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Biochemistry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी रेजिन के तीव्र विकास के लिए सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस - एक केस स्टडी के रूप में एंटीबॉडी कैप्चर

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59933
Automatic Translation
1,3, 2, 1,3, 1,3
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Sanofi Deutschland GmbH, 3Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Summary

इस प्रक्रिया में, एक DsRed आधारित epitope ligand कच्चे संयंत्र के अर्क या सेल संस्कृति supernatants से monoclonal एंटीबॉडी के कब्जा करने के लिए एक अत्यधिक चयनात्मक आत्मीयता राल का उत्पादन करने के लिए स्थिर है, प्रोटीन ए के लिए एक विकल्प के रूप में.

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) की शुद्धि आमतौर पर प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा हासिल की जाती है, जो समग्र प्रक्रिया लागत के 25% तक के लिए जिम्मेदार हो सकती है। वैकल्पिक, लागत प्रभावी कब्जा कदम इसलिए औद्योगिक पैमाने पर विनिर्माण, जहां एक एकल mAb की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर रहे हैं के लिए मूल्यवान हैं. यहाँ हम एक DsRed आधारित epitope ligand के स्थिरीकरण के लिए एक विधि प्रस्तुत करने के लिए एक पार से जुड़े agarose राल प्रोटीन ए का उपयोग किए बिना कच्चे संयंत्र के अर्क से एचआईवी-neutralizing एंटीबॉडी 2F5 के चयनात्मक कब्जा करने की अनुमति. रैखिक epitope ELDKWA पहले आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed करने के लिए जुड़े थे और संलयन प्रोटीन ट्रांसजेनिक तंबाकू में व्यक्त किया गया था (Nicotiana Tabacum) पौधों स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध करने से पहले. इसके अलावा, सक्रिय पार से जुड़े agarose पर आधारित एक विधि उच्च लिगंड घनत्व, कुशल युग्मन और कम लागत के लिए अनुकूलित किया गया था। पीएच और बफर संरचना और घुलनशील लिगंड एकाग्रता युग्मन प्रक्रिया के दौरान सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर थे, जो एक डिजाइन के प्रयोग में सुधार किया गया था-प्रयोग दृष्टिकोण. जिसके परिणामस्वरूप आत्मीयता राल चुनिंदा एक कच्चे संयंत्र निकालने में लक्ष्य माब बाँध करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था और elution बफर उच्च माब वसूली, उत्पाद गतिविधि और आत्मीयता राल स्थिरता के लिए अनुकूलित किया गया था. विधि आसानी से रैखिक प्रतीक के साथ अन्य एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. नई रेजिन प्रोटीन ए की तुलना में कोमल elution शर्तों की अनुमति देते हैं और भी mAb उत्पादन के लिए एक प्रारंभिक कब्जा कदम की लागत को कम कर सकता है.

Introduction

दवाकी लगभग हर शाखा में रोगों के व्यापक स्पेक्ट्रम के उपचार के लिए जैव-औषधि उत्पाद महत्वपूर्ण हैं . मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) biopharmaceutical बाजार पर हावी है, दुनिया भर में बिक्री के साथ 20202में लगभग 110 अरब डॉलर तक पहुँचने की उम्मीद है. mAbs के लिए इष्ट अभिव्यक्ति मंच चीनी हम्सटर अंडाशय सेल लाइनों, जो आम तौर पर संस्कृति supernatant3,4में 10 जी $एल-1 तक की उच्च mAb titers का उत्पादन कर रहे हैं. तथापि, स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों में mAbs का उत्पादन मध्यम की उच्च लागत और बाँझ किण्वन5की आवश्यकता के कारण महंगा है। वैकल्पिक अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों जैसे पौधों संभावित औद्योगिक विनिर्माण के लिए एक तेज, सरल, कम महंगा और अधिक स्केलेबल दृष्टिकोण प्रदान करतेहैं 6,7.

स्तनधारी सेल संस्कृतियों के साथ जुड़े लागत के अलावा, उत्पाद पर कब्जा करने के लिए प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का व्यापक उपयोग mAbs के औद्योगिक उत्पादन के लिए एक प्रमुख लागत ड्राइवर है। प्रोटीन ए स्वाभाविक रूप से स्टेफिलोकोकस ऑरियस कोशिकाओं की सतह पर पाया जाता है और यह कुछ मौरीन और मानव एंटीबॉडी के टुकड़े क्रिस्टलीय (एफसी) क्षेत्र को बांधता है, जिससे हास्य प्रतिरक्षा प्रणाली से बचने के लिए एक रक्षा तंत्र के रूप में कार्यकरताहै 8। प्रोटीन ए सेल संस्कृति supernatants से mAbs के कब्जा करने के लिए उद्योग सोने के मानक बन गया है और यह भी व्यापक रूप से अनुसंधान समुदाय द्वारा प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अत्यधिक चयनात्मक है, आम तौर पर एक ही कदम8में 95% की mAb शुद्धता को प्राप्त करने . आश्चर्य की बात है कि पिछले दो दशकों में प्रोटीन ए की बिक्री ने mAbs8की बिक्री को बारीकी से प्रतिबिंबित किया है। उत्पादन पैमाने पर निर्भर करता है, प्रोटीन ए की लागत कुल प्रक्रिया लागत का 25% से अधिक के अनुरूप है और इस तरह चिकित्सीय mAbs, जो 2,000 जी-15,9तक हो सकता है के बाजार मूल्य को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, एक समान शुद्धि प्रदर्शन के साथ वैकल्पिक क्रोमैटोग्राफी रेजिन के लिए काफी हद तक उत्पादन लागत को कम करने की क्षमता है, एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा रोगियों की एक बड़ी संख्या के लिए सुलभ बनाने10,11 ,12. इस तरह के विकल्प भी प्रोटीन एक क्रोमैटोग्राफी के नुकसान को दरकिनार कर सकते हैं, कम पीएच पर कठोर elution शर्तों सहित (आमतौर पर;lt;3.5) कि संभावित रूप से conformational परिवर्तन है कि एकत्रीकरण को बढ़ावा देने से गुजरना करने के लिए mAbs पैदा कर सकता है13 . महत्वपूर्ण बात, प्रोटीन ए केवल कुछ आईजीजी उपवर्गों के एफसी क्षेत्र के लिए चयनात्मक है, इसलिए काट दिया बाध्यकारी डोमेन के साथ गैर कार्यात्मक अणुओं को बरकरार उत्पाद5के साथ सह शुद्ध कर सकते हैं, जबकि mAb derivaties जैसे एकल श्रृंखला चर टुकड़े प्रोटीन ए के लिए बिल्कुल भी बाध्य नहीं है।

यहाँ, हम एचआईवी-neutralizing mAb 2F5 अपने रैखिक epitope ELDKWA (एक पत्र एमिनो एसिड कोड)5,14का उपयोग कर कब्जा करने के लिए एक वैकल्पिक संबंध क्रोमैटोग्राफी राल का वर्णन. हम आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed के सी-टर्मिनस के लिए 2F5 epitope जुड़े, जो एक वाहक और रिपोर्टर अणु के रूप में कार्य किया, और जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन डीsRed-2एफ5-ईpitope (DFE) ट्रांसजेनिक तंबाकू में उत्पादन () निकोटिआना टैबाकम) पौधे। DFE एकल कदम स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (IMAC) द्वारा शुद्ध किया गया था. शुद्ध DFE आत्मीयता ligand के एक पार से जुड़े agarose राल पर स्थिरीकरण एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) सक्रिय पार से जुड़े agarose कॉलम का उपयोग रासायनिक युग्मन द्वारा प्राप्त किया गया था. सांख्यिकीय प्रायोगिक डिजाइनों का उपयोग तब स्थिरीकरण प्रक्रिया और युग्मन दक्षता15को अनुकूलित करने के लिए किया गया था . mAb 2F5 के लिए शोधन रणनीति एंटीबॉडी शुद्धता, उपज और लिगंड स्थिरता के संदर्भ में मूल्यांकन किया गया था. प्रोटीन ए के विपरीत, जो एफसी क्षेत्र को बांधता है, DFE 2F5 के पूरक-निर्धारण क्षेत्र से बाध्य है, जो एक बरकरार पैराटोप के साथ अणुओं की शुद्धि सुनिश्चित करता है। हमारी अवधारणा को आसानी से किसी भी mAb के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एक रैखिक epitope के साथ या अन्य पेप्टाइड आधारित आत्मीयता ligands जो आसानी से microarray अध्ययन16द्वारा पहचाना जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: epitope आत्मीयता रेजिन कि कच्चे संयंत्र के अर्क या सेल संस्कृति supernatants से mAbs के कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी के लिए प्रक्रिया प्रवाह योजना. (क) ट्रांसजेनिक तम्बाकू पादपों में आत्मीयता लिगन्ड डीएफई व्यक्त की गई थी। काटे गए पत्तों को समरूपित (ग) से पहले एक ऊष्मा वर्षण चरण (बी) शामिल किया गया था . (छ) कच्चे पौधे के अर्क को बैग निस्पंदन, गहराई निस्पंदन और 0.2 डिग्री ग्राम बाँझ निस्पंदन द्वारा स्पष्ट किया गया था। (ई) DFE तो IMAC द्वारा शुद्ध किया गया था. (एफ , जी) शुद्ध DFE आत्मीयता ligand EDC/NHS सक्रिय पार से जुड़े agarose कॉलम पर स्थिर किया गया था. (ज) टी-डीएनए एन्कोडिंग एंटीबॉडी 2F5 को ले जाने वाले जीवाणु संस्कृतियों का उपयोग फाइटोट्रॉन में उगाए गए एन बेंटमैयाना पौधों (मैं) में क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए किया गया था । (जे) एन तुलामैयाना के पत्तों को काटा गया और संसाधित किया गया जैसा कि डी (K) mAb 2F5 में वर्णित किया गया था , डीएफई एफ़िनिटी कॉलम (एल) का उपयोग करते हुए स्पष्ट उद्धरण से शुद्ध किया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. ट्रांसजेनिक तंबाकू पौधों की खेती

नोट: डी एफ ई संलयन प्रोटीन के डिजाइन और ट्रांसजेनिक पादपों की उत्पादन का वर्णन कहीं और5,17है .

  1. मिट्टी में ट्रांसजेनिक तंबाकू के अंकुरों को अंकुरित करें। पौधों को 1.0 ग्राम के साथ उत्तेजित करें L-1 उर्वरक समाधान. एकल करने के लिए पौधों स्थानांतरण, 100 मिमी x 100 मिमी x 60 मिमी (लंबाई, चौड़ाई, ऊंचाई) बर्तन जब वे $0.04 मीटर के एक व्यास के लिए विकसित.
  2. एक 16-h photoperiod (25/22 डिग्री सेल्सियस प्रकाश / अंधेरे तापमान शासन के साथ एक ग्रीनहाउस में ट्रांसजेनिक तंबाकू पौधों की खेती), 70% सापेक्ष आर्द्रता और एक 1.0 ग्राम के साथ स्वचालित निषेचन के साथ एल-1 उर्वरक समाधान 15 मिनट हर घंटे के लिए.
  3. 7 सप्ताह के बाद, संयंत्र स्टेम के आधार पर चार cotyledon पत्तियों को छोड़कर सभी पत्तियों फसल. तुरंत नीचे वर्णित के रूप में काटा पत्तियों की प्रक्रिया.

2. मेजबान सेल प्रोटीन की गर्मी वर्षा

  1. एक स्टेनलेस स्टील गर्म बर्तन (0.3 मीटर x 0.3 मीटर x 0.3 मीटर) में एक 20 एल काम की मात्रा के साथ एक पानी स्नान सेट करें। प्रारंभ में, 5 एल न्यूनतम-1के प्रवाह के साथ तरल को स्थायी रूप से उत्तेजित करने के लिए जल स्नान में एक चुंबकीय पंप रखें। तापमान नियंत्रण के लिए पानी के स्नान पर एक समायोज्य थर्मोस्टेट माउंट (कदम 2.4 और 2.8).
    चेतावनी: 2.10 तक सभी निम्नचरणों में गर्म तरल की हैंडलिंग शामिल है। थर्मल अछूता दस्ताने और काले चश्मे सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।
  2. पानी के स्नान के लिए deionized पानी के 15 एल जोड़ें और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए तरल गर्मी।
  3. एक चुंबकीय विलोपन पर deionized पानी के 5 एल से भरा एक 10 एल बाल्टी प्लेस. 120 मम की अंतिम सांद्रता में सोडियम फॉस्फेट जोड़ें। 10 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच को 8.14 में समायोजित करें। जब सभी घटकों को भंग कर दिया है, कदम 2.2 से पानी के स्नान के लिए जिसके परिणामस्वरूप केंद्रित blanching बफर (5 एल) जोड़ें.
  4. तापमान 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक पानी स्नान उत्तेजित। यदि आवश्यक हो तो पीएच को 8.14 में समायोजित करने के लिए 10 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करें। आवश्यक तापमान और पीएच तक पहुंचने के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए आंदोलन जारी रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पूरी विधानसभा थर्मल संतुलन में है।
  5. एक 20 एल बाल्टी (0.3 मीटर x 0.3 मीटर x 0.3 मीटर) $ 17 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर deionized पानी से भरा (चरण 2.9 के लिए आवश्यक) तैयार करें।
  6. चरण 1-3 से काटी गई तंबाकू के पत्तों के 400 ग्राम एलिकोट्स तैयार कीजिये। छिद्रित बास्केट (0.2 मीटर x 0.2 मीटर x 0.2 मीटर; pore चौड़ाई कम से कम 0.02 मीटर x 0.02 मीटर) में रखें। पौधे की सामग्री के साथ टोकरी को ओवरफिल करने से बचें या ऊतक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए पत्तियों को बहुत कसकर पैक करें।
  7. पूरी तरह से कदम 2.4 से गर्म blanching बफर में टोकरी डूब और सुनिश्चित करें कि सभी पत्ते तरल सतह के नीचे रहते हैं. यदि आवश्यक हो तो पत्तियों को सतह के नीचे रखने के लिए थर्मोस्टेबल सिलिकॉन चम्मच का उपयोग करें।
  8. ब्लैंचिंग तरल पदार्थ में 1.5 मिनट के लिए तंबाकू के पत्तों को इनक्यूबेट करें, जबकि पंप अभी भी तरल को उत्तेजित कर रहा है। पूरे ऊष्मायन अवधि के दौरान तरल तापमान की निगरानी करें। तंबाकू के पत्तों के साथ पंप इनलेट को अवरुद्ध करने से बचें।
  9. ब्लैंचिंग बफर से तंबाकू के पत्तों की टोकरी निकालें और पत्तियों से अवशिष्ट बफर को 30 s के लिए निकाल दें। टोकरी को ठंडे पानी से भरी बाल्टी में स्थानांतरित करें (चरण 2.5 से) और पत्तियों को 30 s. टोकरी निकालें और ले से पानी निकाल दें homogenization से पहले 30 s के लिए aves (चरण 3).
  10. 2.6 से 2.9 के चरणों को दोहराएँ 2.6 से ताजा alicots के साथ जब तक पूरे काटा बायोमास संसाधित है. लगातार निगरानी और पीएच और पानी के स्नान में blanching बफर के तापमान को समायोजित.
    नोट: Blanched संयंत्र सामग्री बर्फ पर 30 मिनट के लिए संग्रहीत किया जा सकता है जब कई blanching चक्र पूरे बायोमास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं. उबले हुए पत्तों को कम से कम 3 सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सील बैग में भी संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, तत्काल प्रसंस्करण की सिफारिश की है क्योंकि लंबे समय तक भंडारण DFE उपज को कम कर सकते हैं।

3. प्रोटीन निष्कर्षण और स्पष्टीकरण

चेतावनी: निम्नलिखित चरणों में ब्लेड घूर्णन के साथ एक ब्लेंडर शामिल है। ब्लेंडर पोत में काम नहीं करते जब संचालित या मोटर इकाई पर घुड़सवार.

  1. ब्लेन्डिड तंबाकू के पत्तों (चरण 2.9) की 150 ग्राम (वेट द्रव्यमान) को ब्लेंडर पात्र में रखें और 450 एमएल निष्कर्षण बफर (50 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 500 एमएम सोडियम क्लोराइड, 10 एमएम सोडियम डिस्हेल्फाइट, पीएच 7.5) जोड़ें। संयंत्र सामग्री या बफर के spilling को रोकने के लिए ब्लेंडर टोपी कसकर बंद करो.
  2. Homogenize 30 s के लिए 3x के लिए पत्तियों, प्रत्येक नाड़ी के बीच 30 s टूट जाता है के साथ. सुनिश्चित करें कि सभी पत्ते homogenized हैं और कोई भी ब्लेंडर पोत के शीर्ष करने के लिए छड़ी. यदि आवश्यक हो, टूट के दौरान ब्लेंडर खोलने के लिए और नीचे छोड़ देता है कि पोत के ऊपरी भाग पर छड़ी धक्का, एक साफ सिलिकॉन चम्मच का उपयोग कर.
  3. समरूपीकरण के बाद, अनुवर्ती विश्लेषण (चरण 7) के लिए homogenate का 1.0 एमएल नमूना लें।
  4. पर्याप्त आकार के एक पोत में homogenate ले लीजिए (जैसे यदि 1.0 किलो की कुल बायोमास के साथ काम कर रहे हैं, कम से कम एक 5 एल की क्षमता के साथ एक पोत का उपयोग करें). 3.1 से 3.3 चरणों को दोहराएँ जब तक कि सभी हल्के बायोमास homogenized है.
  5. एक फिल्टर माउंट में एक बैग फिल्टर माउंट माउंट माउंट और विधानसभा के नीचे एक और पर्याप्त आकार पोत (देखें 3.4) जगह है. $0.15 L न्यूनतम-1की दर से बैग फ़िल्टर में homogenate लागू करें. बाद के विश्लेषण के लिए प्रत्येक लीटर के बाद बैग छानने के नमूने ले लो (चरण 7) और एक turbidimeter या इसी तरह के उपकरण का उपयोग कर निष्कर्षण बफर में एक 1:10 कमजोर पड़ने के रूप में बैग छानना पूल की turbidity को मापने.
  6. इसके अलावा बैग छानना पूल एक K700 (ऊपर) और KS50 (नीचे) गहराई फिल्टर परत बैग छानना पूल के प्रति लीटर के 0.02 मीटर2 का उपयोग कर स्पष्ट. 0.2 MPa के अधिकतम दबाव तक 3.0 L मिनट-1$m-2 की प्रवाह दर लागू करें। फिर पहले वर्णित5के रूप में एक 0.2 m बाँझ फिल्टर के माध्यम से स्पष्ट छानना पारित करके अवशिष्ट कणों को हटा दें ।

4. DFE आत्मीयता Ligand की शुद्धि

  1. एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली को एल्यूशन बफर (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 300 एमएम इमिडाज़ोल, पीएच 7.4), वॉश बफर (10 एमएम सोडियम फॉस्फेट, पीएच 7.4) और सामिग्रेशन बफर (20 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 500 एमएम सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.4) के साथ तैयार करें। पत्ती बायोमास ($2.5 एल गहराई छानना) के प्रति किलोग्राम पार से जुड़े agaros राल के 50 एमएल युक्त एक स्तंभ माउंट।
  2. 200 एमएम निकल सल्फेट समाधान के 5 कॉलम संस्करणों (सीवी) को लागू करके निकल आयनों के साथ कॉलम को चार्ज करें और इसे 5 सीवी के साथ धो लें। 50 सेमी ज-1 की प्रवाह दर का उपयोग करें और सभी बाद के क्रोमैटोग्राफी चरणों के लिए 260, 280 और 558 एनएम पर यूवी संकेतों की निगरानी करें।
  3. सम्यति बफर के 10 CV के साथ स्तंभ को बराबर कर दें। फिर स्पष्ट संयंत्र निकालने के 50 CV लोड (चरण 3.6 से) वातानुकूलित स्तंभ पर.
  4. 10 CV वॉश बफर के साथ कॉलम धो लें. 5 सीवी एल्यूशन बफर के साथ DFE संलयन प्रोटीन को एल्यूट करें और 280 एनएम और 558 एनएम पर यूवी संकेतों के बाद उत्पाद युक्त अंश एकत्र करें जो आधार रेखा से ऊपर 5 माउ से अधिक हो गया है।
  5. कुल घुलनशील प्रोटीन को मापने के लिए हलना अंश से एक 0.2 एमएल नमूना ले लो (TSP) एकाग्रता (चरण 7.1), DFE एकाग्रता (कदम 7.2 और 7.3), और DFE शुद्धता (चरण 7.4).
  6. एक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली पर पार से जुड़े डेक्सट्रान राल के $ 50 एमएल युक्त एक स्तंभ माउंट। युग्मन बफर (200 मीटर हेप, 500 मीटर सोडियम क्लोराइड, पीएच 8.5) के 5 सीवी के साथ कॉलम को बराबर करें। बफर एक्सचेंज के लिए DFE elution अंश (चरण 4.4) के 10 एमएल इंजेक्शन और 280 और 558 एनएम पर यूवी अवशोषण की निगरानी।
  7. 280 एनएम और 558 एनएम पर यूवी संकेतों के आधार रेखा से ऊपर 5 से अधिक करने के लिए वृद्धि हुई है एक बार DFE युक्त अंश लीजिए। एक 0.2 एमएल नमूना ले लो और TSP एकाग्रता, DFE एकाग्रता, और DFE शुद्धता (चरण 7) का निर्धारण.
  8. शुद्ध DFE नमूना ध्यान केंद्रित (चरण 4.7 से) 15 ग्राम एल-1 एक केन्द्रापसारक संकेन्द्रक ट्यूब पर 3,000 x g पर 3,000 x g पर एक centrifuge में 30 मिनट के लिए 30 मिनट का उपयोग कर. युग्मन प्रतिक्रिया (चरण 5) के साथ जारी रखें।
    नोट: एकाग्रता या युग्मन कदम तुरंत नहीं किया जा सकता है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर DFE समाधान स्टोर।

5. सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड Agarose राल के लिए DFE युग्मन

नोट: NHS-सक्रिय स्तंभों के भंडारण के लिए उपयोग किए गए आइसोप्रोपेनोल को तब तक न बदलें जब तक युग्मन के लिए सभी उपकरण और समाधान तैयार न हो जाएं। कॉलम को कभी भी सूखने न दें।

  1. सक्रिय राल के लिए DFE के युग्मन का अनुकूलन करने के लिए प्रयोगों (DoE) मॉडल का एक डिजाइन सेटअप, पीएच के साथ, बफर संरचना और कारकों के रूप में DFE एकाग्रता. डो विधि के ब्यौरे का वर्णन कहीं और15है .
  2. 0ण्5-15 ह से सांद्रता श्रेणी में आत्मीयता का लण्ड विलयन (चरण 4ण्8) से बनाइये एल-1 या के रूप में DoE में परिभाषित और यह बर्फ पर स्टोर जब तक युग्मन प्रतिक्रिया तैयार है (चरण 5.5). DFE समाधान के साथ कम से कम दस 2 एमएल सिरिंजभर भरें और 1.0 एमएल की एक बिस्तर मात्रा के साथ एनएचएस सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस कॉलम पर सिरिंजों को माउंट करने के लिए एक एडाप्टर तैयार करें।
  3. युग्मन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक 10 स्तंभों के लिए 30 एमएल निष्क्रियण समाधान (0.5 एम एथेनॉलामाइन, 0.5 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 8.3), 30 एमएल कम-पीएच समाधान (0.1 एम सोडियम एसीटेट, 0.5 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 4.0) और 10 एमएल फॉस्फेट समाधान तैयार करें। , 0.1% (m/v) सोडियम azide, पीएच 7.0).
  4. किसी ट्यूब में 1 एमएल हाइड्रोक्लोरिक अम्ल का 20 एमएल तैयार कीजिए और इसे बर्फ पर कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट कीजिए। युग्मन अभिक्रिया के दौरान सभी चरणों के लिए प्रवाह-थ्रू भिन्नों की निगरानी करने के लिए परिशुद्धता पैमाने तैयार कीजिए(चरण 5-7)।
  5. एक सील NHS-सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड agarose स्तंभ खोलें और स्तंभ इनलेट पर सिरिंज एडाप्टर माउंट। किसी भी हवा को सिरिंज से कनेक्ट करने से पहले एडाप्टर इनलेट पर बफर की एक बूंद लागू करके स्तंभ में प्रवेश करने से रोकें।
  6. बर्फ ठंडा 1 एमएल हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 6 एमएल के साथ कॉलम धो लें (चरण 5.4 से) की प्रवाह दर पर;1 एमएल न्यूनतम-1 और तुरंत 5.7 कदम आगे बढ़ें।
  7. DFE समाधान के 1.5 एमएल इंजेक्शन (चरण 5.2) की एक प्रवाह दर पर एक 2 एमएल सिरिंज का उपयोग कर;1 एमएल मिनट-1 और प्रवाह के माध्यम से एक सटीक पैमाने पर अंश इकट्ठा (चरण 5.4) बाद के विश्लेषण के लिए (चरण 7). DoE सेटअप के आधार पर, दोनों सिरों पर कॉलम को सील करें और 22 डिग्री सेल्सियस पर 15-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. 6 एमएल निष्क्रियकरण विलयन का इंजेक्शन दें जिसके बाद 6 एमएल कम-पीएचए घोल की प्रवाह दर पर;1 एमएल न्यूनतम-1 के साथ राल से गैर-सहसंयोजक रूप से बाध्य लिगन्ड्स को हटादिया जाता है। फिर 6 एमएल निष्क्रियकरण समाधान इंजेक्ट करें और स्तंभ को 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. कम-पीएचए समाधान का 6 एमएल स्तंभ में इंजेक्ट करें, जिसके बाद 6 एमएल निष्क्रियकरण समाधान होता है। फिर कॉलम में कम पीएच समाधान का एक और 6 एमएल इंजेक्ट करें।
  10. भंडारण समाधान के 2 एमएल को स्तंभ में इंजेक्ट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. स्पष्ट पौधों के अर्क से mAbs की शुद्धि का परीक्षण

  1. स्पष्ट संयंत्र निकालने के 100 एमएल तैयार 2F55 या पसंदीदा सेल आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली से supernatant युक्त, भी 2F5 युक्त.
  2. साम्य बफर (20 एमएम सोडियम फॉस्फेट, 500 एमएम सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.4), कम-पीएच इल्यूशन बफर (0.05 एम साइट्रेट, 0.05 एम सोडियम क्लोराइड, पीएच 4.0-3.25), और उच्च-आयन-शक्ति इल्यूशन बफर (1.0-4.0 एम मैग्नीस क्लोराइड, 0.00 एमईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईईई0) की तैयारी करें।
  3. क्रोमैटोग्राफी सिस्टम को बफर्स के साथ फ्लश करें। क्रोमैटोग्राफी सिस्टम पर एक डीएफई एफ़िनिटी कॉलम (चरण 5.10 से) माउंट करें और 1.0 एमएल न्यूनतम-1की प्रवाह दर पर 5 सीवी बराबरी बफर के साथ बराबर ी है। 280 एनएम पर यूवी अवशोषण की निगरानी करें।
    नोट: संयंत्र निकालने या स्तंभ पर सेल संस्कृति supernatant लोड हो रहा है backpressure में वृद्धि का कारण बन सकता है. क्रोमैटोग्राफी सिस्टम या DFE स्तंभ को नुकसान से बचने के लिए 0.2 MPa पर एक उच्च दबाव चेतावनी सेट करें।
  4. स्पष्ट संयंत्र निकालने या supernatant के 80 एमएल लोड (चरण 6.1) 0.5 एमएल मिनट-1 की एक प्रवाह दर पर स्तंभ पर 2 मिनट के एक संपर्क समय की गारंटी के लिए. सफलता वक्र पुनर्निर्माण के लिए 2 एमएल अंशों में प्रवाह के माध्यम से नमूने एकत्र (चरण 7.3). तत्काल नमूना विश्लेषण संभव नहीं है, तो प्रवाह के माध्यम से नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. बराबर बफर के 6 CV के साथ कॉलम धो लें. इस चरण के शुरुआत, मध्य और अंत में धोने का एक नमूना ले लीजिए।
  6. Elute mAb 2F5 कम-पीएच elution बफर या उच्च-आयनिक शक्ति elution बफर के 5 CV के साथ (0.1 एम HEPES, 1.25 एम मैग्नीशियम क्लोराइड, पीएच 8.0). यूवी 280 एनएम संकेत आधार रेखा के ऊपर 5 mAU करने के लिए बढ़ गया है जब DFE अंश लीजिए।
    1. प्रत्येक epitope-एंटीबॉडी जोड़ी के लिए elution बफर का अनुकूलन. 2F5 के लिए, 1.25 मैग्नीशियम क्लोराइड उत्पाद वसूली और लिगेंड स्थिरता के बीच एक इष्टतम संतुलन हासिल की.
      नोट: मैग्नीशियम क्लोराइड विलयन से वर्षा होने की संभावना होती है। अतः मैग्नीशियम क्लोराइड को 700 एमएल जल में घोल लें। 100 एमएल जल में HEPES को अलग-अलग भंग करें और पीएच को 8.0 में समायोजित करें। HEPES समाधान के लिए भंग मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान जोड़ें और 1.0 एल के अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें. मैग्नीशियम क्लोराइड भंग करने के बाद पीएच को समायोजित न करें क्योंकि इससे वर्षा होगी।
  7. 6-4-6-6 ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग करते हुए चरण 6-4-6.6 का उपयोग करते हुए उठाए गए सभी नमूनों का विश्लेषण करें, लिथियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीऐक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एलडीएस-पेज) और सतह प्लाज्मोन अनुनाद (एसपीआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी (चरण 7)।

7. नमूना विश्लेषण

  1. ब्रैडफोर्ड विधि18,19का उपयोग करते हुए टीएसपी एकाग्रता को मापें .
    1. त्रिफला में, एक 96-वेल प्लेट के एक कुएं में प्रत्येक नमूने के 2.5 डिग्री सेल्सियस। सीमा को कवर करने में आठ गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) मानकों का उपयोग करें 0-2,000 mg] L-1|
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 डिग्री एल जोड़ें और धीरे ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिश्रण. बाद में readout विकृत कि बुलबुले के गठन से बचने के लिए पिपेट स्तर रखें।
    3. प्लेट को 22 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इन्क्यूबेट करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 595 दउ पर अवशोषण को मापें। बीएसए संदर्भ अंक के माध्यम से एक मानक वक्र के आधार पर नमूनों में TSP एकाग्रता की गणना.
  2. फ्लोरीमिति द्वारा DFE की मात्रा निर्धारित करें
    1. त्रिफला में, एक काले 96-अच्छी तरह से आधा क्षेत्र प्लेट के एकल कुओं में प्रत्येक नमूने के पिपेट 50 डिग्री सेल्सियस। सीमा को कवर छह DsRed मानकों को शामिल करें 0-225 मिलीग्राम] L-1|
    2. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक 530 - 30 एनएम उत्तेजना फिल्टर और एक 590 - 35 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर दो बार फ्लोरोसेंट को मापने। DsRed संदर्भ बिंदुओं के माध्यम से एक मानक वक्र के आधार पर नमूनों में DFE एकाग्रता की गणना करें।
  3. SPR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 2F5 एकाग्रता को मापने20|
    1. HBS-ईपी चल बफर तैयार (10 एम एम 4-(2-hydroxyethyl)-1-पाइपराज़ीनेथेथेनेसल्फोनिक एसिड (HEPES), 3 एमएम एथिलीनडिएमिनटेरेटेरेटिक एसिड (EDTA), 150 एमएम सोडियम क्लोराइड, 0.00% v/ बोतल-शीर्ष फिल्टर. 15 मिनट के लिए बफर Degas.
    2. एक carboxymethylated डेक्सट्रान सतह चिप डॉकिंग और प्रधानमंत्री समारोह का उपयोग कर प्रणाली को बराबर करने से पहले एसपीआर साधन के लिए बफर चल HBS-ईपी कनेक्ट। 30 डिग्री एल मिनट-1 की प्रवाह दर के साथ एक मैनुअल रन शुरू करें और चिप की सतह को बारी-बारी से 30 एमएम हाइड्रोक्लोरिक एसिड और 25 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (दो इंजेक्शन प्रत्येक) प्रवाह कोशिकाओं पर 1 और 2 को 30 डिग्री एल मिनट-1 की प्रवाह दर पर 1 मिनट के लिए इंजेक्शन लगाकर रखें।
    3. 500 मिलीग्राम के 300 [एल] तैयार करें एल-1 प्रोटीन 10 एम सोडियम ऐसीटेट (पीएच 4.0) में एक समाधान। 0.4 एम 1-एथिल-3-(3-डाइमेथिलएमिनोप्रोपिल) कार्बोडिमिड हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) और 0.1 एम एन एच एस और सेंट्रीफ्यूज युक्त 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए ईडीसी के 70 डिग्री एल और एनएचएस के 70 डिग्री एल मिश्रण से पहले।
    4. EDC/NHS मिश्रण और प्रोटीन एक समाधान 7 मिमी प्लास्टिक नमूना शीशियों और नमूना रैक में जगह के लिए स्थानांतरण. प्रवाह कोशिकाओं पर EDC/NHS मिश्रण इंजेक्शन द्वारा carboxyethylated डेक्सट्राइलेट चिप सतह को सक्रिय करें 1 और 2 10 मिनट के लिए 10 $L मिनट-1 की प्रवाह दर पर।
    5. युगल प्रोटीन एक सक्रिय carboxymethylated dextran सतह के लिए 15 मिनट के लिए 15 $L मिनट-1 की एक प्रवाह दर पर प्रवाह सेल 2 पर प्रोटीन एक समाधान इंजेक्शन द्वारा.
    6. प्रोटीन ए युग्मन करते समय, 1.0 एम इथेनॉल हाइड्रोक्लोराइड (पीएच 8.5) की शीशी और 1 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र 150 डिग्री सेल्सियस को 7 मिमी प्लास्टिक की शीशी में डाल दें और उपकरण में जगह लें। जब चरण 7.3.5 पूरा हो गया है, तो 7 मिनट के लिए 10 डिग्री एल मिनट-1 की प्रवाह दर पर एथेथेनॉलामाइन समाधान को प्रवाह कोशिकाओं 1 और 2 पर इंजेक्शन लगाकर चिप की सतह को निष्क्रिय कर दें।
    7. चिप की सतह को बारी-बारी से 30 एमएल हाइड्रोक्लोरिक एसिड और 25 एमएम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (दो इंजेक्शन प्रत्येक) प्रवाह कोशिकाओं पर 1 और 2 को 0.5 मिनट के लिए 30 डिग्री एल मिनट-1 की प्रवाह दर पर इंजेक्शन लगाकर सतह की स्थिति।
    8. HBS-EP में एंटीबॉडी 2F5 के मानकों को तैयार 500 [g] की एकाग्रता पर बफर चल रहा है एल-1 और HBS-EP में 2F5 युक्त नमूनों को पतला करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता में सीमा 20-1,000 [g] L-1| प्रवाह कोशिकाओं पर नमूनों और मानकों को इंजेक्शन 1 और 2 30 $L मिनट-1 के लिए 3 मिनट की प्रवाह दर पर. हर 15 नमूनों के बाद एक 2F5 मानक इंजेक्शन.
    9. प्रत्येक नमूने के लिए प्रवाह सेल 2 (माप कोशिका) के संकेत से सापेक्ष इकाइयों (आरयू) संकेत घटाना और 2F5 मानक इंजेक्शन के आरयू संकेत के आधार पर एंटीबॉडी एकाग्रता की गणना।
    10. हर नमूना या मानक इंजेक्शन के बाद, प्रवाह कोशिकाओं 1 और 2 पर 0.5 मिनट के लिए 30 डिग्री एल मिनट-1 की प्रवाह दर पर 30 एमएल हाइड्रोक्लोरिक एसिड इंजेक्शन द्वारा चिप सतह पुनर्जीवित।
    11. 2F5 सफलता वक्र प्राप्त करने के लिए मात्रा के माध्यम से प्रवाह के खिलाफ चरण 6.4 से प्रत्येक प्रवाह के माध्यम से नमूना के लिए 2F5 एकाग्रता प्लॉट. इंजेक्शन की राशि की गणना 2F5 जब 10% लोड हो रहा है 2F5 एकाग्रता के 10% गतिशील बाध्यकारी क्षमता (DBC) प्राप्त करने के लिए पहुँच गया था.
  4. LDS-पेज द्वारा प्रोटीन के नमूने का विश्लेषण करें.
    1. एक तैयार करने के लिए उपयोग 4-12% BisTris LDS polyacrylamide जेल खोलें और यह एक electrophoresis मॉड्यूल में जगह है. बफर चलाने के 800 एमएल स्थानांतरण (50 एम एम एम MES, 50 एम एम Tris आधार, 0.1% (m/v) एसडीएस, 1 एमएम EDTA, पीएच 7.3) मॉड्यूल में और एंटीऑक्सीडेंट समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें.
    2. 1ण्5 एमएल अभिक्रिया नली में बफर लोड करने के 10 ल् को कम करने वाले एजेंट के 4 डिग्री सेल्सियस तथा प्रोटीन नमूने के 26 डिग्री सेल्सियस के साथ मिलाइए। ट्यूब को 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ऊष्मा खंड में इनक्यूबेट करें। 30 s के लिए 500 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    3. एलडीएस पॉलीऐक्रिलमाइड जेल (10 डिग्री सेल्सियस प्रति लेन नमूना) लोड करें और एक अलग लेन में पूर्व-सना हुआ प्रोटीन मानक (10-180 केडीए) का 5 डिग्री सेल्सियस लोड करें।
    4. इलेक्ट्रोफोरोसिस चैम्बर को बंद करें और बिजली की आपूर्ति को कनेक्ट करें। इलेक्ट्रोफोरोसिस 40 मिनट और निरंतर 200 ट पर चलाना चाहिए।
    5. इलेक्ट्रोफोरोसिस चैम्बर से जेल निकालें। जेल म्यान खोलो और 19 आरपीएम पर एक शेकर पर पानी में 15 मिनट के लिए जेल धो लें। 19 आरपीएम पर एक शेकर पर धुंधला समाधान में 1 एच के लिए जेल दाग.
    6. 19 आरपीएम पर एक शेकर पर पानी में 1 एच के लिए जेल को बंद करें। एक फिल्म स्कैनर का उपयोग कर जेल स्कैन करें।

Representative Results

आत्मीयता की अभिव्यक्ति और शुद्धि ligand

संलयन प्रोटीन DFE एक ग्रीनहाउस में बड़े ट्रांसजेनिक तंबाकू पौधों में व्यक्त किया गया था. प्रति पाद130 ग्राम औसत बायोमास के साथ उपज 120 मिग-1 पर्पज-1 पत्ती द्रव्यमान थी। डीएफई शुद्धता को ब्लैंचिंग से पहले कच्चे पौधे के अर्क में टीएसपी का 5% था, लेकिन 1.5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के उपचार के बाद $40% तक बढ़ गया, जो मेजबान सेल प्रोटीन के 97% वेग से हुआ। ब्लैंचिंग कदम आसानी से कटाई और निष्कर्षण दिनचर्या में एकीकृत किया गया था (चित्र 1) और पानी स्नान की स्थापना सहित अतिरिक्त समय के कम से कम 2 एच लिया। DFE की समग्र वसूली 23.5 मिलीग्राम किलो1 की शुद्धता के साथ था gt;90%. उत्पाद हानि के लिए जिम्मेदार कदम ब्लैंचिंग, गहराई निस्पंदन और IMAC थे, क्रमशः 40%, 27% और 45% की विशिष्ट हानि के साथ। गहराई फिल्टर क्षमता औसत 135 पर था - 36 एल मीटर-2 (जेडएसडी, n $3) और इस प्रकार साहित्य21में रिपोर्ट मूल्यों की ऊपरी श्रेणी में . पौधे की आयु के साथ DFE की उपज में वृद्धि हुई (चित्र 2)।

एन एच एस सक्रिय क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर आत्मीयता का अचलीकरण

प्रारंभिक युग्मन परीक्षणों के दौरान, हमने पाया कि HEPES बफर (पीएच 8.3) के लिए युग्मन दक्षता में वृद्धि हुई 89 - 6% (जेडएसडी, n $3) की तुलना में 78 - 9% (जेडएसडी, n $3) निर्माता द्वारा सिफारिश की बाइकार्बोनेट बफर के लिए. इसलिए, HEPES सभी अनुवर्ती युग्मन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक DOE दृष्टिकोण NHS सक्रिय पार से जुड़े agarose राल करने के लिए DFE के युग्मन दक्षता का अनुकूलन करने के लिए चुना गया था। DFE की निरपेक्ष राशि राल पर स्थिर DFE के द्रव्यमान के साथ वृद्धि हुई DFE स्तंभ में इंजेक्शन और [15 ग्राम] पर plateauted ल-1 जबकि युग्मन उपज में लगातार गिरावट आई क्योंकि अधिक डीएफई इंजेक्ट किया गया था (चित्र 2) । युग्मन उपज भी एक अम्लीय बफर में कम था, एक मामला-दर-मामला आधार पर प्रत्येक लिगन्ड के लिए उपयुक्त युग्मन स्थितियों के लिए स्क्रीन करने की आवश्यकता का संकेत. युग्मन उपज के मामले में आदर्श स्थितियों, स्थिर DFE और स्तंभ लागत की पूर्ण मात्रा DoE सॉफ्टवेयर के संख्यात्मक अनुकूलन उपकरण का उपयोग कर की पहचान की गई. सबसे वांछनीय शर्तों (पीएच 9.0 और 7.0 DFE के प्रति 1 एमएल पार से जुड़े agarose राल की मिलीग्राम) एक बड़े पठार पर स्थित थे और इसलिए मजबूत थे. DFE अणुओं युग्मन के बाद भी अपने लाल फ्लोरोसेंट बनाए रखा, और रंग तीव्रता स्थिर DFE की कुल राशि के अनुरूप (चित्र 2). इसलिए, स्तंभ रंग युग्मन दक्षता और स्तंभ गुणवत्ता का अनुमान लगाने के लिए एक साधारण गुणवत्ता नियंत्रण पैरामीटर के रूप में उपयोग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट भी पुष्टि की है कि DFE संलयन प्रोटीन देशी DsRed के टेट्रामेरिक राज्य में इकट्ठे हुए.

Figure 2
चित्र 2: एन एच एस-सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस राल के लिए डीएफई स्थिरीकरण का अनुकूलन। (क) एलडीएस-पीएए जेल में होमोजेनेट और एल्यूशन के नमूनों के पश्चिमी दाग ओवरले के साथ अनब्लेंकिड और ब्लेंक्ड ट्रांसजेनिक डीएफई संयंत्र के अर्क से। पौधों की कटाई 38, 45 या 52 दिनों के बाद बोई गई थी। पश्चिमी धब्बा एक विरोधी His6-एंटीबॉडी5का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. (ख) यदि युग्मन पीएच और शुद्ध डीएफई के समग्र द्रव्यमान को एन एच-सक्रिय क्रॉस-लिंक्ड अगारोस कॉलमों पर इंजेक्ट किया जाए तो निर्भरता में युग्मित डीएफई एफ़िनिटी लिगन्ड की कुल मात्रा। लाल बिंदु प्रतिक्रिया सतह मॉडल बनाने के लिए किए गए वास्तविक प्रयोगों को इंगित करते हैं। (C) युग्मन प्रक्रिया के बाद DFE एफ़िनिटी कॉलम. संख्या पैनल बी dps में प्रकाश डाला युग्मन शर्तों के अनुरूप ] दिन बीज बोने के बाद. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

DFE आत्मीयता राल का उपयोग कर 2F5 अलगाव परीक्षण

पुनः संयोजक 2 F5 एंटीबॉडी एक फाइटोट्रॉन5में उगाए गए निकोटिआना बेंटहामेना पौधों में क्षणिक रूप से उत्पादित किया गया था . कच्चे संयंत्र निकालने से 2F5 का कब्जा आत्मीयता कॉलम के साथ युग्मित का उपयोग कर परीक्षण किया गया था $7.0 मिलीग्राम शुद्ध DFE (कदम 6). प्रोटीन ए रेजिन से Elution आमतौर पर एक अम्लीय बफर शामिल है (पीएच $3.3)13. इसलिए, हम शुरू में DFE स्तंभों के लिए विभिन्न कम-pH elution बफ़र्स (pH 6.0-3.25) मूल्यांकन किया. 2F5 के elution पीएच 3.25 पर $ 35% की उच्चतम वसूली के साथ 4.5 से नीचे पीएच मूल्यों पर सफल रहा था. हालांकि, कम पीएच elution दोनों एंटीबॉडी निष्क्रिय (के रूप में एसपीआर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुष्टि की) और DFE ligand (के रूप में रंग की हानि और कम डीबीसी, चित्रा 3द्वारा संकेत दिया). बाद में यह अनुमान लगाया गया था कि पीएच एंड एल टी ;4.022,23में देशी डी. उत्पाद और लिगन्ड विकृतीकरण से बचने के लिए, हमने मैग्नीशियम क्लोराइड को एक वैकल्पिक एल्यूशन एजेंट के रूप में परीक्षण किया क्योंकि इसका उपयोग पहले अन्य एफ़िनिटी रेजिन24से एमएबीएस को दूर करने के लिए किया गया है। 1.25 एम की एक मैग्नीशियम क्लोराइड एकाग्रता 105 की वसूली के साथ DFE आत्मीयता राल से 2F5 को पूरा करने के लिए पर्याप्त था - 11% (जेडएसडी, n $3) और 97 की शुद्धता $ 3% (जेडएसडी, n $3).। यह प्रदर्शन प्रोटीन ए रेजिन25,26के बराबर था . डफ-शुद्ध 2F5 एंटीबॉडी का संतुलन वियोजन स्थिरांक (KD) और संश्लेषी लिगंड फुज़ॉन 791 प्रम था जबकि प्रोटीन ए-शुद्ध प्रतिपक्ष का 763 चम5था । इसके अलावा, कोई पर्याप्त रंग हानि 25 बाँध और elute चक्र की कुल पर राल में मनाया गया. DFE आत्मीयता राल के DBC 10% 2F5 सफलता पर रैखिक रूप से 25 चक्र के दौरान गिर गया $15% प्रारंभिक मूल्य का (चित्र3)।

Figure 3
चित्र3: DFE आत्मीयता रेजिन का उपयोग कर स्पष्ट संयंत्र अर्क से 2F5 के अलगाव का परीक्षण. (ए) DFE आत्मीयता रेजिन एक elution चक्र के बाद रेंज 4.0-3.0 में विभिन्न पीएच मूल्यों के साथ बफ़र्स का उपयोग कर और एक ही रेजिन pH 6.0 पर एक तटस्थ कदम के बाद. (ख) डीएफई एफ़िनिटी रेजिन 2 F5 शुद्धिकरण के एक और छह चक्रों के बाद 1ण्25 एम या 4.00 एम मैग्नीशियम क्लोराइड को एलुएंट के रूप में उपयोग करते हुए। (ग) ललाट लोडिंग प्रयोगों (ब्रेक-थ्रू वक्रों) के क्रोमैटोग्राम, डी एफ ई रेजिन की चक्र-निर्भर गतिशील बाइंडिंग क्षमता का निर्धारण करने के लिए मैग्नीशियम क्लोराइड को एलुएंट के रूप में उपयोग करते हैं। ब्रेक-थ्रू वक्रों को 4.0 एम और 1.25 एम मैग्नीशियम क्लोराइड एल्यूशन बफर्स और विभिन्न चक्र संख्याओं के लिए मापा गया था। (छ) डी एफ ई की चक्र-निर्भर गतिशील बाइंडिंग क्षमता 1ण्25 एम मैग्नीशियम क्लोराइड का उपयोग करते हुए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

उपन्यास आत्मीयता राल के आवेदन

हमने दिखाया है कि mAbs के कब्जा करने के लिए कस्टम आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी रेजिन NHS-सक्रिय पार से जुड़े agarose के लिए एक mAb-विशिष्ट एपिटोप युक्त एक ligand immobilizing द्वारा निर्मित किया जा सकता है। इस तरह के एक राल डिजाइन करने के लिए, यह epitope अनुक्रम पता करने के लिए और एक रैखिक epitope का उपयोग करने के लिए आवश्यक था। जिसके परिणामस्वरूप रेजिन mAbs के कब्जा करने के लिए फायदेमंद हैं क्योंकि वे संभावित महंगा प्रोटीन एक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कदम बदल सकता है. हमारे मामले के अध्ययन में 2F5 और DFE के बीच बातचीत epitope-पैराटोप बाध्यकारी द्वारा मध्यस्थता की गई थी, तो हमारे ligand प्रोटीन ए से अधिक चयनात्मक होना चाहिए, जो सबसे murine और मानव IgGs के एफसी क्षेत्र के लिए बांध. क्योंकि व्यक्तिगत ligands प्रत्येक mAb के लिए आवश्यक हैं, हमारी विधि शुरू में एंटीबॉडी है कि एक बहुत बड़े पैमाने पर उत्पादित कर रहे हैं के लिए मुख्य रूप से उपयुक्त लग सकता है. हालांकि, तेजी से संयंत्र आधारित क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ हमारे दृष्टिकोण के संयोजन के द्वारा, नई आत्मीयता ligands कम से कम 2 सप्ताह27 में कम से कम प्रयास28के साथ तैयार किया जा सकता है. इसलिए, विधि भी छोटे पैमाने पर mAb शुद्धि के लिए उपयुक्त है.

उत्पादन और आत्मीयता के संभावित सुधार ligand

पौधे आत्मीयता के लिए एक तेज और सुरक्षित उत्पादन मंच प्रदानकरतेहैं 5 ,29,30, जैसे कि हमारे मामले के अध्ययन में विशेष रुप से प्रदर्शित डीएफई संलयन प्रोटीन. संयंत्र सामग्री blanching बहुत एक ही कदम में मेजबान सेल प्रोटीन की मात्रा कम है और आसानी से एक मानक स्पष्टीकरण दिनचर्या में एकीकृत किया गया. हालांकि, लिगन्ड की वसूली वर्तमान सेटअप में कम थी, शायद इसकी मध्यम थर्मल स्थिरता और फिल्टर परतों के लिए कुछ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के कारण, जैसा कि अन्य उत्पादों के लिए31,32,33की सूचना दी गई है। इंजीनियरिंग वाहक अपनी थर्मल स्थिरता बढ़ाने के लिए इसलिए भविष्य में लिगेंड उपज में सुधार करने में मदद मिल सकती है, के रूप में मलेरिया टीका उम्मीदवार सीसीटी के लिए वर्णित, antitumor एंजाइम PpADI या एक mesophilic -glucosidase34, 35,36. एक ही गहराई निस्पंदन कदम है, जहां प्रोटीन इंजीनियरिंग फिल्टर सामग्री37के लिए गैर विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने में मदद कर सकते हैं के लिए सच रखती है. डी एफ ई और इसी प्रकार के लिगन्डों की उत्पादन लागत को भी फ्लक्युलेन्ट्स या फिल्टर एडिटिव्स38,39का उपयोग करके स्पष्टीकरण की समग्र दक्षता में सुधार करके कम किया जा सकता है .

जब DsRed एक वाहक के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह एक tetrameric परिसर रूपों. यह फायदेमंद है क्योंकि यह ligand प्रति epitopes की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन यह भी ligand अधिक संबंध क्रोमैटोग्राफी के दौरान disassembly या विकृतीकरण के लिए अतिसंवेदनशील प्रदान कर सकते हैं. एक एकलवाहक वाहक प्रोटीन जैसे कि एम चेरी इसलिए बेहतर हो सकता है , क्योंकि यह कम पीएच40पर स्थिर है , और एपिटोप के अग्रानुक्रम दोहरावों को शामिल करने से लिगन्ड की उत्सुकता में वृद्धि होगी और इस प्रकार राल क्षमता में वृद्धिहोगी 5, 26 , 41.सरल वाहक-एपिटोप प्रोटीन के लिए (यानी, जिनके पास कोई डिसल्फाइड बांड या पोस्ट-अनुवाद संशोधन नहीं है) माइक्रोबियल उत्पादन प्रणालियां विनिर्माण लागतको कम कर सकती हैं और प्रोटीन ए के साथ लिगन्ड्स को अधिक प्रतिस्पर्धी बना सकती हैं। उदाहरण के लिए, जीवाणु कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 1 ग्राम-1 बायोमास की उपज के साथ व्यक्त किया गया है, जिससे लिगन्ड उत्पादन लागत42में काफी कमी आएगी।

अभिव्यक्ति मेजबान की परवाह किए बिना, एक शुद्ध आत्मीयता ligand युग्मन के दौरान मेजबान सेल प्रोटीन या मीडिया घटक है कि अन्यथा राल चयनात्मकता और क्षमता को कम कर सकते हैं की अचलीकरण को कम करने के लिए आवश्यक था. आईसीए शुद्धीकरण के लिए एक पॉली-हिस्टिडीन टैग को शामिल करने से एक ही चरण में शुद्धता की शुद्धता में 90% की वृद्धि हुई, जिससे तेजी से और सस्ती लिगन्ड उत्पादन5,43,44को सुविधाजनक बनाया गया . हालांकि, संलयन टैग की स्थिति महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बाँझ epitope बंधन बाधा या या तो टैग या वाहक से epitope के दरार प्रेरित करने की क्षमता है45,46.

एन एच एस सक्रिय क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर आत्मीयता का अचलीकरण

अचलीकरण मैन्युअल रूप से या एक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग किया गया था। स्तंभ प्रति छोटे बफर संस्करणों मैनुअल हैंडलिंग के पक्ष में लग रहा था (उदा., न्यूनतम अपशिष्ट मात्रा के कारण). हालांकि, यदि एकाधिक/बड़े स्तंभों की आवश्यकता होती है, तो क्रोमैटोग्राफी सिस्टम युग्मन स्थितियों को नियंत्रित करने में आसान बनाता है (जैसे, विनियमित प्रवाह दर) और इसलिए डीबीसी के संदर्भ में पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने की अधिक संभावना है। हमारे डेटा का सुझाव है कि युग्मन बफर और पीएच युग्मन दक्षता और समग्र स्तंभ लागत पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. स्क्रीनिंग कारक है कि युग्मन प्रतिक्रिया को प्रभावित करने और उन्हें प्रत्येक वाहक प्रोटीन के लिए समायोजन (या यहां तक कि प्रत्येक वाहक के लिए-लिगेंड संलयन) इसलिए युग्मन दक्षता और राल प्रदर्शन में सुधार सकता है, और हम इस दृष्टिकोण की सिफारिश.

DFE आत्मीयता राल का उपयोग कर 2F5 अलगाव परीक्षण

उत्पाद उपज और शुद्धता राल प्रदर्शन के महत्वपूर्ण पहलू हैं, और Dfe के मामले में हम 105 की उपज हासिल की - 11% (जेडएसडी, n $3) और 97 की शुद्धता - 3% (जेडएसडी, n $3), जो बेंचमार्क प्रोटीन ए रेजिन25 के प्रदर्शन के साथ तुलनीय है ,26. सामान्य में रेजिन के लिए एक और महत्वपूर्ण प्रदर्शन सूचक (और विशेष रूप से आत्मीयता ligands के आधार पर उन लोगों के लिए) 10% उत्पाद सफलता पर डीबीसी है, क्योंकि इस पैरामीटर एक विशिष्ट प्रक्रिया के लिए आवश्यक राल की मात्रा को प्रभावित करता है और इस तरह लागत. DFE ligand के लिए, प्रारंभिक डीबीसी था [4 g] एल-1 राल, जो इसी तरह की परिस्थितियों के तहत प्रोटीन ए के लिए इसी मूल्य का 13% है (केवल 2 मिनट संपर्क समय)25,47 लेकिन के बारे में 15 गुना अधिक अन्य कस्टम आत्मीयता resins की तुलना में इस तरह के रूप में विरोधी FSH-प्रतिरक्षा लिगन्ड 2 मिनट48के एक ही निवास समय का उपयोग कर . डीबीसी के डीबीसी 25 बाँध और elute चक्र के बाद प्रारंभिक मूल्य का 15% करने के लिए गिरावट आई है, जबकि 50 से अधिक चक्र वाणिज्यिक प्रोटीन ए रेजिन49में डीबीसी के एक ही नुकसान के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमारे वाहक अभी तक प्रोटीन ए के रूप में एक ही हद तक अनुकूलित नहीं किया गया है, जो व्यापक जांच की गई है और पिछले चार दशकों में सुधार8.

इस प्रकार अब तक हमने निम्न-पीएच एल्यूशन बफर से मैग्नीशियम क्लोराइड की उच्च सांद्रता में परिवर्तन करके राल की स्थिरता और उत्पाद वसूली में सुधार किया है (चित्र 3) जैसा कि पहले के अध्ययन13में सिफारिश की गई थी . आत्मीयता ligand की विशेषता लाल रंग काफी हद तक 25 बाँध और elute चक्र के दौरान फीका नहीं था, तो हम सोचते हैं कि स्पष्ट संयंत्र निष्कर्षों में अंतर्जात संयंत्र proteases31 छोटा हो सकता है और इस तरह के epitope निष्क्रिय लिगन्ड. इसलिए, वाहक और एपिटोप से कनेक्ट करने के लिए प्रोटीज़-प्रतिरोधी लिंकर डिजाइन करने से प्रारंभिक डीबीसी को चक्रों की एक विस्तारित संख्या से अधिक बनाए रखने में मदद मिल सकती है। तेजी से और सरल अभिव्यक्ति और DFE ligand की शुद्धि को देखते हुए, वाणिज्यिक क्रोमैटोग्राफी रेजिन के लिए अपनी सीधी युग्मन, और इसके उत्कृष्ट उत्पाद उपज और शुद्धता, हम मानते हैं कि हमारी विधि प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त विकल्प प्रदान करता है एक के लिए mAbs और एंटीबॉडी डेरिवेटिव जो प्रोटीन ए के लिए बाध्य नहीं है की शुद्धि, खासकर अगर वाहक और linker में सुधार डीबीसी और लिगेंड स्थिरता में सुधार कर सकते हैं. इस धारणा DFE-शुद्ध और प्रोटीन ए-शुद्ध 2F5 एंटीबॉडी5के वियोजन स्थिरांक में छोटे अंतर द्वारा समर्थित था, यह दर्शाता है कि हमारे नए संबंध ligand उच्च गुणवत्ता mAbs की वसूली की अनुमति देता है.

लाभ और विधि की वर्तमान सीमाएं

एक वाहक प्रोटीन के साथ एक आनुवंशिक संलयन के रूप में आत्मीयता ligand उत्पादन जलीय बफ़र्स में घुलनशीलता बढ़ जाती है और इस प्रकार ठेठ लिगन्ड युग्मन स्थितियों के साथ संगतता. इसके विपरीत, ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण से व्युत्पन्न रिक्त पेप्टाइड्स उनके अनुक्रम के कारण इन शर्तों के तहत घुलनशीलता सीमित हो सकता है50, जो परिवर्तित नहीं किया जा सकता है क्योंकि यह mAb द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप के एमिनो एसिड अनुक्रम द्वारा निर्धारित है शुद्ध किया जा सकता है. दूसरों इसलिए पेप्टाइड ligands51के एक पर राइस संश्लेषण का इस्तेमाल किया है. जिसके परिणामस्वरूप राल की स्थैतिक बंधन क्षमता अधिक थी ($80 g] एल-1),लेकिन राल तैयारी की प्रक्रिया लंबी है, एक गतिशील बाध्यकारी क्षमता की सूचना नहीं थी और प्राप्त शुद्धता और वसूली हमारे दृष्टिकोण की तुलना में कम थे. प्रयोगशाला पैमाने पर एक संलयन प्रोटीन लिगन्ड का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि लिगन्ड और वेरिएंट तेजी से उत्पादन किया जा सकता है, शुद्ध और एक आसान करने के लिए उपयोग उच्च के माध्यम से अभिव्यक्ति प्रणाली52में कम से कम प्रयास के साथ परीक्षण किया.

यहाँ प्रस्तुत विधि की दो वर्तमान सीमाएँ 3 g की कम गतिशील बाइंडिंग क्षमता हैं। एल-1 और इसके 90% 25 बाँध और elute चक्र5के पाठ्यक्रम पर कमी . इन सीमाओं को भविष्य में कम कड़े लोडिंग शर्तों को लागू करने और क्रमशः एक इंजीनियर, अधिक स्थिर संस्करण के साथ वर्तमान DsRed वाहक की जगह से संबोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, वर्तमान संपर्क समय को 2 से 4 मिनट तक दोगुना करने में गतिशील बाइंडिंग क्षमता को दोगुना करने की क्षमता होती है जैसा कि कुछ प्रोटीन ए रेजिन26के लिए दिखाया गया था।

समस्या निवारण

निम्न तालिका उन संभावित समस्याओं पर प्रकाश डालती है जिनका सामना इस प्रोटोकॉल के दौरान किया जा सकता है और उन्हें हल करने के तरीके पर संकेत प्रदान करता है (तालिका 1)।

तालिका 1: संभावित समस्याओं का सामना किया जा सकता है और संभावित फिक्सेस।
प्रोटोकॉल चरण समस्या Couse ठीक करना
1 पौधे नहीं उगाते समझौता विकास की स्थिति पीएच और उर्वरक की चालकता की जाँच करें
तापमान और प्रकाश की स्थिति की जाँच करें
2 और 3 निकासी के बाद मेजबान सेल प्रोटीन की बड़ी मात्रा में मौजूद हैं अपूर्ण वर्षण ब्लैंचिंग के दौरान तापमान की जांच करें
ब्लैंचिंग स्नान में आंदोलन की जाँच करें
2 और 3 संयंत्र निकालने में कोई उत्पाद नहीं मिला ब्लैंचिंग तापमान बहुत अधिक ब्लैंचिंग के दौरान तापमान और पीएच की जांच करें
ब्लैंचिंग बफर में पीएच बहुत कम
3 बड़े स्टेम या पत्ती भागों निष्कर्षण के बाद रहते हैं ब्लेंडर में अधूरा मिश्रण सुनिश्चित करें कि संयंत्र सामग्री ब्लेंडर में एक प्लग फार्म नहीं करता है
3 गहराई निस्पंदन के दौरान तेजी से दबाव में वृद्धि गलत फ़िल्टर चयन और/ फ़िल्टर प्रकार और ओरिएंटेशन की जाँच करें
4 elution के दौरान थोड़ा संलयन प्रोटीन / प्रवाह के माध्यम से संलयन प्रोटीन का एक बहुत IMAC राल धातु आयनों के साथ आरोप नहीं लगाया गया था जाँच करें कि IMAC राल सही आयनों के साथ चार्ज किया गया था
फ्यूजन प्रोटीन आत्मीयता टैग खो दिया है पौधे की खेती के दौरान तीव्र धूप और उच्च तापमान से बचें
4 एकाग्रता के दौरान खोया फ्यूजन प्रोटीन फ्यूजन प्रोटीन झिल्ली के लिए बाध्य झिल्ली प्रकार की जाँच करें
सुनिश्चित करें कि एकाग्रता कारक बहुत अधिक नहीं था
5 कम युग्मन उपज युग्मन अभिकर्मक योग का गलत अनुक्रम अभिकर्मकों लेबल और इसके अलावा के अनुक्रम की जाँच करें
युग्मन से पहले स्तंभों की गलत तैयारी स्तंभ पूर्वपरासन की शर्तों की जाँच करें
5 और 6 कम mAb उपज संयंत्र बायोमास में कम mAb अभिव्यक्ति बायोमास में परीक्षण mAb अभिव्यक्ति
कम लिगन्ड घनत्व संलयन प्रोटीन तैयारी की शुद्धता की जाँच करें
7 ब्रैडफोर्ड परख में बहुत कम / पाइपिंग के दौरान बुलबुला गठन 96-वेल पाल्टे में बुलबुले के लिए जाँच करें
7 एसपीआर माप के दौरान कम mAb एकाग्रता समझौता प्रोटीन एक चिप ज्ञात एकाग्रता के साथ मानक mAb के परिणामों के साथ तुलना करें
गलत नमूना तनुकरण कमजोर पड़ने की दर और बफर की जाँच करें

तालिका 1: मुसीबत-शूटिंग.

Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

हम ट्रांसजेनिक तंबाकू पौधों की खेती के लिए इब्राहिम अल Amedi और डॉ थॉमस Rademacher तंबाकू अभिव्यक्ति वेक्टर प्रदान करने के लिए स्वीकार करना चाहते हैं. लेखकों को संपादकीय सहायता और Markus Sack DFE आत्मीयता ligand संरचना के बारे में उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ रिचर्ड एम Twyman धन्यवाद देना चाहता हूँ. इस काम के हिस्से में अनुदान नहीं के तहत Fraunhofer-Gesellschaft आंतरिक कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था. 125-600164 को आकर्षित और Leistungszentrum अनुदान संख्या 423 "नेटवर्क, अनुकूली उत्पादन" के तहत उत्तर-रिन-वेस्टफेलिया की स्थिति। इस काम को अनुसंधान प्रशिक्षण समूह "ट्यूमर-लक्षित ड्रग डिलिवरी" अनुदान 331065168 के ढांचे में ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा समर्थित किया गया था। जीई स्वास्थ्य सेवा इस लेख के खुले उपयोग प्रकाशन का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 L/20 L Bucket n/a n/a Blanching equipment
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
ÄKTApure GE Helthcare 29018226 Chromatography system
Allegra 25R Beckman Coulter 369434 Centrifuge
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050 SPR chip coupling kit
Antibody 2G12 Fraunhofer IME n/a Standard for SPR quantification
Blender Waring 800EG Blender
BP-410 Fuhr 2632410001 Bag filter
CanoScan 5600F Canon 2925B009 Scanner
Centrifuge tube 50 mL self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chelating Sepharose FF GE Helthcare 17-0575-01 Chromatography resin
Cond 3320 WTW EKA 3338 Conductometer
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n/a DoE software
Discovery Compfort Gilson F81029 Multichannel pipette
Disodium phosphate Carl Roth GmbH 4984.3 Media component
Diverse bottles Schott Duran n/a Glas bottles
Dri Block DB8 Techne Z381373 Heat block
DsRed Fraunhofe IME n/a Standart
EDTA Carl Roth GmbH 8043.2 Buffer component
EnSpire Perkin Elmer 2390-0000 Plate reader
ETHG-912 Oregon Scientific 086L001499-230 Thermometer
F9-C GE Helthcare 29027743 Fraction collector
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Buffer component
Hettich Centrifuge Mikro 200 Hettich 2400 Centrifuge
HiPrep 26/10 GE Helthcare GE17-5087-01 Chromtography column
HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL GE Helthcare 17-0716-01 Chromatography columns
Hydrochloric acid Carl Roth GmbH 4625.1 Buffer component
Imidazole Carl Roth GmbH 3899.2 Buffer component
K700 Pall 5302305 Depth filter layer
KM02 basic IKA n/a Magnetic stirrer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
L/S 24 Masterflex SN-06508-24 Tubing
Lauda E300 Lauda Dr Wobser GmbH Z90010 Immersion circulator
Magnesium chloride Carl Roth GmbH KK36.2 Buffer component
Masterflex L/S Masterflex HV-77921-75 Peristaltic pump
Minisart 0.2 µm Sartorius 16534K Filter unit
Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter Thermo Fischer Scientific 595-4520 Vacuum filtration of SPR buffers
Nickel sulphate Carl Roth GmbH T111.1 Buffer component
Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels Invitrogen NP0336BOX LDS-PAA gels
Novex X-cell Mini Cell Invitrogen EI0001 PAGE chamber
NuPAGE 20x running buffer Invitrogen NP0002 Buffer concentrate
NuPAGE antioxidant Invitrogen NP0005 Antioxidant
PageRuler protein ladder (10-180 kDa) Invitrogen 26616 Protein standart
Perforated bucked n/a n/a Blanching
PH 3110 WTW 2AA110 PH meter
PowerPac HC Biorad 1645052 Electrophoresis module
Protein A from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich P7837-5MG Coating of SPR chips
Sephadex G-25 fine, cross linked dextran GE Helthcare 17003301 Chromatography resin
Silicone spoon n/a n/a Spoon
Simply Blue SafeStain Invitrogen LC6060 Gel staining solution
Sodium acetate Carl Roth GmbH 6773.1 Buffer component
Sodium acetate Carl Roth GmbH X891.1 Media component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-100G Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Buffer component
Sodium citrate Carl Roth GmbH HN13.2 Buffer component
Sodium bisulfite Carl Roth GmbH 243973-100G Media component
Sodium phosophate Carl Roth GmbH T877.2 Media component
SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics SPR-AS-HCA SPR chip
SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics n/a SPR device
SSM3 Stuart 10034264 Mini Gyro-rocker
Heated vessel, 20 L Clatronic n/a Blanching chamber
Sterile syringes, 2 mL B. Braun 4606027V Syringes
Syringe adpter (Union Luer F) GE Helthcare 181112-51 Syringe adapter
TE6101 Sartorius TE6101 Precision scale
Tween-20 (Polysorbate) Merck 8170721000 Buffer component
Unicorn 6.4 GE Helthcare 29056102 Chromatography software
Vacuum bags Ikea 203.392.84 Plant storge
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Vortex-Genie 2 Scientific industries SI-0236 Vortex
XK-26/20 column housing GE Helthcare 28-9889-48 Chromtography column

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Knödler, M., Rühl, C., Opdensteinen, P., Buyel, J. F. Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study. J. Vis. Exp. (150), e59933, doi:10.3791/59933 (2019).

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