer, der kan opstå, og mulige rettelser.
Protokol trin Problem Retters Lave
1 Planter vokser ikke Kompromitterede vækstbetingelser Kontroller pH og ledningsevne af gødning
Kontroller temperatur og lysforhold
2 og 3 Store mængder af Host celle proteiner er til stede efter ekstraktion Ufuldstændig nedbør Kontroller temperaturen under blanchering
Kontroller omrøringen i blanchbadet
2 og 3 Intet produkt fundet i plante ekstrakten Blanching temperatur for høj Kontroller temperatur og pH under blanchering
pH i blanchering buffer for lav
3 Store stængel-eller bladdele forbliver efter ekstraktion Ufuldstændig blanding i Blender Sørg for, at plantematerialet ikke danner en prop i blenderen
3 Hurtig trykstigning under dybde filtrering Forkert valg af filter og/eller retning Kontroller filtertype og-retning
4 Lille fusionsprotein under eluering/en masse fusionsprotein i gennemstrømnings IMAC-harpiks blev ikke ladet med metalioner Kontroller, om IMAC-harpiksen er korrekt opladet med ioner
Fusion protein mistede Affinity-tagget Undgå intens sollys og høje temperaturer under plantedyrkning
4 Fusionsprotein tabt under koncentrationen Fusionsprotein bundet til membranen Kontroller membran typen
Sørg for, at koncentrationsfaktoren ikke var for høj
5 Lav koblings ydelse Forkert sekvens af tilkoblings reagens tilsætning Kontroller reagenserne etiketter og sekvens af tilsætning
Ukorrekt klargøring af kolonnerne før kobling Kontroller betingelserne for kolonne klargøringen
5 og 6 Lav mAb-ydelse Lavt mAb-udtryk i plante biomassen Test mAb-udtryk i biomasse
Lav ligand tæthed Kontrollere renheden af fusionsprotein præparatet
7 Meget lave/høje proteinkoncentrationer i Bradford assay Bobledannelse under pipettering Check for bobler i 96-brønd palte
7 Lav mAb-koncentration under SPR-måling Kompromitteret protein en chip Sammenlign med resultaterne af standard mAb med kendt koncentration
Ukorrekt prøve fortynding Kontrollér fortyndings hastigheden og buffer-

Tabel 1: fejlfinding.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Ibrahim Al Amedi for at dyrke de transgene tobaksplanter og Dr. Thomas Rademacher for at levere tobaks ekspressions vektoren. Forfatterne ønsker at takke Dr. Richard M. Twyman for redaktionel assistance og Markus Sack for frugtbare diskussioner om DFE Affinity ligand struktur. Dette arbejde blev delvis finansieret af de interne programmer Fraunhofer-Gesellschaft under Grant No. Tiltrække 125-600164 og staten Nordrhein-Westfalen under Leistungszentrum Grant No. 423 "netværksbaseret, adaptiv produktion". Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for rammerne af forsknings uddannelsesgruppen "tumor målrettet lægemiddel levering" Grant 331065168. GE Healthcare støttede offentliggørelsen af denne artikel i åben adgang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 L/20 L Bucket n/a n/a Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
ÄKTApure GE Helthcare 29018226 Chromatography system
Allegra 25R Beckman Coulter 369434 Centrifuge
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Antibody 2G12 Fraunhofer IME n/a Standard for SPR quantification
Blender Waring 800EG Blender
BP-410 Fuhr 2632410001 Bag filter
CanoScan 5600F Canon 2925B009 Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chelating Sepharose FF GE Helthcare 17-0575-01 Chromatography resin
Cond 3320 WTW EKA 3338 Conductometer
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n/a DoE software
Discovery Compfort Gilson F81029 Multichannel pipette
Disodium phosphate Carl Roth GmbH 4984.3 Media component
Diverse bottles Schott Duran n/a Glas bottles
Dri Block DB8 Techne Z381373 Heat block
DsRed Fraunhofe IME n/a Standart
EDTA Carl Roth GmbH 8043.2 Buffer component
EnSpire Perkin Elmer 2390-0000 Plate reader
ETHG-912 Oregon Scientific 086L001499-230 Thermometer
F9-C GE Helthcare 29027743 Fraction collector
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200 Hettich 2400 Centrifuge
HiPrep 26/10 GE Helthcare GE17-5087-01 Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL GE Helthcare 17-0716-01 Chromatography columns
Hydrochloric acid Carl Roth GmbH 4625.1 Buffer component
Imidazole Carl Roth GmbH 3899.2 Buffer component
K700 Pall 5302305 Depth filter layer
KM02 basic IKA n/a Magnetic stirrer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
L/S 24 Masterflex SN-06508-24 Tubing
Lauda E300 Lauda Dr Wobser GmbH Z90010 Immersion circulator
Magnesium chloride Carl Roth GmbH KK36.2 Buffer component
Masterflex L/S Masterflex HV-77921-75 Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm Sartorius 16534K Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter Thermo Fischer Scientific 595-4520 Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate Carl Roth GmbH T111.1 Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels Invitrogen NP0336BOX LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell Invitrogen EI0001 PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer Invitrogen NP0002 Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant Invitrogen NP0005 Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa) Invitrogen 26616 Protein standart
Perforated bucked n/a n/a Blanching
PH 3110 WTW 2AA110 PH meter
PowerPac HC Biorad 1645052 Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich P7837-5MG Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran GE Helthcare 17003301 Chromatography resin
Silicone spoon n/a n/a Spoon
Simply Blue SafeStain Invitrogen LC6060 Gel staining solution
Sodium acetate Carl Roth GmbH 6773.1 Buffer component
Sodium acetate Carl Roth GmbH X891.1 Media component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-100G Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Buffer component
Sodium citrate Carl Roth GmbH HN13.2 Buffer component
Sodium bisulfite Carl Roth GmbH 243973-100G Media component
Sodium phosophate Carl Roth GmbH T877.2 Media component
SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics SPR-AS-HCA SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics n/a SPR device
SSM3 Stuart 10034264 Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L Clatronic n/a Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL B. Braun 4606027V Syringes
Syringe adpter (Union Luer F) GE Helthcare 181112-51 Syringe adapter
TE6101 Sartorius TE6101 Precision scale
Tween-20 (Polysorbate) Merck 8170721000 Buffer component
Unicorn 6.4 GE Helthcare 29056102 Chromatography software
Vacuum bags Ikea 203.392.84 Plant storge
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Vortex-Genie 2 Scientific industries SI-0236 Vortex
XK-26/20 column housing GE Helthcare 28-9889-48 Chromtography column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kesik-Brodacka, M. Progress in biopharmaceutical development. Biotechnology and Applied Biochemistry. 65 (3), 306-322 (2018).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Jayapal, K., Wlaschin, K. F., Hu, W. S., Yap, M. G. S. Recombinant Protein Therapeutics from CHO Cells - 20 Years and Counting. Chemical Engineering Progress. 103, 40-47 (2007).
  4. Kunert, R., Reinhart, D. Advances in recombinant antibody manufacturing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (8), 3451-3461 (2016).
  5. Rühl, C., Knödler, M., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. A linear epitope coupled to DsRed provides an affinity ligand for the capture of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1571, 55-64 (2018).
  6. Edgue, G., Twyman, R. M., Beiss, V., Fischer, R., Sack, M. Antibodies from plants for bionanomaterials. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1462 (2017).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Very-large-scale production of antibodies in plants: The biologization of manufacturing. Biotechnology Advances. 35 (4), 458-465 (2017).
  8. Bolton, G. R., Mehta, K. K. The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnology Progress. 32 (5), 1193-1202 (2016).
  9. Kelley, B. Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads. MAbs. 1 (5), 443-452 (2009).
  10. Brochier, V., Ravault, V. High throughput development of a non protein A monoclonal antibody purification process using mini-columns and bio-layer interferometry. Engineering in Life Sciences. 16 (2), 152-159 (2016).
  11. Arakawa, T., Futatsumori-Sugai, M., Tsumoto, K., Kita, Y., Sato, H., Ejima, D. MEP HyperCel chromatography II: binding, washing and elution. Protein Expression and Purification. 71 (2), 168-173 (2010).
  12. Barroso, T. B., Aguiar-Ricardo, R. J., Roque, A. C. Structural evaluation of an alternative Protein A biomimetic ligand for antibody purification. Journal of Computer-aided Molecular Design. 28 (1), 25-34 (2014).
  13. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography A. 1415, 83-90 (2015).
  14. Sack, M., et al. Functional analysis of the broadly neutralizing human anti-HIV-1 antibody 2F5 produced in transgenic BY-2 suspension cultures. FASEB Journal. 21 (8), 1655-1664 (2007).
  15. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. Journal of Visualized Experiments. (83), 51216 (2014).
  16. Trasatti, J. P., Woo, J., Ladiwala, A., Cramer, S., Karande, P. Rational design of peptide affinity ligands for the purification of therapeutic enzymes. Biotechnology Progress. 34 (4), 987-998 (2018).
  17. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochemical Engineering Journal. 88, 162-170 (2014).
  18. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Current Protocols in Molecular Biology. 76 (Chapter 10), (2006).
  19. Buyel, F. J., Kaever, T., Buyel, J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotchnology and Bioengeneering. 110 (2), 471-483 (2013).
  20. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods in Molecular Biology. 503, 65-88 (2009).
  21. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnology Journal. 9 (3), 415-425 (2014).
  22. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (22), 11984-11989 (2000).
  23. Vrzheshch, P. V., Akovbian, N. A., Varfolomeyev, S. D., Verkhusha, V. V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters. 487 (2), 203-208 (2000).
  24. Firer, M. A. Efficient elution of functional proteins in affinity chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 433-442 (2001).
  25. Pabst, T. M., et al. Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enable milder elution pH and high dynamic binding capacity. Journal of Chromatography A. 1362, 180-185 (2014).
  26. Müller, E., Vajda, J. Routes to improve binding capacities of affinity resins demonstrated for Protein A chromatography. Journal of Chromatography B. 1021, 159-168 (2016).
  27. Shamloul, M., Trusa, J., Vadim, M., Vidadi, Y. Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana. Journal of Visualized Experiments. (86), 51204 (2014).
  28. Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , (2018).
  29. Saxena, L., Iyer, B. K., Ananthanarayan, L. Purification of a bifunctional amylase/protease inhibitor from ragi (Eleusine coracana) by chromatography and its use as an affinity ligand. Journal of Chromatography. B. 878 (19), 1549-1554 (2010).
  30. Kurppa, K., Reuter, L. J., Ritala, A., Linder, M. B., Joensuu, J. J. In-solution antibody harvesting with a plant-produced hydrophobin-Protein A fusion. Plant Biotechnology Journal. 16 (2), 404-414 (2018).
  31. Menzel, S., et al. Optimized Blanching Reduces the Host Cell Protein Content and Substantially Enhances the Recovery and Stability of Two Plant-Derived Malaria Vaccine Candidates. Frontiers in Plant Science. 7 (159), 1-7 (2016).
  32. Yigzaw, Y., Piper, R., Tran, M., Shukla, A. A. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnology Progress. 22 (1), 288-296 (2006).
  33. Menzel, S., et al. Downstream processing of a plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate. Protein Expression and Purification. 152, 122-130 (2018).
  34. Vöpel, N., Boes, A., Edgü, G., Beiss, V. Malaria vaccine candidate antigen targeting the pre-erythrocytic stage of Plasmodium falciparum produced at high level in plants. Biotechnology Journal. 9 (11), 1435-1445 (2014).
  35. Lee, C. W., Wang, H. J., Hwang, J. K., Tseng, C. P. Protein thermal stability enhancement by designing salt bridges: a combined computational and experimental study. PLoS ONE. 9 (11), e112751 (2014).
  36. Zhu, L., Cheng, F., Piatkowski, V., Schwaneberg, U. Protein engineering of the antitumor enzyme PpADI for improved thermal resistance. Chembiochem. 15 (2), 276-283 (2014).
  37. Khanal, O., et al. Contributions of depth filter components to protein adsorption in bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1938-1948 (2018).
  38. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5 (2), 138-142 (2014).
  39. Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. Journal of Visualized Experiments. (110), e53940 (2016).
  40. Fink, D., et al. Ubiquitous expression of the monomeric red fluorescent protein mCherry in transgenic mice. Genesis. 48 (12), 723-729 (2010).
  41. Gagnon, P. Technology trends in antibody purification. Journal of Chromatography A. 1221, 57-70 (2012).
  42. Figueira, M., Laramée, L., Murrell, J. C., Groleau, D., Míguez, C. Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 195-200 (2001).
  43. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in enzymology. 326, 245-254 (2000).
  44. Sainsbury, F., Jutras, P. V., Vorster, J., Goulet, M., Michaud, D. A. Chimeric Affinity Tag for Efficient Expression and Chromatographic Purification of Heterologous Proteins from Plants. Frontiers in Plant Science. 7, 141-141 (2016).
  45. Krupka, M., et al. The Position of His-Tag in Recombinant OspC and Application of Various Adjuvants Affects the Intensity and Quality of Specific Antibody Response after Immunization of Experimental Mice. PLoS ONE. 11 (2), e0148497 (2016).
  46. Goel, A., et al. Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct. Biochimica et Biophysica Acta. 1523 (1), 13-20 (2000).
  47. Tustian, A. D., et al. Development of a novel affinity chromatography resin for platform purification of bispecific antibodies with modified protein a binding avidity. Biotechnology Progress. , (2018).
  48. Zandian, M., Jungbauer, A. An immunoaffinity column with a monoclonal antibody as ligand for human follicle stimulating hormone. Journal of Separation Science. 32 (10), 1585-1591 (2009).
  49. Kelley, B. Very large scale monoclonal antibody purification: the case for conventional unit operations. Biotechnology Progress. 23 (5), 995-1008 (2007).
  50. Petrou, C., Sarigiannis, Y. Ch. 1. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering. S, K. outsopoulos , Woodhead Publishing. Cambridge. 1-21 (2018).
  51. Menegatti, S., et al. Design of protease-resistant peptide ligands for the purification of antibodies from human plasma. Journal of Chromatography A. 1445, 93-104 (2016).
  52. Rademacher, T., et al. Plant cell packs: a scalable platform for recombinant protein production and metabolic engineering. Plant Biotechnology Journal. , 1-7 (2019).

Tags

Biokemi protein A udskiftninger kromatografi harpiks downstream forarbejdning (DSP) design af eksperimenter (DoE) plante-Made Pharmaceuticals (PMPs) primære opsving
Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knödler, M., Rühl, C.,More

Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter