Summary
이 기사에서는 현장에서 제조 된 핵산 마이크로 어레이의 합성 및 응용 분야의 새로운 개발을 제시하고 논의합니다. 특히, 우리는 DNA 합성을 위한 프로토콜이 RNA로 확장될 수 있는 방법과 마이크로어레이가 어떻게 회수 가능한 핵산 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있는지 보여줍니다.
Abstract
포토리소그래피는 미소미터 크기의 거울에서 반사되는 UV 광의 정밀도와 밀도와 인산포라미드 커플링 반응의 효율성을 결합하기 때문에 유리 슬라이드에서 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하는 강력한 기술입니다. 포토리소그래피는 수십만에서 수백만 개의 서로 다른 DNA 서열, 100-nt 이상, 단 몇 시간 만에 수용할 수 있는 마이크로어레이를 산출합니다. 이 매우 큰 서열 공간으로, 마이크로어레이는 RNA의 경우에 특히 관련있는 핵산 리간드 상호 작용의 기계장치를 탐구하기 위한 이상적인 플랫폼입니다. 우리는 최근에 사이투 포토리소그래피에서 와 호환되는 RNA 인산염의 새로운 세트의 제조에 보고하고 이후에 RNA 올리고뉴클레오티드, 호모폴리머뿐만 아니라 혼합 염기 서열을 성장시키는 데 사용되었다. 여기서, 우리는 실험 설계로부터, 기악 설정, 어레이 합성, 탈보호 및 최종 혼성화 분석법까지, 4개의 염기를 모두 포함하는 템플릿 25mer 서열을 예로 들 수 있는 RNA 마이크로어레이 제조 과정을 상세히 설명한다. 동시에, 우리는 하이브리드화 기반 실험을 넘어 복잡한 핵산 라이브러리에 대한 저렴한 게이트웨이로 마이크로어레이 포토리소그래피를 활용합니다. 이렇게 하기 위하여, 고밀도 DNA 마이크로어레이는 DNA가 편리하게 갈라지고 합성 및 보호 해제 후에 회수될 수 있는 염기 과민한 단량체에 가공됩니다. 제조 프로토콜은 합성 오차의 수를 제한하고 그 효과를 위해 최적화되어, β-카로틴 용액의 층은 그렇지 않으면 합성 기판에 다시 반사 될 수있는 UV 광자를 흡수하기 위해 도입된다. 우리는 디자인에서 분열 및 정량화에 이르기까지 라이브러리 준비의 전체 프로세스를 단계별로 설명합니다.
Introduction
DNA 마이크로어레이의 실용화는 전통적으로 두 세포 집단 사이의 유전자 발현 수준에 대한 변이에 대한 연구에서, 상호 보완적인 가닥과 형광을 검출 방법으로사용하여1. 때때로 DNA 마이크로어레이는 단백질과 같은 비핵산 리간드와 결합 하는 이벤트로 벤처, 바인딩 풍경의 포괄적인 개요를제공 하는 체계적인 서열 순열의 전략 2,3; 4,5. 이 접근법은 마이크로어레이를 단순한 혼성화 표면에서 광범위한 서열 커버리지를 가진 플랫폼으로 효과적으로 변환하며, 이는 RNA 구조 및 기능의 풍부하고 복잡한 세계를 연구하는 자산이 될 것입니다. 매우 효율적인 인산결합 결합 반응 6에의해 지원되며, 현재 합성된 DNA 어레이는 DNA 7의 저렴한공급원으로 간주될 수 있으며, 이는 계속 증가하는 수요를 고려할 때 특히 관련성이 높아지고 있습니다. 유전자 조립을 위한핵산 물자 8,9,DNA 기지를 둔 나노 구조물10,정보 저장 또는 순서 11,12. 마찬가지로, 시퀀싱 기술은 RNA 올리고뉴클레오티드(13)의 매우 복잡한 혼합물을 산출하는방법의 개발로부터 이익을 얻을 가능성이 있다. 이러한 맥락에서, 올리고뉴클레오티드가 현장에서 고밀도로 합성될 수 있도록 하는 어레이 제조 프로토콜은 핵산 생명공학분야의 급속히 팽창하는 분야의 요구를 충족시키기 위해 이상적으로 배치된다. 그러나, 생명 공학과 같은 다양한 분야로, 각 응용 프로그램의 목적은 마이크로 어레이에 DNA가 높은 처리량또는 합성 오류14,15,또는 둘 다의 매우 낮은 양으로 생산될 것을 요구할 수 있습니다. 역사적으로, 주로 혼성화 분석에 최적화된 DNA 마이크로어레이의 합성 프로토콜을 자세히 살펴봅니다. 한편, RNA 마이크로어레이의 위상 합성에서 2'-OH 기능에 대한 보호군과 관련된 대부분의 난이도와 함께, 일반적으로 제거되는 표준 고체상 합성에서 실릴모에티와 관련된 대부분의 어려움이 있는 것으로 밝혀졌다. 불소 계 시약, 유리 또는 실리콘 표면과 호환되지 않는 화학 물질. DNA 및 RNA 마이크로어레이 합성에서 이러한 문제점과 과제는 최근 광리소그래피 접근법16과함께 큰 일체의 대상이 되고 있다.
포토리소그래피는 결합 하기 전에 올리고뉴클레오티드의 차단을 해제 하기 위해 UV 빛을 사용 하 고 UV 노출의 패턴을 구성 하는 마스크를 필요, 따라서 공간적으로 구성 하 고 올리고 뉴클레오티드의 성장을 제어. 물리적 마스크는 마이크로어레이 기판(17,18,19)에자외선을 선택적으로 반사하는 컴퓨터 제어식 마이크로미러로 대체되었다. UV 소스로서, 우리는 고출력 LED 소스(20)에서365 nm 빛을 사용합니다. 현재 포토리소그래피 설정에는 1024 × 768 미러가 들어있는 마이크로 미러 어레이가 장착되어 있으며, 1.4 cm2,또는 1080p의 배열이있는 1080p의 작은 영역에 780,000 개 이상의 개별 주소 지정 가능한 지점 ("기능")에 해당하는 1920 × 1080 또는 >2 백만 거울. 따라서 장치의 각 미러는 해당 피쳐에서 성장된 시퀀스를 직접 제어할 수 있습니다. UV 광을 제외하고, 포토리소그래피는 고체 상 합성 기술과 같은 기능을 하며 주기 기반 인산염 화학을 채택합니다. 단지 RNA 합성이 성공하기 위해서는 완전히 다른 보호 전략이 필요합니다. 우리는 히드라진-비질 보호 군21을베어링하는 빛에 민감한 RNA 인산염의 새로운 시리즈를 개발했다. 이 단량체는 RNA가 표면의 무결성에 영향을 미치지 않는 온화한 조건 하에서 보호될 수 있게 합니다. 첫 번째 탈방 단계는 트리에틸아민을 사용하여 시아노에틸 포스포디스터 보호 기를 제거하고, 히드라진은 2'-OH 및 외래 아민 기능에서 제거하는 두 번째 별도의 단계에서 사용됩니다. 이렇게 함으로써, RNA 올리고뉴클레오티드 ~30-nt 길이 및 임의의 서열의 마이크로어레이22,23에대한 크기로 합성될 수 있다. 병행하여, 우리는 또한 최근에 DNA와 RNA 포토리소그래피에서 처리량, 질 및 속도의 질문을 해결하기 시작했습니다. 모든 DNA및 RNA 아미마이트에 대해 결합 효율 >99%를 측정하고(그림1)산화 시간부터 활성제 선택, 최적의 UV 노출에 이르기까지 올리고뉴클레오티드 신장 주기의 각 개별 단계를 조사했습니다24 , 25. 우리는 몇 시간 긴 프로세스26에100mers의 수십만의 합성을 변환, 초 만에 제거 할 수있는 새로운 빛에 민감한 5 '보호 그룹을 가져왔다 . 또한 두 개의 기판을 동시에27개노출하여 어레이 제작 처리량을 두 배로 늘렸습니다. 마지막으로, 라이브러리 제제(28)의 중심인 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 갈라, 수집 및 분석하는 편리한 방법으로서 염기민감성 슈치닐기를함유하는 dT 포스포라미드를 도입했다.
DNA 및 RNA 고체 상 합성의 비교적 평범한 양상에도 불구하고, 특히 핵산 화학자의 경우, 마이크로어레이 포리소그래피는 복잡한 설정, 신중한 제어 및 공정 감독을 요구하는 비사소한 업그레이드로 남아 있으며, 올리고뉴클레오티드의 특성과 적용 유형에 따라 합성 후 취급에 대한 별도의 지침을 참조하십시오. 이 기사에서는 실험 설계에서 데이터 분석에 이르기까지 포토리소그래피에 의한 DNA 및 RNA 마이크로어레이의 전체 단계별 시술에 대한 상세한 프레젠테이션을 제공하고, 기기 의 제조에 중점을 두고, 소모품. 그런 다음 마이크로어레이 제조의 의도된 목적에 해당하는 합성 후 보호 방법(즉, 혼성화 또는 핵산 라이브러리의 회수)을 설명합니다.
Protocol
1. 마이크로 어레이 디자인
- 텍스트 편집기인 5'→3', 시퀀스당 한 줄로 합성할 시퀀스를 작성합니다. 품질 관리 25mer의 경우" 시퀀스를 사용하십시오. DNA 뉴클레오티드에 A, C, G 및 T 문자를 사용하고 RNA 뉴클레오티드의 경우 5, 6, 7 및 8 숫자를 사용합니다.
- 라이브러리 준비의 경우, 각 시퀀스의 3' 끝에 추가 숫자(즉, 9)를 추가합니다. 이는 염기 민감 단량체의 커플링에 해당합니다.
- 각 시퀀스 뒤에 쉼표가 있어야 합니다. 쉼표 다음에 각 시퀀스에 이름을 지정하고 각 레인이[시퀀스,#sequence_name]형식을 따르는지 확인합니다(대괄호 제외). 시퀀스 목록을 .txt 파일로 저장합니다.
- 그런 다음 MatLab을 시작하면 ChipDesign.m프로그램을 로드합니다. 프로그램을 실행합니다.
- 속성 패널 창에서 마이크로어레이 전체칩 레이아웃 파일을 로드합니다. 동일한 4개의 위치에서 전체 배열을 합성하는 것이 목표인 경우 MilliChip 레이아웃 파일을 로드합니다.
- 속성 패널 창에서 칩사양에 따라 컨테이너 선택을 선택한 다음 합성 영역을선택합니다. 패턴에서주소 지정 가능한 피처의 정확한 양을 생성하는 패턴을 선택하고 시퀀스 개수를 계산합니다. 품질 관리 25mer의 경우 25:36 패턴을 선택합니다.
- 컨테이너선택에서 Fiducial을 선택합니다. Fiducial 기능은 일반적으로 합성 영역의 모서리에서 합성되며 하이브리드화 데이터를 추출하는 데 사용됩니다. Fiducial을 선택하여, fiducial 기능에 합성될 시퀀스(5'→3')를 작성하고 긍정적인 컨트롤로 작용할 수 있습니다. 25mer 실험의 경우, 동일한 DNA 서열을 사용하십시오.
- 시퀀스에서모든 기록된 시퀀스가 포함된 텍스트 파일을 로드합니다. 무작위가 선택되어 있는지 확인합니다. 프로젝트 제목에서 실험에 제목을 지정하고 링커 시퀀스에서 TTTTT(T 5 링커에 해당)를 작성합니다.
- 생성을누릅니다. 표시스크립트, 흐름 시퀀스 및 디자인파일이 포함되어 있는지 확인합니다.
- 라이브러리 준비를 위해 표시 스크립트를 엽니다. 스크립트의 첫 번째 줄을 정확하게 복사하는 표시 스크립트 맨 아래에 추가 줄을 추가합니다(예: First_Mask.bmp 150표시). 이것은 모든 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 말단 광보호군을 제거할 것이다.
- 작업 작성자 AutoJob 프로그램을 시작하고 로드 템플릿을클릭하여 템플릿을 로드한 다음 표시 스크립트를 클릭하여 MatLab에서 생성한 표시 스크립트 파일을 로드합니다. 을생성합니다. 이 단계는 마이크로미러 및 DNA 신디사이저와 컴퓨터의 통신을 제어하는 jobfile이라는 일련의 지침을 만듭니다.
2. 슬라이드 준비 및 기능화
- 합성 셀상에 있는 입구 및 출구 튜브의 위치에 해당하는 두 위치에서 하나의 슬라이드를 드릴링합니다. CNC 라우터에 0.9mm 다이아몬드 비트를 사용하여 정밀하고 안정적으로 드릴링할 수 있습니다. 드릴된 슬라이드를 초순수로 헹구고 슬라이드 랙에 배치합니다.
- 35 °C에서 30 분 동안 암모니아 기반 특수 목적 클리너의 5 %를 포함하는 수조에서 슬라이드를 초음파 처리하여 표면을 청소하십시오. 이중 증류된 H2 O로 슬라이드를헹구고 깨끗하고 건조한 랙에 옮김을 넣습니다.
- 드릴 및 드릴되지 않은 현미경 슬라이드를 슬라이드 랙에 배치합니다. 큰 실린더에서 475 mL의 에탄올 (EtOH)과 ddH2O 25 mL, 실라니화 시약 10g (N -(3-트리에톡실릴프로필)-4-하이드록시부티라미드)와 1 mL의 아세트산을 혼합하여 기능화 용액을 준비합니다. 균일할 때까지 잘 저은 다음 적당한 밀폐 용기에 옮김을 담습니다.
- 적재된 랙을 용기에 넣고 뚜껑을 닫고 실온에서 4시간 동안 궤도 셰이커에 부드럽게 흔들어 놓습니다.
- 4시간 후, 기능화 용액을 폐기하고 EtOH 475 mL, ddH2O 25 mL 및 아세트산 1mL로 구성된 500 mL의 세척 용액으로 교체하십시오. 실온에서 20분 동안 천천히 교반한 다음 500 mL의 신선한 세척 용액으로 폐기하고 교체하십시오.
- 실온에서 추가로 20 분 후, 용액을 폐기하고 아르곤 스트림으로 슬라이드를 건조시키고 120 °C에서 예열 된 진공 오븐에서 경화하십시오. 2시간 후, 오븐과 진공 펌프를 끄고 슬라이드를 밤새 압력을 줄이십시오. 그런 다음 오븐을 대기압으로 되돌리고 슬라이드를 건조기에서 추가로 사용할 때까지 보관하십시오.
3. 합성 시약 및 반응제의 준비
- 포스포라마이트 분말(그림 1)을 저장 온도(-25 또는 -45°C)에서 건조기의 실온으로 가져온다.
- 포스포라마이트가 실온에 도달하면, 표준 DNA 및 RNA 인산염에 대한 30 mM 농도에도달하기 위해 초건조 아세토니트릴(<30 ppm H2 O)의 부피로 분말을 용해시키고, 염기 민감성 dT 단량체에 대해 50 mMM( 라이브러리 준비)를 참조하십시오. 작은 분자 체 백을 추가하여 습도의 흔적을 포획합니다.
- 11 g의 이미다졸을 건조한 DMSO 1L에 용해시켜 DMSO에서 1% (w) 이미다졸용을 준비합니다. 완전히 녹을 때까지 잘 흔들어주세요. DNA 합성기의 보조 포트에 용액을 부착합니다. 이것은 5′-포토보호 그룹의 완전한 제거에 필요한 노출 용매가 될 것입니다.
- 라이브러리의 합성을 위해, 디클로로메탄 10 mL에서 100 mg의 β 카로틴을 용해시킴으로써 디클로로메탄에서 1 % (w / v) β 카로틴용액을 준비하십시오. 호박색 유리 병에 잘 흔들어서 알루미늄 호일에 싸서.
4. 마이크로 어레이 합성의 준비 및 모니터링.
- 마이크로어레이 제조실에서 온도와 습도를 기록하고 DNA 신디사이저가 충분한 헬륨 압력을 받고 있는지 확인하십시오.
- UV-LED와 냉각 팬을 켭니다. 들어오는 UV 라이트의 초점 평면에 UV 강도 미터를 부착하고 켭니다(그림3A).
- 컴퓨터에서 작업 파일/마이크로미러/합성 파일 컨트롤러 소프트웨어(WiCell)를 시작합니다. 그런 다음 마이크로미러 장치를 초기화하고 DMD를마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 모든 흰색 마스크 파일을 로드한 다음 이미지 로드를 선택합니다.
- UVS 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 UV 셔터 열기를 선택합니다. 강도 미터의 전력 값(mW/cm2)을 읽고 60s를 계산합니다. 60초 후, 전원 값을 다시 읽고 시작 과 끝 값을 기록합니다. UV 셔터를 선택하여 셔터를 닫고 강도 미터를 끕니다. mW/cm2의 평균 UV강도 값을 계산합니다.
- 5'-NPPOC 광방방지(DNA 및 RNA 마이크로어레이)의 경우 6 J/cm 2의 복사 에너지에 도달하는 데 필요한 노출 시간을 계산하고, 5'-BzNPPOC
광방보호(DNA 라이브러리)의 경우 3J/cm2를 계산합니다. - DNA 신디사이저 워크스테이션 소프트웨어에서 MatLab에서 생성된 흐름 서열의 내용을 복사하고 붙여넣기하여 시퀀스 편집기에서 시퀀스 파일을 만듭니다. 첫 번째 커플링으로 이동하기 전에 기판의 표면을 세척하기 위해 3' 끝(기본 사이클 문자: "s")에 두 개의 세척 단계를 추가합니다. 시퀀스 파일을 저장하고 내보냅니다.
- 워크스테이션 소프트웨어의 프로토콜 편집기에서 시퀀스 파일에 있는 각 문자와 숫자의 이름을 따서 명명된 전용 주기를 포함하는 프로토콜을 만듭니다(예: 시퀀스 파일에 문자 A, C, G 및 T만 포함된 경우 프로토콜 파일은 반드시 해당 A, C, G 및 T라는 이름의 4개의 주기를 포함합니다.
- DNA 인산포라마이트(사이클 A, C, G 및 T)의 커플링 시간을 15s로, rU 포스포라미드(주기 8)의 경우 120s로 설정하고 rA, rC 및 rG 포스포라미드(주기 5, 6 및 7)의 경우 300s로 설정합니다. 라이브러리 준비의 경우, 베이스 민감성, 절제가능한 dT 단량체의 커플링을 2 × 120s로 설정합니다(표 1 및 표 2).
- 각 사이클의 두 이벤트 2 Out 통신 이벤트 사이의 대기 시간이 필요한 복사 에너지에 도달하기 위해 계산된 UV 노출 시간에 해당하는지 확인합니다. 시퀀스 파일에 관해서는 프로토콜 파일을 저장하고 내보냅니다.
- WiCell 소프트웨어에서 해당 하위 창에 작업, 시퀀스 및 프로토콜 파일을 로드한 다음 보내기를 클릭하여 시퀀스 및 프로토콜 파일을 DNA 신디사이저로 보냅니다.
- 시퀀스 파일에서 각 포스포라마이트에 대한 커플링 수를 계산합니다.
- 각 합성을 수행하는 데 필요한 인산액 용액의 필요한 부피(μL)를 측정하려면 커플링 수를 60으로 곱합니다. DNA 신디사이저에서 라인의 안전성과 프라이밍을 위해 각 부피에 250 μL을 추가합니다. 단일 커플링만 필요한 인산포라마이트에 250 μL의 기본 부피를 사용합니다.
- 프로토콜 주기의 포트 문자/번호에 해당하는 DNA 신디사이저의 바이알로 솔루션을 신속하게 전송합니다.
- 시약으로 라인을 채우기 위해 각각 10 개의 프라임 펄스로 포스포라마이트 솔루션으로 포트를 완성하십시오. 반응 세포를 부착하기 전에 아세토니트릴 세척 라인을 프라임합니다.
- 합성 전지를 조립하기 위해, 세포의 석영 블록에 먼저 두꺼운(250 μm) 퍼플루오로엘라스토머(FFKM) 개스킷을 놓습니다. 첫 번째 개스킷 위에 드릴, 기능화 된 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드의 구멍이 합성 셀의 입구 및 출구 튜브와 연결되는지 확인하십시오.
- 두 번째, 얇은 (50 μm) 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE) 개스킷을 드릴 슬라이드 위에 놓고 두 개의 구멍을 둘러싸십시오. 마지막으로, 두 번째 개스킷 위에 두 번째, 기능화되었지만 드릴링되지 않은 슬라이드를 배치합니다(그림3B). 조립된 이중 기판 셀 위에 4나사 금속 프레임을 놓고 토크 드라이버를 사용하여 동일한 클램핑 력(0.45 Nm)으로 나사를 조입니다.
- DNA 신디사이저에 입구 및 출구 튜브를 부착합니다. 아세토니트릴 세척 라인을 프라이밍하고 기판을 통해 아세토니트릴(ACN)의 적절한 흐름을 확인합니다. 이 단계에서 ACN의 누출이 관찰될 수 있는 경우 셀을 분해하고 재조립합니다. ACN 프라이밍의 7 사이클을 거치고 나서 폐기물 라인에서 ACN의 부피를 측정합니다. 이 볼륨은 2 mL이어야합니다.
- 들어오는 UV 광의 초점 평면에 합성 셀을 부착합니다. 라이브러리 제제의 경우, 추가 입구 및 출구 라인을 세포 의 뒤쪽에 부착하고 β-카로틴 용액으로 후면 챔버를 채웁니다 (용액의 2 mL은 충분함). 누설이 없는지 확인합니다(그림3C).
- 먼저 WiCell 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 합성을 시작합니다. 작업 파일의 첫 번째 WAIT 명령에서 DNA 신디사이저에서 시작을 누릅니다.
- 합성 하는 동안 정기적으로 마스크 파일의 디스플레이 UV 노출 및 셔터의 열기와 일치 하는 지 확인 합니다.
- 일반 마이크로어레이를 합성한 후, 세포를 합성기에서 분리하고, 셀을 분해하고, 다이아몬드 펜을 사용하여 합성 번호를 유리 슬라이드에 에칭합니다. 각 슬라이드의 합성되지 않은 면에 숫자를 에칭합니다. 슬라이드를 50 mL 원심 분리기 튜브로 옮기고 건조 된 지역에 보관하여 추가 로 사용할 때까지 보관하십시오.
- 라이브러리 마이크로어레이의 합성 후, 먼저 챔버에서 β-카로틴 용액을 배출한 다음 CH2Cl2의 2×5 mL를 흐려서 세척한 다음, 배수한다. 단계 4.21에 따라 분해를 진행합니다. 합성된 어레이는 육안으로 볼 수있다(도 4).
광방보호(DNA 라이브러리)의 경우 3J/cm2를 계산합니다.5. DNA 마이크로어레이 보호
- 염색 유리 항아리에 EtOH 20 mL과 에틸렌디아민 20 mL (EDA)를 채웁니다. DNA 전용 마이크로어레이를 항아리에 수직으로 놓고 뚜껑을 닫고 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 보호하지 않도록 둡니다.
주의: EDA는 급성 독성, 부식성 및 인화성 액체입니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드에 장갑을 끼고 작업할 수 있습니다. - 2 시간 후, 핀셋을 사용하여 슬라이드를 검색하고 이중 증류 H2O로 철저히 헹구십시오.
- 슬라이드를 마이크로어레이 원심분리기에서 몇 초 간 건조한 다음 건조기에 보관합니다.
6. RNA 마이크로어레이 보호 해제
- 50 mL 원심 분리기 튜브에서 2:3 트리에틸아민/ACN(각각 20 mL 및 30 mL)의 건조 용액을 준비합니다. 하나의 RNA 마이크로어레이 슬라이드를 원심분리기 튜브로 옮기고 뚜껑을 닫은 다음 플라스틱 밀봉 필름으로 감쌉니다. 실온에서 1시간 30분 동안 궤도 셰이커에서 원심분리기 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 1시간 30분 후, 슬라이드를 제거하고 2 × 20 mL 건조 ACN으로 씻은 다음 마이크로 어레이 원심 분리기에서 몇 초 동안 건조시십시오.
주의: 트리에틸아민은 급성 독성, 부식성 및 인화성 액체입니다. 아세토니트릴은 독성이 있고 인화성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드에 장갑을 끼고 작업할 수 있습니다.
참고: 첫 번째 보호 해제 단계가 완료되었습니다. - 0.5M 히드라진 수화물 용액을 3:2 피리딘/아세트산으로 준비합니다. 먼저, 아세트산 20 mL과 피리딘 30 mL을 그라데이트 실린더에 섞습니다. 1.21mL의 히드라진 하이드레이트(hydrazine hydrate)를 추가하기 전에 용액이 식을 때까지 기다립니다. 생성된 용액의 약 40 mL를 50 mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
주의: 하이드라진 수화물은 급성 독성 및 부식성 액체입니다. 피리딘은 인화성이 높고 급성 독성이 있습니다. 아세트산은 인화성 및 부식성입니다. 통풍이 잘 되는 연기 후드에 장갑을 끼고 작업할 수 있습니다. - 첫 번째 보호 해제 단계 후 RNA 슬라이드를 히드라진 하이드레이트 용액으로 옮기고 뚜껑을 닫고 플라스틱 밀봉 필름으로 감쌉니다. 실온에서 2시간 동안 궤도 셰이커에서 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다. 2 시간 후, 슬라이드를 제거하고 2 × 20mL의 건조 ACN으로 씻은 다음 마이크로 어레이 원심 분리기에서 몇 초 동안 건조시면됩니다.
참고: 두 번째 보호 해제 단계가 완료되었습니다. - RNA 마이크로어레이에 DNA 뉴클레오티드도 포함되어 있는 경우, 세 번째 보호 해제 단계를 진행합니다. 50 mL 원심 분리기 튜브에서 EDA 20 mL과 EtOH 20 mL를 혼합합니다. DNA/RNA 마이크로어레이를 1:1 EDA/EtOH 용액에 넣고 실온에서 5분 동안 둡니다.
- 5 분 후, 슬라이드를 제거하고 멸균 수 2 × 20mL로 씻은 다음 마이크로 어레이 원심 분리기에서 건조시키고 건조기에 보관하십시오.
7. 형광 표지 보완 가닥혼성화
- 해동 아세틸화 소 혈청 알부민 (10 mg / mL) 및 Cy3 라벨 보완 가닥 (100 nM) 실온까지 따뜻하게.
- 1.5 mL 멸균 미세 원심 분리튜브에 2x MES 버퍼(200 mM-( N-morpholino)의 150 μL(200 mM-(N-morpholino)에탄술포닉산, 1.8M NaCl; 40 mM EDTA; 0.02% 트위엔-20) 26.7 μL의 Cy3 라벨 DNA, 13.4 μL의 아세틸화 BSA 및 10μL의 아세틸화 BSA 및 10μL. 소용돌이. 두 슬라이드를 혼성화에 사용할 경우 볼륨을 두 배로 늘릴 수 있습니다.
- 혼성화 오븐을 양면의 Tm 이하의 온도로 미리 따뜻하게 하지만 전체 경기 와 비경기 서열 간의 좋은 차별을 보장하기에 충분히 높다. 품질 관리 25mer의 경우 온도를 42 °C (59 °C의T m)로 설정하십시오.
- 위에서 제조된 혼성화 용액에서 각 슬라이드 및 피펫의 합성 영역에 자가 점착제 300 μL 하이브리드화 챔버를 신중하게 배치한다. 접착제 점으로 챔버의 구멍을 덮고 알루미늄 호일에 전체 슬라이드를 포장합니다.
- 마이크로어레이 슬라이드를 혼성화 오븐에 넣고 뚜껑을 덮고 선택한 혼성화 온도에서 2시간 동안 부드럽게 회전시다.
- 2 시간 후, 슬라이드를 분리, 알루미늄 호일을 제거하고 조심스럽게 하이브리드 챔버를 찢어. 미끄럼틀을 30 mL의 비엄격한 세척 버퍼 (NSWB; 0.9 M NaCl, 0.06 M 인산염, 6 mM EDTA, 0.01 % Tween20, pH 7.4)를 포함하는 원심 분리튜브로 옮기고 실온에서 2 분 동안 격렬하게 흔들어줍니다.
- 30 mL의 엄격한 세척 버퍼 (SWB; 100 mM MES, 0.1 M NaCl, 0.01 % Tween20)를 포함하는 원심 분리기 튜브로 슬라이드를 옮기고 1 분 동안 힘차게 흔들어줍니다.
- 마지막으로, 30 mL의 파이널 워시 버퍼 (FWB; 0.1x 식염수 나트륨 구연산염)를 포함하는 원심 분리튜브로 슬라이드를 옮기고 몇 초 동안 흔들어 줍니다. 마이크로어레이 원심분리기에서 슬라이드를 건조시고 말립니다.
- 드라이 마이크로어레이, 합성 영역을 아래를 향하여 마이크로어레이 스캐너의 슬라이드 홀더에 놓습니다. Cy3 라벨이 부착된 듀플렉스의 경우 532 nm 여기 파장, 575 nm 필터 및 350의 광증선으로 5 μm 해상도로 스캔합니다. 고해상도 스캔을 .tif 이미지 파일로 저장합니다(그림5A).
8. 데이터 추출 및 분석
- 데이터 추출 전에 저장된 배열 스캔을 이미지 편집기에서 회전하여 스캔의 왼쪽 상단 모서리에 가장 긴 fiducial 피쳐 체인을 배치합니다. 회전된 이미지를 저장합니다.
- 민첩한스캔을 시작한 다음 파일 | 어레이 스캔을 열고 로드합니다. 그런 다음 디자인 파일 하위 섹션에서 찾아보기를 클릭하여 을 로드합니다. 마이크로어레이 실험 설계 중에 자동으로 생성된 ndf 설계 파일입니다. 그런 다음 을 클릭합니다.
- 보기에서 자동 대비/밝기를 클릭합니다. 스캔 위에 수동으로 정렬되는 아이콘을 클릭합니다. 스캔의 네 모서리에 네 개의 사각형 모양의 마커를 배치한 다음 이제 녹색 아이콘을 다시 클릭합니다. 분석, 보고서 다음 프로브 보고서를 클릭하여 하이브리드화 데이터를 추출합니다.
- 을 엽니다. 스프레드시트 편집기에서 보고서 파일을 프로브합니다. 열 B와 I을 유지하고 추출된 데이터에서 평균 값 및 표준 편차를 계산하기 전에 나머지를 버립니다(그림5B).
9. 도서관 보호, 분열 및 복구
- DNA 라이브러리를 분리하고 갈라지려면 50 mL 원심 분리튜브에서 1:1 건조 EDA/톨루엔 용액을 준비합니다. 슬라이드를 골짜기 용액에 담그고 슬라이드를 닫고 플라스틱 밀봉 필름으로 감은 다음 실온에서 2 시간 동안 궤도 셰이커에서 부드럽게 회전하십시오.
- 2 시간 후, 슬라이드를 제거하고 꼼꼼하게 건조 ACN의 2 × 20mL로 씻어. 슬라이드를 제거하고 공기건조시키십시오.
- 파이펫을 사용하여 멸균 H2O의 100 μL을 이제 식별 가능한 합성 영역에 적용합니다. 용액을 1.5mL 미세원원지 튜브로 옮기기 전에 몇 번 위아래로 피펫을 피펫합니다. 이 과정을 반복하고 마이크로어레이 용루를 동일한튜브에 결합합니다(그림 6).
- 건조에 칩 용출의 2 × 100 μL을 증발 한 다음 뉴클레아제없는 H2O. UV-Vis 분광광도계에 대한 흡광도를 측정10 μL로 재용해.
- C18 수지가 장착된 10 μL 파이펫 팁상 DNA 라이브러리를 탈염. 먼저, 칩 용광을 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA) 완충용액으로 변환한다.
- H2 O/ACN 1:1의 3 x10 μL을 포지덴하여 수지에 적시고, 0.1 M TEAA 완충액의 3 x 10 μL로 세척하여 수지의 평형을 조정한다. 칩 용루를 수지를 통해 위아래로 10 회 파이펫팅하여 DNA를 결합합니다. 0.1 M TEAA 완충액의 3 x 10 μL, H2O의 3 x 10 μL로 수지세척.
- H2 O/ACN 1:1의 10 μL로 수지를세척하여 팁으로부터 탈염된 DNA를 용해시켰다. 탈염 용액을 건조시키고 멸균 H2 O.UV-Vis 분광광도계에서 흡광도를 측정한 10 μL로 재용해한다(그림 7). 라이브러리를 증발하여 건조시키고 추가 사용이 될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
Representative Results
DNA 및 RNA 마이크로어레이 혼성화
도 5는 25mer 서열의 DNA 및 RNA 버전을 포함하는 마이크로어레이상에서 수행된 혼성화 분석의 결과를 나타낸다(DNA 형태로 5'-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3'). 그림5A의 스캔은 Cy3 형광의 여기/방출 스펙트럼에 해당하는 녹색 크기 형식으로 나타나며, 형광 강도는 0에서 65536 사이의 임의 단위로 기록됩니다. 배열 디자인은 프로토콜 섹션에 설명된 25:36 기능 레이아웃을 따랐습니다. 스캔은 배열의 적절한 방향 후에 표시되며 왼쪽 상단 모서리에는 가장 긴 fiducial 피처 체인이 채워집니다. 여기서, fiducial 특징은 25mer의 DNA 버전을 포함하고, 원칙적으로, 항상 스캔 정렬 및 데이터 추출을 수행하기 위해 양성 형광 신호를 제공해야합니다. 하이브리드 마이크로어레이는 합성 영역의 가장자리가 일반적으로 중심보다 더 밝아지므로 균일하게 밝게 나타나야 합니다(최대 50% 더 밝임). 많은 양의 시퀀스가 복제되어 영역 전체에 무작위로 분산되어 공간 아티팩트의 영향을 줄입니다. 여기서, 각 서열(DNA 및 RNA)을 2,000개의 무작위 위치에서 합성하였다. 일반적으로 낮은 형광 잡음 (배경), <50 a.u., 하이브리드화 분석에서 200:1 800:1의 순서로 신호 /잡음 비율로 이어집니다. 데이터 추출 후 형광 강도가 평균화되고 ±SD로 플롯됩니다.
실험 간의 절대 형광 값에는 상당한 가변성이 있습니다. 여기서는 동일한 제작 매개변수와 동일한 합성 후 처리를 사용하여 세 개의 독립적인 합성에 대한 결과를 보여 준다. 25mer DNA는, 그것의 상보적인 Cy3 표지한 DNA 물가에 혼성화될 때, 20,000에서 30,000에 구역 수색하는 형광 신호를, 아주 드물게 위 또는 아래에, 산출할 것입니다. 25mer RNA는 동일한 Cy3 표지된 DNA 보체로 혼성화될 때, 15,000에서 20,000에 이르는 상응하는 특징에 형광 강도를 줄 것이다. 그러나, RNA/DNA 이중의 형광 강도는 때때로 8,000 이하로 떨어질 것입니다, 대응하는 DNA/DNA 이중은 20,000-30,000 범위 내의 아직도 형광할 때. 이러한 경우에, RNA에 대한 결과는 최적이 아닌 것으로 간주될 수 있다. DNA 또는 RNA를 위한 합성 또는 혼성화 실패는, 형광의 명백한 부족에서 스캐닝 도중 즉시 눈에 띄게 될 것입니다. RNA 합성에 대 한 여러 기회가 실패 하거나 부분적으로 성공 하 고 그들은 토론 부분에 설명 될 것 이다.
라이브러리 보호, 분열 및 복구
라이브러리의 복잡성과 밀도에 따라 합성 어레이의 모양과 윤곽은 배율 없이 적절한 조명(그림4)에서 볼 수 있으며 DNA는 여전히 보호된 형태로 유지됩니다. EDA/톨루엔으로 보호를 해제한 후, 갈라진 라이브러리를 수집하기 위해 물을 첨가하기 전에, 현재 보호되지 않은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 합성 영역은 나머지 유리 슬라이드가 나타날 때 친수성 영역으로 두드러질 수 있습니다. 혼탁한 소수성 층으로 덮여있습니다. 합성 영역의 직접적인 관찰은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 사용되는 총 면적에 따라 달라집니다: 합성 영역의 더 큰 사용은 표면에 친수성 및 소수성 영역 사이의 명확한 구별의 큰 기회에 대응할 것이다. 반대로 미러 수가 적고 기능이 작은 라이브러리를 합성하면 즉시 관찰할 수 없습니다.
유사하게, 탈염 후 회수된 DNA의 양은 합성에 사용되는 총 면적에 정비례한다. 모든 특징이 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 경우, 분열 및 회복 절차는 DNA의 25와 30 pmol 사이에서 산출해야 한다. 합성 영역의 10% 사용은 따라서 DNA의 약 3 pmol을 감당할 것입니다.
그림 1 . 마이크로어레이 포토리소그래피에 의한 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 DNA 및 RNA 인산염의 화학적 구조. 5'-OH에서 표준 니트로페닐프로필옥시카보닐(NPPOC) 감광성 보호기는 혼성화를 목적으로 일반 DNA 및 RNA 마이크로어레이 합성에 사용된다. 복잡한 DNA 라이브러리의 합성을 위해, BzNPPOC가 NPPOC보다 두 배 빠른 속도로 제거되기 때문에 5'-OH에서 더 많은 광나약 벤질-NPPOC(BzNPPOC)가 선호되며, 이는 총 마이크로어레이 합성 시간을 현저히 감소시킨다. 라이브러리를 위한 DNA 올리고뉴클레오티드는 또한 3' 측점에 있는 절제가능한 dT 단량체의 결합을 요구한다. 이 단량체는, succinyl 에스테 르 기능을 운반, 보호 하는 동안 갈라질 것 이다, 마이크로 칩에서 수집 될 DNA에 대 한 허용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . UV 노출 시 마이크로미러 장치로 전송된 이미지 파일로서의 마스크의 예. 흰색 픽셀은 합성 셀에 UV 광선을 반사하는 "ON" 위치에서 기울어지는 미러에 해당합니다. 검은색 픽셀은 "OFF" 미러에 해당하며, 여기서 UV 광은 셀에서 반사됩니다. 백색 픽셀은 따라서 유리 기판상에 상응하는 특징에서 발견되는 올리고뉴클레오티드 상에서 다음 들어오는 포스포라미드의 결합을 허용할 것이다. 올리고뉴클레오티드는 해당 미러가 있는 피처에 합성되어 있으며, 이 마스크 파일에서는 다음 커플링 이벤트 동안 검은색 픽셀이 불활성 상태로 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 마이크로어레이 포토리소그래피 광학 및 합성 설정의사진. (A) 자외선 노출을 위한 광학 회로. UV-LED의 UV 광은 먼저 직사각형 단면 라이트 파이프를 통해 균질화 된 다음 마이크로 미러에 반사됩니다. "OFF" 위치로 기울어진 마이크로미러는 합성 셀에서 멀리 떨어진 UV 빛을 반사하지만"ON" 위치에 있는 마이크로미러는 먼저 1:1 Offner 릴레이를 통과하여 초점 평면에 위치한 합성 셀에 빛을 반사합니다. 이미징 시스템. (B) 합성 셀은 일단 조립되면 두꺼운 PTFE 개스킷으로 분리된 셀의 석영 블록에 먼저 놓인 드릴 슬라이드로 구성됩니다(도시되지 않음). 두 번째, 드릴되지 않은 슬라이드는 얇은 PTFE 개스킷으로 분리된 드릴 슬라이드 위에 배치됩니다. 금속 프레임(표시되지 않음)은 어셈블리를 함께 보유합니다. (C). 라이브러리 준비를 위해, 일단 합성 세포가 들어오는 UV 광의 초점 평면에 부착되면, 석영 블록과 드릴된 슬라이드 사이에 위치한 챔버는CH2Cl2에서 β-카로틴의 1% 용액으로 채워진다. 이를 위해 석영 블록에 추가 입구 및 출구 튜브가 부착되고 주황색 용액이 오른쪽에서 가장 왼쪽 위치로 흐릅니다. 합성을 위한 시약 및 용매의 흐름은 흰색 화살표로 나타난다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . 합성 영역은 일반적으로 육안으로 볼 수있습니다. 여기에서, DNA 라이브러리는 합성 직후 유리 표면에, DNA가 보호된 양식에 아직도 있는 것을 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 마이크로어레이상에서 합성된 25mer DNA 및 RNA 서열에 대한 혼성화 검사. (a) 전체 혼성 DNA 및 RNA 마이크로어레이의 형광 스캔. 25mer DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드는 Cy3 표지된 상보적 가닥으로 혼성화됩니다. 어레이는 5μm 해상도에서 532 nm 여기 파장에서 레이저로 스캔되었습니다. (B) DNA:DNA 및 RNA:DNA 이중의 형광 강도(임의 단위)는 3개의 개별적인 실험에서. 상기 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 연한 녹색 데이터는 상응하는 DNA 서열의 형광 강도와 비교할 때 최적이 아닌 것으로 간주될 수 있다. 오류 막대는 SD입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 . 마이크로어레이상에서 합성된 DNA 라이브러리에 대한 보호 해제, 절단 및 복구 절차의 회로도 표현. DNA 서열은 염기성 클리브블 dT 뉴클레오시드(확대 부위에 도시됨)에서 성장한다. 합성 후, EDA/톨루엔에서 DNA 올리고뉴클레오티드(염기 보호기는 적색 구체로 표현된다)의 보호 해제는 보호되지 않은 물질을 표면에 정전성으로 결합한 후 소량의 피펫아웃을 할 수 있습니다. 물을 합성 된 영역에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 . 대표적인 흡광스펙트럼(220-350 nm)의 갈라진 탈염 DNA 라이브러리는 4,000개의 상이한 서열, 100-nt 길이를 함유한다. 총 940 ng의 DNA를 단일 어레이 합성으로부터 분리하였고, 이는 총 DNA 총 30pmol, 또는 유리 기판당 15pmol에 해당한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 5'-BzNPPOC-dA의 커플링/산화/광보호를 위한 대표적인 사이클 프로토콜은 해당 포스포라마이트가 포트 "A"에 로딩되었다고 가정한다. 커플링 시간(초)은 "커플 단량체" 선에 표시됩니다. 3 J/cm2(BzNPPOC 광화학)의 복사 에너지에 대응하는 UV 광방방지 시간은 두 "이벤트 2 Out" 통신 신호 사이의 경과 시간으로 계산됩니다.
표 2. 5'-NPPOC-rA의 커플링/산화/광보호를 위한 대표적인 사이클 프로토콜, 상응하는 RNA 포스포라미드가 포트 "A"에 적재되었다고 가정한다. 커플링 시간(초)은 "커플 단량체" 선에 표시됩니다. 6 J/cm2(NPPOC 광화학)의 복사 에너지에 대응하는 UV 광방방지 시간은 두 "이벤트 2 Out" 통신 신호 사이의 경과 시간으로 계산됩니다.
Discussion
고상 DNA 및 RNA 합성은 모든 핵산 화학 실험실의 빵과 버터이며, 포토리소그래피 성분의 첨가는 명백하게 복잡한 작동이지만, UV 광에 의해 매개된 마이크로어레이 제조는 매우 신뢰할 수 있는 공정입니다. . 또한, 마이크로어레이에 대한 소르 RNA 합성에서 유일하게 이용 가능한 방법이다. 여전히, 어떤 다단계 실험 절차에서와 같이, 인간의 실수에 대한 충분한 공간이있다.
아마도 가장 중요한 단계는 합성 오류가 거의없는 올리고 뉴클레오티드를 감당하기 위해 지속적으로 높은 항복 화학 반응이 될 필요가 있기 때문에 인산염의 결합입니다. 우리의 마이크로어레이 합성 프로토콜에서, 포스포라마이트 커플링은 제조 공정이 캡핑을 우회하고 올리고뉴클레오티드 정제를 방지하기 때문에 전반적인 합성 품질에 더욱 중추적인 역할을 합니다. 99% 이상의 단계별 결합 효율은 모든 감광성 DNA 및 RNA 인산염에 대해 계산되었으며, 매우 짧은 커플링 시간(15s)24에도 불구하고, 특히 dG 아미마이트의 경우 더 낮은 커플링 수율이 때때로 발생할 수 있습니다. 실온에서 용해된 인산염의 안정성은 이전에 조사되어 뉴클레오베이스의 성질에 의존하는 것으로 나타났으며, 구아노신 포스포라미드제는단 29일만에 광범위한 분해가 발생하기 쉬운 것으로나타났다. 30. 그러나 -25°C에서 보관할 때, 30 mM 용액으로서 ACN에 용해된 dG 인산염은 몇 주 동안 안정한 것으로 나타났다. 그러나 실온에서 dG 포스포라미드 용액의 상대적 불안정성은 며칠 동안 DNA 신디사이저에 부착되어서는 안된다는 것을 의미합니다.
RNA 인산염의 경우, 결합 수율은 인산염 품질(31 P NMR 분광법에 의해 평가될 수 있음)과 커플링 시간에 매우 의존한다. rA, rG, rC 및 rU의 경우 5분의 커플링 시간이 필요합니다. 실제로, 우리는 모든 RNA 인산염에 대한 응축 시간을 2 분으로 단축하는 것이 현저히 낮은 혼성화 신호로 이어졌다는 것을 발견했습니다.
DNA 신디사이저 자체뿐만 아니라 시약 및 용매는 확실히 올리고뉴클레오티드 합성의 가장 높은 수율을 달성하기 위해 가능한 한 깨끗해야합니다. 그러나 불용성 물질, 염 또는 입자는 전달 시스템의 라인과 튜브에 시간이 지남에 따라 축적되어 시약 및 반응물의 소비가 점진적으로 감소할 수 있습니다. 신디사이저의 일반적인 청소가 낮은 출력 볼륨을 해결하지 않는 경우, 펄스의 수의 증가는 대체 솔루션이 될 수 있습니다. 특히 인산염 소비량이 적은 경우, 포스포라미트와 액티베이터의 혼합의 펌핑에 대응하는 커플링 프로토콜의 라인(표 1 및 표2의 커플링 소절의 제3라인)이 사용될 수 있다. 합성 품질에 대한 부정적인 영향을 전혀 받지 않고 6에서 9 펄스까지 수정되었습니다. 더욱이, 아미드/액티베이터 믹스를 합성 기판으로 가져오는 데 필요한 활성제의 펄스 수(현재 6, 커플링 소섹션에서 네 번째 줄, 표 1 및 표 2참조)는 DNA 신디사이저 자체뿐만 아니라 에 따라 달라집니다. 합성 셀의 튜브 길이. 이 숫자는 인산액을 유색 용액으로 교체하고 커플링을 위해 유리 기판에 컬러 믹스를 밀어 넣는 데 필요한 펄스 수를 계산한 후에 조정할 수 있습니다.
본 원에 기재된 방법은 DNA 및 RNA 합성이 동일한 마이크로어레이상에서 동시에 진행될 수 있도록 한다. DNA 및 RNA의 하이브리드는 또한 어레이 제조 프로토콜에 대한 어떠한 변화없이 제조될 수 있고, 3단계 탈보호 프로토콜이 따르는 한. 그러나 RNA 전용 마이크로어레이는 2단계 의 보호만 을 필요로 한다는 점에 유의해야 합니다: Et3N을 먼저 데카냐노에틸화하고 하이드라진을 가진 하이드록실 및 염기 탈보호를 선행합니다. DNA 뉴클레오베이스는 이러한 조건 하에서 불완전하게 보호되는 것으로 밝혀졌으며, 페녹시아세틸(Pac) 군의 완전한 제거를 위해 EDA에서 추가단계가 필요하다. EDA를 가진 이 추가 처리는 DNA 마이크로어레이31의 표준보호에 대하여 보다는 더 짧습니다 (5 분), 그러나 트리에틸아민 및 히드라진 처리 후에 완료하기 위하여 그것을 몰기 위하여 충분합니다. 또한, EDA를 가진 짧은 반응 시간은 기본적인 조건에 완전히 보호된 RNA 올리고뉴클레오티드의 노출을 제한합니다.
스팟 또는 DNA전사(32,33,34)와 같은 대체 방법에 비해 체RNA 어레이 합성의 장점은 합성된 RNA 마이크로칩을 사용 전까지 보호된 형태로 저장하는 능력이며, 따라서 잠재적인 RNA 저하의 위험. 반면, RNA에 대한 합성 후 절차는 소모품과 시약이 멸균 상태로 유지되고 RNase가 없는 조건하에서 처리가 수행된다는 것을 의미합니다. 참고로, 혼성화 혼합물에 RNase 억제제가 첨가되면 RNA 특징에 대한 더 강력한 혼성화 신호를 얻을 수 없다는 것을 발견했습니다.
염기 민감성 단량체에 DNA 라이브러리의 합성은 표면에 몇 가지 제어 서열의 합성보다 더 복잡하며, 따라서 확실히 설계 오류가 발생하기 쉽습니다. 그러나 시퀀스 디자인(예: 서열 의 특성 및 개수)이 정확하다고 가정하면 이 목록을 노출 마스크 컬렉션으로 변환하고 정렬된 일련의 커플링 주기는 여전히 간단한 프로세스로 남아 있습니다. 그러나 표준 마이크로어레이 합성의 중요한 변형이 존재하며 고밀도 라이브러리 어레이의 성공적인 제작에 매우 중요합니다.
먼저, 염기민감성 dT단량체는 링커의 합성 후 제1 포스포라마이트로서 결합된다. 이 단량체의 결합수율 (그림 1)은 약 85 %28로상대적으로 낮은 것으로 나타났으며, 이는 ACN의 농도를 30 mM에서 50 mM으로 증가시키거나 반복하여 통합 속도를 개선하기위한 노력이 이루어지는 이유입니다. 커플링 단계: 신선한 단량체를 사용하여 두 개의 연속적인 커플링 반응 또는 두 개의 분리되었지만 연속된 커플링 주기.
두 번째 변화는 365 nm 의 빛을 편리하게 흡수하는 합성 세포의 후면 챔버에 β-카로틴 용액을 첨가한 것입니다. 이는 UV 광선이 어레이 기판에 반사되는 것을 방지하기 때문에 포토리소그래피 설정을 수정하는 중요한 수정입니다. 실제로, 기판 사이의 간질 매질을 통과 한 후, 들어오는 UV 광은 드릴 슬라이드를 통해 빠져 나와 셀의 석영 블록에 도달합니다. Fresnel 방정식은 수직 입사 UV 광의 ~4%가 3개의 하류 공기 유리 인터페이스(2nd 기판의 출구 측 및 석영 블록의 양쪽)와 합성 기판으로 다시 반사될 것으로 예측합니다. 광보호 올리고뉴클레오티드의 의도하지 않은 노출로 이어질 수 있습니다. 회절 과 산란은 또한 "오프 타겟"광방 보호에 기여하고, 따라서, 직접 합성의 오류 율에 영향을 미치는 뉴클레오티드 삽입에, 그러나 이러한 기여는 반사보다 훨씬 작고 주로 에 의해 해결 될 수있다 합성 밀도를 줄입니다(피처 간 간격 을 남깁니다). 우리는 세포의 하부 챔버에 있는 β-카로틴 용액의 수준이 배열 합성의 첫번째 분 도중 약간 감소하는 경향이 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 그러므로 감시되고 재조정될 필요가 있습니다.
마지막으로, 세 번째 변화는 탈세 용액으로, 아마도 정전기 상호 작용을 통해 표면에 결합 된 DNA 라이브러리를 유지하는 톨루엔에 대한 EtOH를 대체합니다. ACN 세척 후 합성 영역에 소량의 물을 가하면 라이브러리를 편리하게 수집할 수 있습니다. 그러나 이 과정은 EDA와 톨루엔의 수분 함량이 미미한 경우에만 성공하며, 핵산을 탈방 칵테일에 완전히 불용성으로 만듭니다. 대안적으로, DNA 라이브러리는 암모니아9,10,14,35를사용하여 칩으로부터 절단될 수 있으며, 이어서 DNA-함유 수성 암모니아 용액을 밤새 55°C로 가열하여 추가로 탈보호될 수 있다. 암모니아를 사용하여 DNA 라이브러리의 회복은 그러나 RNA와 호환되지 않습니다. 기저 클리브 기질 상에 대한 RNA 올리고뉴클레오티드는 전술한 것과 동일한 EDA/톨루엔 절차를 사용하여 표면으로부터 용출될수 있지만, Et3 N 및 히드라진 2단계 탈보호전략(28)이후의 끝에서 두 번째 단계에서만 가능합니다.
특정 한 기본 치료에 대 한 필요 없이 마이크로 어레이에서 올리고 뉴클레오티드 풀을 복구 하는 대체 전략 존재, 원칙적으로 포토리소그래피와 호환 하 고 효소의 사용에 의존. 예를 들어, 단일 데옥시우라실 뉴클레오티드는 우라실-DNA 글리코실라아제(UDG)의 표적일 수 있고, DNA 서열의 나머지 부분으로부터 절제되거나, 또는 단일 RNA 유닛은 RNase H형 2 효소 및 인산염 결합 5'에 의해 인식될 수 있다. , 5 'DNA 부분23을해제 .
우리는 지금 DNA, RNA 및 하이브리드 DNA/RNA 마이크로어레이의 종합을 위한 강력하고, 믿을 수 있고, 고밀도 방법을 가지고 있습니다. 이들은 혼성화 또는 결합 성 애약36을 위한 플랫폼으로 작용할 뿐만 아니라 복잡한 핵산 라이브러리를 생성하는 빠르고 저렴한 방법을 나타낸다. DNA 기반 디지털 데이터 저장의 경우, 마이크로어레이 포토리소그래피는 "쓰기" 병목 현상(즉, 합성에 의한 정보의 인코딩)에 대한 잠재적인 해결책이 될 수 있다. DNA와 de novo 유전자 어셈블리에서 디지털 인코딩의 성공은 합성 수준에서 오류 율로 변환하는 서열 충실도에 달려 있습니다. 현재 어레이 제작 프로토콜의 합성 및 광학 오류에 대해 논의하고 다른 곳에서 보고할 예정입니다. 이와 동시에 제작 규모와 처리량을 더욱 높이기 위한 노력이 진행되고 있습니다.
Disclosures
저자는 그들이 어떤 영리 단체와 제휴가 없음을 증명한다.
Acknowledgments
이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF 보조금 P23797, P27275 및 P30596)과 스위스 국립 과학 재단 (그랜트 #PBBEP2_146174)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide functionalization | |||
| Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
| CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
| Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
| N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
| Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
| Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
| Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
| Microarray synthesis | |||
| 0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
| 0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
| 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
| 250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
| 2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
| 365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
| 5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
| 5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
| Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
| Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
| DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
| DNA and RNA microarray deprotection | |||
| Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
| Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
| Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
| Imidazole | Sigma | 56750 | |
| Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
| Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
| Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
| β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
| Hybridization and scanning | |||
| 20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
| 5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
| Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
| BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
| EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
| GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
| Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
| MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
| MES sodium | Sigma | M3058 | |
| NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
| SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
| Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
| Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
| Data extraction | |||
| Excel | Microsoft | For data extraction | |
| MatLab | MathWorks | Microarray design | |
| NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
| Desalting and quantification | |||
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Toluene | Merck | ||
| ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |
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