Summary
I denna artikel presenterar vi och diskuterar nya utvecklingar i syntes och tillämpningar av nukleinsyremikromatriser fabricerade in situ. Närmare bestämt visar vi hur protokollen för DNA-syntes kan utökas till RNA och hur mikromatriser kan användas för att skapa hämtningsbara nukleinsyrebibliotek.
Abstract
Photolithography är en kraftfull teknik för syntes av DNA oligonukleotides på glas diabilder, eftersom den kombinerar effektiviteten av fosforamidite koppling reaktioner med precision och täthet av UV-ljus reflekteras från mikrometer stora speglar. Photolithography ger Microarrays som rymmer från hundratusentals upp till flera miljoner olika DNA-sekvenser, 100-NT eller längre, på bara några timmar. Med denna mycket stora sekvens utrymme, Microarrays är idealiska plattformar för att utforska mekanismerna för nukleinsyra · ligandinteraktioner, som är särskilt relevanta när det gäller RNA. Vi rapporterade nyligen om utarbetandet av en ny uppsättning av RNA-fosforamiditer kompatibla med in situ Photolithography och som senare användes för att odla RNA oligonukleotides, homopolymerer samt blandade-bas sekvenser. Här illustrerar vi i detalj processen för RNA microarray Fabrication, från experimentell design, instrumentell installation, array syntes, deprotection och final hybridisering assay med hjälp av en mall 25mer sekvens som innehåller alla fyra baser som ett exempel. Parallellt går vi bortom hybridisering-baserade experiment och utnyttja microarray Photolithography som en billig inkörsport till komplexa nukleinsyra bibliotek. För att göra det, är hög densitet DNA Microarrays fabricerade på en bas-känslig monomer som gör att DNA för att vara bekvämt klyvs och hämtas efter syntes och deprotection. Tillverknings protokollet är optimerat för att begränsa antalet syntetiska fel och för detta, ett skikt av β-karoten lösning införs för att absorbera UV-fotoner som annars kan reflektera tillbaka på syntes substrat. Vi beskriver i ett steg-för-steg hur hela processen med biblioteks förberedelse, från design till klyvning och kvantifiering.
Introduction
Den praktiska användningen av DNA-mikromatriser har traditionellt varit i studiet av variationer i gen uttrycks nivåer mellan två cellpopulationer, med hjälp av kompletterande strängar och fluorescens som en detektionsmetod1. Ibland, DNA Microarrays venture till bindande händelser med icke-nukleinsyra ligander, såsom proteiner, med en strategi för systematisk sekvens permutation som erbjuder en omfattande översikt av bindningen landskap2,3, 4,5. Denna metod omvandlar effektivt mikromatriser från enbart hybridisering ytor till plattformar med bred sekvens täckning, vilket skulle vara en tillgång för studiet av den rikare och mer komplex värld av RNA struktur och funktion. Med stöd av den extremt effektiva fosforamidite-kopplingsreaktionen6, kan in situ SYNTETISERADE DNA-matriser nu också betraktas som en billig källa till DNA7, vilket blir särskilt relevant med tanke på den ständigt ökande efterfrågan på nukleinsyraferial för gen församlingen8,9, DNA-baserade nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. På samma sätt kommer sekvenseringstekniker sannolikt att gynnas av utvecklingen av metoder som ger mycket komplexa blandningar av RNA-oligonukleotider13. I detta sammanhang, array Fabrication protokoll som gör det möjligt för oligonukleotides att syntetiseras på plats och vid hög densitet är idealiskt placerade för att tillgodose behoven hos det snabbt växande området av nukleinsyra bioteknik. Med ett så vitt skilda område som bioteknik kan syftet med varje ansökan dock kräva att DNA på microarray produceras antingen vid hög genomströmning eller med en mycket låg mängd syntetiska fel14,15, eller båda, vilket kräver en närmare titt på syntes protokollen av DNA Microarrays som historiskt sett har främst optimerats för hybridisering assays. Under tiden, in situ syntes av RNA Microarrays har visat sig vara en utmanande strävan, med de flesta av de svårigheter som är förknippade med den skyddande gruppen för 2 '-OH funktion, oftast en silylgrupp del i standard solid-fas syntes som avlägsnas med fluor-baserade reagenser, kemikalier som är oförenliga med glas-eller kisel ytor. Dessa frågor och utmaningar i DNA och RNA microarray syntes har nyligen varit föremål för en stor kropp av arbete, i synnerhet med Photolithography förhållningssätt16.
Photolithography använder UV-ljus för att avblockera oligonukleotides innan kopplingen och kräver masker för att konstruera ett mönster av UV-exponering, därigenom rumsligt organisera och kontrollera tillväxten av oligonukleotides. Fysiska masker har ersatts av datorstyrda micromirrors vars vippning selektivt reflekterar UV-ljus på mikroarraysubstratet17,18,19. Som UV-källa använder vi 365 nm ljus från en hög effekt LED-källa20. Nuvarande photolithographic uppställningar är utrustade med Micromirror Device matriser som innehåller 1024 × 768 speglar, vilket motsvarar mer än 780 000 individuellt adresserbara fläckar ("egenskaper") på en liten yta på bara 1,4 cm2, eller 1080p med matriser av 1920 × 1080, eller > 2 miljoner speglar. Var och en av speglarna i enheten har därför direkt kontroll över sekvensen som odlas på motsvarande funktion. Med undantag av UV-ljus, Photolithography fungerar något liknande enarrangera gradvis syntes teknik och adopterar den cykla-baserade phosphoramiditekemin. Bara det kräver en helt annan skyddsstrategi för RNA-syntes för att lyckas. Vi utvecklade en ny serie av ljuskänsliga RNA-fosforamiditer med hydrazin-labila skyddande grupper21. Dessa monomerer tillåter RNA att deskyddas under milda förhållanden som inte påverkar integriteten av ytan. En första deprotection steg använder trietylamin att ta bort cyanoetylfosfodiester skydda grupper, medan hydrazin används i en andra, separat steg för att ta bort dem på 2 '-OH och exocykliska Amin funktioner. På så sätt, RNA oligonukleotides ~ 30-NT i längd och i varje sekvens kan nu syntetiseras in situ på Microarrays22,23. Parallellt har vi också nyligen börjat ta itu med frågor om genomströmning, kvalitet och snabbhet i DNA och RNA Photolithography. Vi mätte kopplingen effektivitetsvinster > 99% för alla DNA och RNA amiditer (figur 1) och undersökt varje enskilt steg i oligonukleotid förlängning cykel, från oxidation tid, val av aktivator och optimal UV-exponering24 , 25. vi har fört in nya ljuskänsliga 5 "skydda grupper som kan avlägsnas på bara några sekunder, omvandla syntesen av hundratusentals 100mers till några timmar långa process26. Vi har också fördubblat genomströmningen av array Fabrication genom att exponera två substrat samtidigt27. Slutligen har vi infört en dT fosforamidite som innehåller en bas känslig Succinyl grupp som ett bekvämt sätt att klyva, samla in och analysera DNA och RNA oligonukleotides, som är centralt för biblioteks beredning28.
Trots den relativt vardagliga aspekten av DNA och RNA solid-fas syntes, särskilt för nukleinsyrafokemister, microarray Photolithography förblir en icke-trivial uppgradering som kräver en komplex installation, noggrann kontroll och övervakning av processen, och separata instruktioner för post-syntetisk hantering beroende på typen av oligonukleotid och typ av ansökan. I denna artikel vill vi ge en detaljerad presentation av hela steg-för-steg-förfarandet för in situ-syntes av DNA och RNA-mikromatriser av Photolithography, från experimentell design till dataanalys, med betoning på beredning av instrument och Förbrukningsvaror. Vi beskriver sedan de post-syntetiska deprotection metoder som motsvarar det avsedda syftet med microarray Fabrication (dvs, antingen hybridisering eller återvinning av nukleinsyra bibliotek).
Protocol
1. microarray design
- Skriv de sekvenser som ska syntetiseras i en textredigerare, 5 ' → 3 ', en rad per sekvens. För kvalitetskontroll 25mer, Använd sekvensen "GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC". Använd A, C, G och T bokstäver för DNA nukleotider och 5, 6, 7 och 8 nummer för RNA nukleotider.
- När det gäller bibliotek förberedelse, lägga till ett extra nummer (dvs 9) vid 3 ' slutet av varje sekvens. Detta kommer att motsvara kopplingen av den bas känsliga monomeren.
- Varje sekvens måste följas av ett kommatecken. Tilldela varje sekvens ett namn efter kommatecknet och kontrollera att varje körfält följer [sekvens, #sequence_name]-format (utan hakparenteser). Spara listan över sekvenser som en. txt-fil.
- Starta MatLab och ladda sedan programmet chipdesign. m. Kör programmet.
- I fönstret egenskaps panel läser du in layoutfilen microarray Entirechip . Ladda Millichip layoutfilen om målet är att syntetisera hela matrisen på fyra identiska platser.
- I fönstret egenskaps panel , under krets specifikation, väljer du Välj container och sedan syntes område. Under mönster, Välj mönstret som ger rätt mängd adresserbara funktioner, räkna antalet sekvenser × antal replikat. För kvalitetskontrollen 25mer, Välj mönstret 25:36.
- Under Välj behållareväljer du fiducial. Fiducial funktioner är vanligtvis syntetiseras i hörnen av syntes området och används för att extrahera hybridisering data. Med relaterat valt, skriva en sekvens (5 ' → 3 ') som kommer att syntetiseras på relaterat funktioner och som kan fungera som en positiv kontroll. För 25mer-experimentet använder du samma DNA-sekvens.
- Under sekvensläser du in textfilen som innehåller alla skrivna sekvenser. Kontrollera att randomize har valts. Ge en titel till experimentet i projektets titel och, i länkare sekvens, skriva ttttt (motsvarande en T5 länkare).
- Tryck på generera, sedan hitta matrisen designfiler och masker (figur 2) under MaskGen_delta_rc1/Designs mapp. Kontrollera att den innehåller ett visnings skript, en flödessekvens och en design fil.
- Öppna visnings skriptet för biblioteks förberedelse. Lägg till en extra rad längst ned i visnings skriptet som kopierar exakt den första raden i skriptet (t. ex. Visa First_Mask. bmp 150). Detta kommer att ta bort den terminal photoskyddgrupp vid 5 ' slutet av alla oligonukleotides.
- Starta jobbskaparprogrammet Autojob , Läs in en mall genom att klicka på Läs in malloch klicka sedan på Visa skript för att läsa in den visnings skriptfil som har genererats av MATLAB. Tryck på generera. Detta steg kommer att skapa en serie instruktioner, som kallas en jobfile, som kommer att kontrollera kommunikationen av datorn med micromirrors och DNA-synthesizer.
2. Skjut förberedelse och funktionalisering
- Borra en bild i två lägen som motsvarar placeringen av inlopps-och utloppsslangen på syntes cellen. Använd en 0,9 mm diamant bit på en CNC-router för att exakt och tillförlitligt borra. Skölj de borrade rutschkanorna med ultrarent vatten och ordna dem i ett skjutställ.
- Rengör ytorna genom att sonicera bilderna i ett vattenbad innehållande 5% av en ammoniakbaserad specialrengöringsmedel i 30 min vid 35 ° c. Skölj bilden med dubbeldestillerat H2O och överför dem i ett rent, torrt rack.
- Ordna borrade och oborrade Mikroskop diabilder i ett skjutställ. I en stor graderad cylinder, Förbered funktionaliseringslösningen genom att blanda 475 mL etanol (EtOH) med 25 mL ddH2O, 10 g silaniserande reagens (N-(3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramid) och 1 ml ättiksyra. Rör om väl tills det är homogent och överför sedan i en lämplig, sluten behållare.
- Placera den laddade racket i behållaren, Stäng locket och låt behållaren klippa försiktigt på en orbital Shaker för 4 h vid rumstemperatur.
- Efter 4 h, kassera funktionaliseringslösningen och Ersätt med 500 mL tvättlösning, bestående av 475 mL EtOH, 25 mL ddH2O och 1 ml ättiksyra. Agitera långsamt i 20 minuter vid rumstemperatur, kassera sedan och Ersätt med 500 mL färsk tvättlösning.
- Efter ytterligare 20 minuter vid rumstemperatur, kassera lösningen, torka av glasen med en ström av argon och bota dem i en förvärmd vakuumugn vid 120 ° c. Efter 2 h, Stäng av ugnen och vakuumpumpen men lämna bilderna under reducerat tryck över natten. Ta sedan tillbaka ugnen till atmosfärstryck och förvara bilderna i en exsickator tills den används ytterligare.
3. beredning av syntes reagenser och reaktanter
- Placera fosforamiditepulver (figur 1) från deras Förvaringstemperatur (-25 eller-45 ° c) till rumstemperatur i en exsickator.
- När fosforamiditer nådde rumstemperatur, lös upp pulvret med en volym av Ultra-torrt acetonitril (< 30 ppm H2O) för att uppnå 30 mm koncentration för standard-DNA och RNA-fosforamiditer, och 50 mm för den bas känsliga DT-monomeren ( bibliotek förberedelse). Tillsätt en liten molekylär siktar påse för att fånga alla spår av fukt.
- Bered en lösning på 1% (w/w) Imidazol i DMSO genom att lösa upp 11 g Imidazol i 1 L torr DMSO. Skaka flaskan väl tills den är helt upplöst. Fäst lösningen på den extra porten på DNA-syntet. Detta kommer att vara den exponering lösningsmedel som krävs för fullständig borttagning av 5 ′-photobeskyddande grupp.
- För syntes av bibliotek, Bered en lösning på 1% (w/v) β-karoten i diklormetan genom att lösa upp 100 mg β-karoten i 10 mL diklormetan. Skaka väl i en bärnstensfärgad glas flaska och Linda sedan in aluminiumfolie.
4. beredning och övervakning av mikromatrisens syntes.
- Rekord temperatur och luftfuktighet i microarray Fabrication rummet och se till att DNA-synthesizer är under tillräckligt helium tryck.
- Slå på den UV-LED och dess kylfläkt. Fäst en UV-mätningsmätare på det inkommande UV-ljusets fokalplan och slå på den (figur 3a).
- Starta programmet jobfile/Micromirror/Synthesis Files Controller (med namnet Wicell) på datorn. Aktivera och starta sedan Micromirror Device-enheten och ladda en helvit mask fil genom att högerklicka på DMDoch sedan välja Ladda bild.
- Högerklicka på UVS-ikonen och välj UV- slutare öppen. Läs strömvärde (i mW/cm2) på intensitetsmätaren och räkna 60 s. Efter 60 s, Läs strömvärde igen och anteckna start-och slutvärden. Stäng avtryckaren genom att välja UV - slutare Stäng och Stäng av intensitet mätaren. Beräkna det genomsnittliga UV-intensitetsvärdet i mW/cm2.
- Beräkna den exponeringstid som krävs för att nå en strålningsenergi på 6 J/cm2 för 5 '-NPPOC photodeprotection (DNA och RNA Microarrays) och 3 J/cm2 för 5 '-bznppoc photodeprotection (DNA-bibliotek),
helt enkelt efter relationen. - I programvaran DNA synt Workstation skapar du en sekvensfil i Sekvensredigeraren genom att kopiera och klistra in innehållet i flödessekvensen som genereras av MatLab. Lägg till en extra två tvättsteg vid 3 ' (standard cykel bokstaven: s) för att tvätta ytan av substrat innan du går vidare till den första kopplingen. Spara och exportera sekvensfilen.
- I protokoll redigeraren för arbetsstationsprogram varan skapar du ett protokoll som innehåller en dedicerad cykel uppkallad efter var och en av bokstäverna och numren som finns i sekvensfilen (t. ex. om en sekvensfil bara innehåller bokstäverna A, C, G och T, måste protokoll filen innehåller fyra cykler, namngivna A, C, G och T).
- Ställ in kopplings tiden för DNA-fosforamiditer (cykler A, C, G och T) till 15 s, till 120 s för rU phosphoramidite (cykel 8) och till 300 s för rA, rC och rG fosforamiditer (cykler 5, 6 och 7). För biblioteks beredning, Ställ in kopplingen av den baskänsliga, klyvbara dT-monomeren till 2 × 120 s (tabell 1 och tabell 2).
- Se till att väntetiden mellan två händelse 2 ut kommunikationshändelser i varje cykel motsvarar den beräknade UV-exponeringstiden för att nå den nödvändiga strålningsenergin. När det gäller sekvensen filen, Spara och exportera protokoll filen.
- I WiCell programvara, Ladda jobbet, sekvens och protokollfiler i sina respektive sub-Windows klicka sedan på Skicka för att skicka sekvensen och PROTOKOLLFILER till DNA-synthesizer.
- I sekvensen fil, räkna antalet kopplingar för varje fosforamidite.
- För att mäta erforderlig volym (i μL) av fosforamiditelösning som behövs för att utföra varje syntes, multiplicera antalet kopplingar med 60. Tillsätt 250 μL till varje volym för säkerhet och priming av linjen på DNA-syntet. Använd en bas volym på 250 μL för fosforamiditer som endast kräver en enda koppling.
- Överför snabbt lösningen till injektionsflaskorna på DNA-syntet som motsvarar port bokstaven/numret i protokollcyklerna.
- Prime hamnarna med fosforamidite lösningar med 10 Prime pulser vardera för att fylla linjerna med reagens. Prime den acetonitril tvätta linjen innan du fäster reaktions cellen.
- För att montera syntes cellen, placera en tjock (250 μm) perfluorelastomer (FFKM) packning först på kvarts blocket av cellen. Placera en borrad, funktionaliserad Mikroskop glida ovanpå den första packningen, och kontrollera att hålen på bilderna ansluter med inlopps-och utloppsslangen i syntes cellen.
- Placera en andra, tunn (50 μm) polytetrafluoroetylen (PTFE) packning över den borrade bilden, som omger de två hålen. Slutligen, placera en andra, funktionaliserade men oborrad bild ovanpå den andra packningen (figur 3B). Placera en 4-skruv metallram ovanpå den monterade dubbel-substrat cell och dra åt skruven till samma klämkraft (0,45 nm) med hjälp av en moment skruvmejsel.
- Anslut inlopps-och utloppsslangen till DNA-syntet. Prime den acetonitril tvätta linje och kontrollera korrekt flöde av acetonitril (ACN) genom substrat. Demontera och sätta ihop cellen om något läckage av ACN kan observeras i detta skede. Mät ACN-volymen på avfalls linjen efter att ha gått igenom 7 cykler av ACN priming. Denna volym bör vara 2 mL.
- Fäst syntes cellen på fokalplanet av inkommande UV-ljus. När det gäller biblioteks beredning, bifoga en extra inlopps-och utloppsledning till cellens bak och fyll tillbaka kammaren med β-karoten lösning (2 mL lösning är tillräcklig). Se till att det inte finns något läckage (figur 3C).
- Starta syntesen genom att först klicka på Run i wicell programvaran. Vid det första WAIT-kommandot i jobbfilen, tryck på Start på DNA-syntet.
- Under syntesen, regelbundet kontrollera att visningen av maskfiler sammanfaller med UV-exponering och öppnandet av slutaren.
- Efter syntesen av vanliga mikromatriser, koppla bort cellen från syntet, demontera cellen och använda en diamant penna för att etch syntes numret på glas bilderna. Etch numret på den icke-syntetiserade sidan av varje bild. Överför bilderna till 50 mL centrifugrör och förvara i ett torkat område tills det används vidare.
- Efter syntesen av biblioteket Microarrays, först dränera β-karoten lösning ur kammaren sedan tvätta den genom att flyta 2 × 5 mL CH2cl2, sedan avlopp. Fortsätt med demontering enligt steg 4,21. Den syntetiserade matrisen kan vara synlig för blotta ögat (figur 4).
helt enkelt efter relationen.5. deprotection för DNA microarray
- Fyll en Färgnings glas burk med 20 mL EtOH och 20 mL etylendiamamin (EDA). Placera DNA-bara mikromatriser vertikalt i burken, Stäng locket, och låt bilderna att DEPROTECT för 2 h vid rumstemperatur.
Varning: EDA är en akut giftig, frätande och brandfarlig vätska. Arbeta med handskar i ett väl ventilerat draghuv. - Efter 2 h, hämta bilderna med hjälp av pincett och skölj dem noggrant med dubbeldestillerat H2O.
- Torka av glasen i en microarray centrifug i några sekunder och förvara sedan i en exsickator.
6. RNA microarray deprotection
- Bered en torr lösning på 2:3 trietylamin/ACN (20 mL respektive 30 mL vardera) i ett 50 mL centrifugerör. Överför en RNA microarray glida in i Centrifugera röret, Stäng locket och Linda sedan med plast tätning film. Skaka försiktigt centrifugerröret på en orbitalskak i 1H och 30 min vid rumstemperatur.
- Efter 1H och 30 min, ta bort bilden, tvätta med 2 × 20 mL torrt ACN och torka sedan i en microarray Centrifugera i några sekunder.
FÖRSIKTIGHET: trietylamin är en akut giftig, frätande och brandfarlig vätska. Acetonitril är giftigt och brandfarligt. Arbeta med handskar i ett väl ventilerat draghuv.
Anmärkning: första deprotection steg komplett. - Bered en 0,5 M hydrazin hydrat lösning i 3:2 pyridin/ättiksyra. Blanda först 20 mL ättiksyra och 30 mL pyridin i en graderad cylinder. Vänta tills lösningen svalnat innan du lägger till 1,21 mL hydrazinhydrat. Överför runt 40 mL av den resulterande lösningen till ett 50 mL centrifugeringsrör.
FÖRSIKTIGHET: hydrazin hydrat är en akut giftig och frätande vätska. Pyridin är mycket brandfarlig och akut giftig. Ättiksyra är brandfarlig och frätande. Arbeta med handskar i ett väl ventilerat draghuv. - Efter den första deprotection steg, överföra RNA glida in i hydrazin hydrat lösning, Stäng locket och Linda med plast tätning film. Skaka försiktigt röret på en orbitalskak för 2 h vid rumstemperatur. Efter 2 h, ta bort bilden, tvätta med 2 × 20 mL torrt ACN och torka sedan i en microarray centrifug i några sekunder.
Anmärkning: andra deprotection steg komplett. - Om RNA microarray också innehåller DNA nukleotider, gå vidare med ett tredje deprotection steg. I ett 50 mL centrifugertub, blanda 20 mL EDA med 20 mL EtOH. Tillsätt DNA/RNA microarray till 1:1 EDA/EtOH lösning och lämna vid rumstemperatur i 5 min.
- Efter 5 min, ta bort bilden, tvätta med 2 × 20 mL sterilt vatten och torka sedan i en microarray centrifug och förvara i en exsickator.
7. hybridisering med en Fluorescent-märkt kompletterande programområde
- Tina Acetylerat bovint serumalbumin (10 mg/mL) och Cy3-märkt komplementär-sträng (100 nM) och Värm upp till rumstemperatur.
- I en 1,5 mL sterilt mikrocentrifug rör, Blanda 150 μL av 2x MES buffert (200 mM 2-(N-morpholino) etansulfonsyra; 1,8 M NaCl; 40 mm EDTA; 0,02% Tween-20) med 26,7 μl av Cy3-märkt DNA, 13,4 μl av ACETYLERAD BSA och 110 μl sterilt H2O. Blanda och Vortex. Dubbla volymen om båda bilderna ska användas för hybridisering.
- Förvärm en hybridiserings ugn till en temperatur under Tm i duplex men tillräckligt hög för att säkerställa god diskriminering mellan full-match och icke-match sekvenser. För kvalitetskontroll 25mer, Ställ in temperaturen till 42 ° c (Tm 59 ° c).
- Placera försiktigt en självhäftande 300 μL hybridiserings kammare över syntes området på varje bild och Pipettera i hybridiserings lösningen som utarbetats ovan. Täck hålen i kammaren med självhäftande prickar och Linda hela bilden i aluminiumfolie.
- Placera mikroarraybilden i hybridiserings ugnen, täck över och låt den rotera försiktigt vid den valda hybridiseringstemperaturen i 2 timmar.
- Efter 2 h, lossa bilden, ta bort aluminiumfolie och försiktigt riva av hybridisering kammaren. Överför bilderna till ett centrifugeringsrör som innehåller 30 mL icke-strikt tvättbuffert (NSWB, 0,9 M NaCl, 0,06 M fosfat, 6 mM EDTA, 0,01% Tween20, pH 7,4) och skaka kraftigt i rumstemperatur i 2 minuter.
- Överför bilden till ett centrifugeringsrör som innehåller 30 mL strikt tvättbuffert (SWB, 100 mM MES, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween20) och skaka kraftigt i 1 min.
- Slutligen, överför bilden till ett centrifugeringsrör som innehåller 30 mL slutlig tvättbuffert (FWB, 0,1 x natriumsaltlösning citrat) och skaka i några sekunder. Torka av bilden i en mikroarray-centrifug.
- Placera den torra mikromatrisen, syntes området vänd nedåt, i bildhållaren på microarray scanner. För Cy3-märkta duplex, skanna med 5 μm upplösning med en 532 nm excitation våglängd, ett 575 nm filter och en Fotomultiplikator av 350. Spara högupplöst skanning som en TIF-bildfil (bild 5a).
8. Data utvinning och analys
- Före datautvinning, rotera den sparade array Scan i en bildredigerare för att placera den längsta kedjan av relaterat funktioner i det övre vänstra hörnet av skanningen. Spara den roterade bilden.
- Starta Nimblescan, tryck sedan på Arkiv | Öppna och ladda array Scan. Sedan, genom att klicka på Bläddra i den design fil underavsnittet, läsa in den. NDF -designfil som genererades automatiskt under utformningen av microarray-experimentet. Klicka sedan på Öppna.
- Klicka på Automatisk kontrast/ljusstyrkai vyn. Klicka på ikonen manuellt Justera ovanför skanningen. Placera fyra kvadratiska markörer i skannens fyra hörn och klicka sedan på den nu gröna ikonen igen. Extrahera hybridiserings data genom att klicka på analys, rapporter och sedan avsöknings rapport.
- Öppna. avsöknings rapportfil i en kalkylblads redigerare. Behåll kolumnerna B och I och kassera resten innan du fortsätter med att beräkna genomsnittsvärden och standardavvikelse från de extraherade uppgifterna (figur 5B).
9. bibliotek avskydd, klyvning och återhämtning
- För att avskydda och klyva DNA-bibliotek, Förbered en lösning av 1:1 torr EDA/toluen i en 50 ml centrifug röret. Sänk ned bilden i klyvning lösningen, Stäng bilden och Linda med plast tätning film, sedan försiktigt rotera i en orbitalskakor för 2 h vid rumstemperatur.
- Efter 2 h, ta bort bilden och tvätta med 2 × 20 mL noggrant torr ACN. Ta bort bilden och låt den lufttorka.
- Tillsätt med pipett 100 μL sterilt H2O över det nu urskiljbara syntes området. Pipet lösningen upp och ner några gånger innan du överför den till en 1,5 mL microcentrifug röret. Upprepa processen och kombinera microarray eluatet i samma rör (figur 6).
- Avdunsta 2 × 100 μl av spåneluatet till torrhet och sedan lös åter i 10 μl av nukleasfria H2O. Mät absorbansen på en UV-VIS spektrofotometer.
- Desalt DNA-biblioteket på en 10 μL pipettspets utrustad med C18-harts. Först, omvandla chip eluatet i en 0,1 M trietylammonium acetat (TEAA) buffrad lösning.
- Blöt hartset genom att aspirera 3 x 10 μL av H2O/ACN 1:1, och jämställ kådan genom tvättning med 3 x 10 μl 0,1 M teaa buffert. Bind DNA genom att Pipettera spåneluatet 10 gånger upp och ner genom kådan. Tvätta kådan med 3 x 10 μL 0,1 M TEAA-buffert, 3 x 10 μL H2O.
- Eluera det avsaltade DNA från spetsen genom att tvätta kådan med 10 μL H2O/ACN 1:1. Torka av den avsaltade lösningen och lös åter i 10 μl sterilt H2O. Mät absorbansen på en UV-VIS spektrofotometer (figur 7). Indunsta biblioteket till torrhet och förvara vid-20 ° c tills vidare användning.
Representative Results
DNA och RNA microarray hybridisering
Figur 5 visar resultatet av en hybridiserings analys utförd på en mikroarray innehållande DNA-och RNA-versionerna av en 25mer sekvens (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' i DNA-form). Skanningen i figur 5a visas i en greenscale format som motsvarar excitation/emission spektrum av Cy3 fluorescens, med fluorescensintensitet registreras i godtyckliga enheter mellan 0 och 65536. Matrisdesignen följde 25:36-funktionslayouten som beskrivs i avsnittet protokoll. Skanningen visas efter korrekt orientering av matrisen, med det övre vänstra hörnet befolkade med den längsta kedjan av relaterat funktioner. Här innehåller relaterat funktioner DNA-versionen av 25mer och bör i princip alltid ge en positiv fluorescens signal för att utföra skanning justering och datautvinning. Den hybridiserade microarrayen bör synas jämnt ljust, med kantar av syntes området vara emellertid vanligt ljusare än centrera (upp till 50% ljusare). Den stora mängden sekvens replikat, slumpmässigt fördelade över hela området, minskar effekterna av rumsliga artefakter. Här var varje sekvens (DNA och RNA) syntetiseras på 2 000 slumpmässiga platser. Det är typiskt låg fluorescens buller (bakgrund), < 50 a.u., vilket leder till en signal/brus förhållande i storleksordningen 200:1 till 800:1 i hybridisering assays. Efter datautvinning beräknas fluorescensintensiteter ut och ritas ± SD.
Det finns en signifikant variation i absoluta fluorescensvärden mellan experiment. Här visar vi resultaten för tre oberoende synteser med samma tillverknings parametrar och samma post-syntetiska hantering. Den 25mer DNA, när hybridiseras till dess kompletterande Cy3-märkt DNA-sträng, kommer att ge fluorescens signaler som sträcker sig någonstans från 20 000 till 30 000, mycket sällan över eller under. Den 25mer RNA, när hybridiseras till samma Cy3-märkt DNA komplement, kommer att ge fluorescens intensiteter på motsvarande funktioner som sträcker sig från 15 000 till 20 000. Dock kommer fluorescensintensiteten hos RNA/DNA-duplexerna ibland sjunka under 8 000, då motsvarande DNA/DNA duplex fortfarande fluorescerar inom intervallet 20000-30000. I sådana fall kan resultaten för RNA betraktas som suboptimala. En syntes eller hybridisering misslyckande, antingen för DNA eller RNA, kommer att märkas omedelbart under skanning från den uppenbara bristen på fluorescens. Det finns flera möjligheter för RNA-syntesen att antingen misslyckas eller delvis lyckas och de kommer att beskrivas i diskussionsdelen.
Bibliotek deprotection, klyvning och återhämtning
Beroende på komplexiteten och tätheten av biblioteket, kan formen och konturerna av den syntetiserade matrisen ses utan förstoring men under ordentlig belysning (figur 4), med DNA fortfarande i skyddad form. Efter deprotection med EDA/toluen, och före tillsats av vatten för att samla in det kluvna biblioteket, kan syntes området som innehåller de nu deskyddade oligonukleotiderna sticka ut som en hydrofila zon, när resten av glas bilden kommer att visas täckt med ett grumligt hydrofoba skikt. Den direkta observationen av syntes området beror på den totala arean som används för att syntetisera oligonukleotider: en större användning av syntes området kommer att motsvara en större chans att klara distinktionen mellan hydrofila och hydrofoba områden på ytan. Omvänt, bibliotek syntetiseras med färre speglar och med mindre funktioner kan inte vara omedelbart observerbara.
På samma sätt är mängden återvunnet DNA efter avsaltning direkt proportionell mot den totala arean som används för syntes. Om alla funktioner används för oligonukleotidsyntes bör klyvning och återvinningsförfarande ge mellan 25 och 30 pmol av DNA. En 10% användning av syntes området kommer därför endast att ge omkring 3 pmol av DNA.
Figur 1 . Kemiska strukturer av DNA och RNA-fosforamiditer som används i oligonukleotidsyntes av microarray Photolithography. Standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) ljuskänsliga skyddande grupper på 5 '-OH används i vanliga DNA och RNA microarray syntes för hybridisering ändamål. För syntesen av komplexa DNA-bibliotek, den mer photolabile Benzyl-NPPOC (BzNPPOC) är att föredra vid 5 '-OH, som BzNPPOC avlägsnas dubbelt så snabbt som NPPOC, vilket avsevärt minskar total microarray syntes tid. DNA oligonukleotides för bibliotek kräver också kopplingen av en klyvbar dT monomer vid 3 ' änden. Denna monomer, som bär en Succinyl Ester funktion, kommer att klyvas under deprotection, vilket gör det möjligt för DNA som skall samlas in från mikrochip. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Exempel på en mask som en bildfil som skickas till Micromirror Device-enheten under UV-exponering. De vita pixlarna motsvarar speglar som kommer att lutas i "on"-läge, reflekterande UV-ljus på syntes cellen. Svarta pixlar motsvarar "off"-speglar, där UV-ljuset reflekteras bort från cellen. Vita pixlar kommer därför att möjliggöra kopplingen av nästa inkommande fosforamidite på oligonukleotides finns på motsvarande funktioner på glaset substrat. Oligonukleotides syntetiseras på de funktioner vars motsvarande speglar är, i denna mask fil, svarta pixlar kommer dock att förbli inert under nästa koppling händelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Fotografier av microarray Photolithography optisk och syntes setup. (A) optisk krets för UV-exponering. UV-ljus från UV-LED först homogeniseras genom en rektangulär-tvärsnitt ljus-röret sedan reflekterar på micromirrors. Micromirrors som har lutats i en "OFF" läge kommer att återspegla UV-ljus bort från syntes cellen, men micromirrors i "ON" läge kommer att återspegla ljus på syntes cellen, som ligger på fokalplanet, genom att först passera genom en 1:1 offner relä avbildningssystem. (B) syntes cellen, en gång monterad, består av en borrad bild placerad först på kvarts blocket av cellen, åtskilda av en tjock PTFE packning (visas inte). En andra, icke-borrad bild är sedan placerad över den borrade bilden, åtskilda av en tunn PTFE packning. En metallram (visas inte) håller ihop monteringen. (C). för bibliotek beredning, när syntes cellen är fäst vid fokalplanet av inkommande UV-ljus, är den kammare som ligger mellan kvarts blocket och den borrade bilden fylld med en 1% lösning av β-KAROTEN i CH2cl2. För att göra detta är ett extra inlopps-och utloppsrör anslutet till kvarts blocket och den orangefärgade lösningen flödar från höger till positionen längst till vänster. Flödet av reagenser och lösningsmedel för syntesen visas i vita pilar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Syntes området är vanligtvis synligt för blotta ögat. Här kan ett DNA-bibliotek ses på glasytan direkt efter syntesen, med DNA fortfarande i skyddad form. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Hybridisering analyser till 25mer DNA och RNA sekvenser syntetiseras in situ på Microarrays. (A) fluorescens Scan av hela hybridiserade DNA och RNA microarray. 25mer DNA och RNA oligonukleotides hybridiseras till deras Cy3-märkta kompletterande strängar. Matrisen skannades med en laser vid en 532 nm excitation våglängd, vid 5 μm upplösning. (B) fluorescensintensiteter (godtyckliga enheter) av DNA: DNA och RNA: DNA duplex i tre separata experiment. De ljusgröna uppgifterna för in situ syntetiserade RNA-oligonukleotider kan anses vara suboptimala, jämfört med fluorescensintensiteten hos motsvarande DNA-sekvenser. Felstaplar är SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Schematisk representation av deprotection, klyvning och återvinning förfarande för DNA-bibliotek syntetiseras på Microarrays. DNA-sekvenser odlas på en baskänslig lånet DT-nukleosid (visas i det zoomade området). Efter syntes, deprotection av DNA oligonukleotides (bas skyddande grupper representeras som röda sfärer) i EDA/toluen lämnar det deskyddade materialet elektrostatiskt bunden till ytan och kan sedan pipetteras ut genom att tillämpa en liten mängd vatten på det syntetiserade området. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Representativ absorbansspektrum (220-350 nm) i ett klyvt, desaltat DNA-bibliotek innehållande 4 000 olika sekvenser, 100-NT i längd. Totalt 940 ng av DNA isolerades från en enda Array syntes, vilket motsvarar 30 pmol av DNA totalt, eller 15 pmol per glas substrat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Representativ cykel protokoll för koppling/oxidation/photodeprotection av 5 '-BzNPPOC-da, förutsatt att motsvarande fosforamidite var lastat på port "A". Kopplings tiden (i sekunder) visas på raden "parmonomer". Den UV photodeprotection tid, här motsvarar en strålningsenergi på 3 J/cm2 (bznppoc Photochemistry), beräknas som den tid som förflutit mellan de två "händelse 2 ut" kommunikations signaler.
Tabell 2. Representativ cykel protokoll för koppling/oxidation/photodeprotection av 5 '-NPPOC-ra, förutsatt att motsvarande RNA-fosforamidite lastades på port "A". Kopplings tiden (i sekunder) visas på raden "parmonomer". Den UV photodeprotection tid, här motsvarar en strålningsenergi på 6 J/cm2 (nppoc Photochemistry), beräknas som den tid som förflutit mellan de två "händelse 2 ut" kommunikations signaler.
Discussion
Solid-fas DNA och RNA-syntes är bröd och smör i varje nukleinsyra kemi Lab, och även om tillägg av Photolithography komponenten är visserligen en komplicerad operation, microarray Fabrication medieras av UV-ljus är också en mycket tillförlitlig process . Det är dessutom den enda tillgängliga metoden för in situ RNA-syntes på mikromatriser. Fortfarande, som i alla etappvis experimentella förfarande, det finns gott om utrymme för mänskliga fel.
Det kanske mest kritiska steget är kopplingen av en fosforamidite, eftersom det måste vara en ständigt högavkastande kemisk reaktion för att ge oligonukleotides med få syntetiska fel. I vårt microarray Synthesis Protocol är phosphoramidite koppling ännu mer avgörande för övergripande syntes kvalitet eftersom tillverkningsprocessen kringgår tak och förebygger oligonukleotidrening. Stegvis koppling effektivitet över 99% har beräknats för alla ljuskänsliga DNA och RNA-fosforamiditer, även för mycket korta kopplingstider (15 s)24 men lägre kopplings avkastning kan ibland förekomma, särskilt när det gäller GD amidites. Stabiliteten hos de solubiliserade fosforamiditer vid rumstemperatur har undersökts innan och visades bero på vilken typ av nukleobas, med guanosin fosforamiditer benägna att omfattande nedbrytning i endast en fråga om dagar29, 30. Men vid förvaring vid-25 ° c konstaterades att GD fosforamiditer som upplöstes i ACN som 30 mM lösning var stabila i flera veckor. Den relativa instabiliteten hos GD fosforamidite-lösningar vid rumstemperatur innebär dock att de inte bör hållas knutna till DNA-syntesen i flera dagar.
För RNA-fosforamiditer, är kopplingen avkastningen mycket beroende av fosforamidite kvalitet (som kan bedömas med 31P NMR spektroskopi) och kopplingstid. Kopplingstider på 5 minuter för rA, rG, rC och 2 min för rU förefaller nödvändiga. Faktum är att vi fann att förkorta kondensations tiden till 2 min för alla RNA-fosforamiditer ledde till betydligt lägre hybridisering signaler.
Själva DNA-syntet, liksom reagenser och lösningsmedel, måste absolut vara så rena som möjligt för att uppnå den högsta avkastningen av oligonukleotidsyntes. Men olösligt material, salter eller partiklar, kan ackumuleras över tiden i linjer och slangar i leveranssystemet, vilket leder till en gradvis minskning av konsumtionen av reagenser och reaktanter. Om en allmän rengöring av syntet inte löser en låg effekt volym, kan en ökning av antalet pulser vara en alternativ lösning. Särskilt användbart när det gäller låg fosforamidite-förbrukning, kan linjen i kopplings protokollet som motsvarar pumpningen av en blandning av fosforamidite och aktivator (tredje raden i kopplings underavsnittet i tabell 1 och tabell 2) 6 till 9 pulser utan märkbar negativ effekt på syntes kvaliteten. Dessutom, antalet pulser av aktivator som behövs för att få amidite/Activator blanda till syntesen substrat (för närvarande 6, fjärde raden i kopplingen underavsnitt, se tabell 1 och tabell 2) beror på DNA-synthesizer själv samt på slanglängd i syntes cellen. Detta nummer kan justeras efter byte av fosforamidite med en färgad lösning och räkna antalet pulser som behövs för att driva den färgade blandningen till glaset substrat för koppling.
Metoden som beskrivs häri gör det möjligt för DNA och RNA-syntes att fortsätta samtidigt, på samma mikroarray. Hybrider av DNA och RNA kan också förberedas utan ändring av array Fabrication-protokollen, och så länge som trestegs deprotection-protokollet följs. Det bör dock noteras att RNA-bara mikromatriser bara kräver en två-stegs deprotection: en decyanoethylation först med et3N följt av hydroxylgrupp och bas deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser befanns vara ofullständigt deprotected under dessa förhållanden, och behöver ytterligare steg i EDA för att verkställa fullständig avlägsnande av fenoxyacetyl (PAC) grupper. Denna extra behandling med EDA är kortare (5 min) än för standard deprotection av DNA Microarrays31, men det är tillräckligt för att köra den till slutförande efter trietylamin och hydrazin behandlingar. Dessutom begränsar en kort reaktionstid med EDA exponeringen av en fullständigt avskyddad RNA-oligonukleotid till grundläggande villkor.
En fördel med in situ RNA-matris syntes över alternativa metoder som spotting eller DNA-transkription32,33,34 är förmågan att lagra syntetiserade RNA mikrochip i skyddad form tills den används, vilket undviker risk för potentiell RNA-nedbrytning. Post-syntetiska procedurer för RNA innebär å andra sidan att förbrukningsvaror och reagenser hålls sterila och att hanteringen utförs under RNase-fria förhållanden. Notera, vi fann att tillsats av RNase inhibitor till hybridisering mixen inte ger starkare hybridisering signaler för RNA-funktioner.
Syntesen av DNA-bibliotek på en bas känsliga monomer är mer komplex än syntesen av några kontrollsekvenser på en yta, och som sådan är säkert mer benägna att designa fel. Ändå, förutsatt att sekvensen design (dvs. arten och antalet sekvenser) är korrekt, omvandla denna lista till en samling av exponerings masker och en ordnad serie av kopplingscykler förblir en enkel process. Emellertid, viktiga variationer från standard microarray syntes finns och är avgörande för en lyckad tillverkning av en hög densitet bibliotek array.
Först kopplas en Base-Sensitive avskiljare monomer som den första phosphoramiditen efter syntes av länkaren. Kopplings avkastningen för denna monomer (figur 1) konstaterades vara relativt låg, cirka 85%28, varför ansträngningar görs för att förbättra dess införlivande takt, antingen genom att öka dess koncentration i ACN från 30 mm till 50 mm, eller genom att upprepa kopplings steg: två sammanhängande kopplings reaktioner med färska monomerer eller två separata men sammanhängande kopplingscykler.
Den andra förändringen är tillsatsen av en β-karoten lösning i den bakre kammaren i syntes cellen, som bekvämt absorberar 365 nm ljus. Detta är en viktig modifiering av Photolithography setup eftersom det hindrar UV-ljus från att reflektera tillbaka till mat ris substrat. Faktum är att efter passage av interstitiell mediet mellan substrat, inkommande UV-ljus utgångar genom den borrade bilden och når kvarts blocket av cellen. Den Fresnel ekvationer förutsäga att ~ 4% av vinkelrätt incident UV-ljus kommer att reflektera från var och en av de tre nedströms luft-glas gränssnitt (Exit sidan av 2nd substrat och båda sidor av kvarts blocket) och tillbaka på syntesen substrat, som leder till oavsiktlig exponering av fotoskyddade oligonukleotider. Diffraktion och spridning bidrar också till "off-Target" photodeprotection och därför till nukleotid insättning, som direkt påverkar felfrekvensen av syntes, men dessa bidrag är mycket mindre än reflektioner och kan främst åtgärdas genom minska syntes tätheten (lämnar luckor mellan funktioner). Vi har funnit att nivån av β-karoten lösning i den nedre kammaren av cellen tenderar att något minska endast under de första minuterna av array syntes, och därför måste övervakas och justeras.
Slutligen, den tredje förändringen är deprotection lösning, ersätter EtOH för toluen, som håller klyvs DNA-biblioteket bunden till ytan, förmodligen genom elektrostatiska interaktioner. Genom att applicera en liten mängd vatten i syntes området efter ACN-tvättning kan biblioteket enkelt samlas in. Processen är dock endast framgångsrik om vattenhalt i EDA och toluen är minimal, vilket gör att nukleinsyran helt olöslig i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-bibliotek klyvas av chip med ammoniak9,10,14,35, sedan ytterligare deprotected genom upphettning av DNA-innehållande vattenlösning ammoniak till 55 ° c över natten. Återhämtningen av DNA-bibliotek med ammoniak är dock inte förenligt med RNA. RNA-oligonukleotider på ett basklyvbart substrat kan elueras från ytan med samma EDA/toluenförfarande som beskrivs ovan, men endast i det näst sista stadiet efter et3N och hydrazin två stegs deprotection strategi28.
Alternativa strategier för att återvinna oligonukleotid pooler från Microarrays utan behov av en specifik grundbehandling finns, är i princip förenligt med Photolithography och förlita sig på användningen av enzymer. Till exempel kan en enda deoxyuracil nukleotid vara målet för uracil-DNA glykosylase (UDG) och exciderade från resten av DNA-sekvensen, eller en enda RNA-enhet kan kännas igen av RNase H typ 2 enzymer och Phosphodiester Bond 5 "till RNA-klyvt , frigöra 5 ' DNA del23.
Vi har nu en kraftfull, pålitlig och hög densitet metod för syntes av DNA, RNA, och hybrid DNA/RNA Microarrays. Dessa kan inte bara fungera som plattformar för hybridisering eller bindande analyser36, men de utgör också ett snabbt och billigt sätt att producera komplexa nukleinsyra bibliotek. För DNA-baserad digital datalagring, microarray Photolithography kan bli en potentiell lösning på "skriva" flaskhalsen (dvs, till kodning av information genom syntes). Framgången i Digital kodning på DNA och i de Novo gen församling beror på sekvens trohet som, på syntes nivå, översätter till felfrekvens. Syntetiska och optiska fel i våra nuvarande array Fabrication protokoll kommer att diskuteras och rapporteras på annat håll. Parallellt pågår nu insatser för att ytterligare öka tillverknings skala och genomströmning.
Disclosures
Författarna intygar att de inte har någon anknytning till någon vinstdrivande organisation.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskaps fonden (FWF Grants P23797, P27275 och P30596) och schweiziska National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide functionalization | |||
| Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
| CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
| Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
| N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
| Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
| Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
| Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
| Microarray synthesis | |||
| 0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
| 0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
| 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
| 250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
| 2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
| 365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
| 5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
| 5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
| Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
| Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
| DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
| DNA and RNA microarray deprotection | |||
| Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
| Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
| Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
| Imidazole | Sigma | 56750 | |
| Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
| Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
| Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
| β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
| Hybridization and scanning | |||
| 20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
| 5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
| Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
| BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
| EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
| GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
| Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
| MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
| MES sodium | Sigma | M3058 | |
| NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
| SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
| Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
| Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
| Data extraction | |||
| Excel | Microsoft | For data extraction | |
| MatLab | MathWorks | Microarray design | |
| NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
| Desalting and quantification | |||
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Toluene | Merck | ||
| ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |
References
- Bumgarner, R. Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules. Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).
- Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).
- Franssen-van Hal, N. L. W., et al. Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays. Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support. Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides. Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).
- Kosuri, S., et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).
- Richmond, K. E., et al. Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis. Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).
- Schmidt, T. L., et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nature Communications. 6, (2015).
- Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).
- Erlich, Y., Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science. 355 (6328), 950-953 (2017).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Cleary, M. A., et al. Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis. Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).
- LeProust, E. M., et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).
- Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).
- Fodor, S. P. A., et al. Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science. 251 (4995), 767-773 (1991).
- Singh-Gasson, S., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).
- Pease, A. C., et al. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).
- Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).
- Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays. Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).
- Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition. Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).
- Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography. Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).
- Agbavwe, C., et al. Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays. Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).
- Sack, M., et al. Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups. Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).
- Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis. Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).
- Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression. Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).
- Lietard, J., et al. Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography. Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).
- Krotz, A. H., et al. Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).
- Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).
- McGall, G. H., et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).
- Collett, J. R., et al. Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers. Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).
- Buenrostro, J. D., et al. Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).
- Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).
- Tian, J., et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).
- Lietard, J., et al. Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).
