Summary
Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Fotolitografi, fosforamidit kaplin reaksiyonlarının verimliliğini mikrometre boyutlu aynalardan yansıyan UV ışığının hassasiyeti ve yoğunluğuyla birleştirerek, cam kaydıraklarda DNA oligonükleotidlerinin sentezi için güçlü bir tekniktir. Fotolitografi, sadece birkaç saat içinde yüz binlerceden birkaç milyon farklı DNA dizisine, 100 nt veya daha uzun olan mikrodiziler verir. Bu çok büyük sıra alanı ile, mikrodiziler özellikle RNA durumunda ilgili nükleik asit·ligand etkileşimleri, mekanizmaları keşfetmek için ideal platformlar vardır. Yakın zamanda situ fotolitografide uyumlu ve daha sonra RNA oligonükleotidleri, homopolimerleri ve karışık baz dizilerini yetiştirmek için kullanılan yeni bir RNA fosforamidit setinin hazırlanması hakkında rapor verdik. Burada, rna mikrodizi üretim sürecini ayrıntılı olarak göstermek, deneysel tasarım, enstrümantal kurulum, dizi sentezi, deprotection ve son hibridizasyon tahlil bir örnek olarak dört temelleri içeren bir şablon 25mer dizisi kullanarak. Buna paralel olarak, melezleşmeye dayalı deneylerin ötesine geçiyoruz ve mikrodizi fotolitografisini karmaşık nükleik asit kütüphanelerine ucuz bir geçit olarak sömürüyoruz. Bunu yapmak için, yüksek yoğunluklu DNA mikrodizileri dna'nın uygun bir şekilde yarık ve sentez ve deprotection sonra geri alınmasını sağlayan bir baz duyarlı monomer üzerinde imal edilir. Üretim protokolü, sentetik hata sayısını sınırlamak için optimize edilmiştir ve bu etkiye göre, aksi takdirde sentez yüzeyleri üzerine geri yansıtabilir UV fonları absorbe β-karoten çözeltisi bir tabaka tanıtıldı. Tasarımdan dekolte ye ve nicelemeye kadar kütüphane hazırlama sürecinin tamamını adım adım anlatıyoruz.
Introduction
DNA mikrodizilerinin pratik kullanımı geleneksel olarak iki hücre popülasyonu arasındaki gen ekspresyonu düzeylerindeki değişimlerin incelenmesinde, tamamlayıcı iplikçikler ve floresan bir algılamayöntemiolarak 1. Bazen, DNA mikrodizileri, proteinler gibi nükleik olmayan asit ligandları ile bağlayıcı olaylara, bağlayıcı manzara 2,3kapsamlı bir bakış sunan sistematik dizi permütasyon bir strateji ile girişim, 4,5. Bu yaklaşım, mikrodizileri sadece hibridizasyon yüzeylerinden geniş sıra kapsamına sahip platformlara dönüştürür ve bu da RNA yapısı nın ve fonksiyonunun daha zengin ve daha karmaşık dünyasının incelenmesinde bir değer olacaktır. Son derece verimli fosforamidit kaplin reaksiyonu tarafından desteklenen6, in situ sentezlenmiş DNA dizileri şimdi de DNA ucuz bir kaynak olarak kabul edilebilir7, hangi özellikle giderek artan talep dikkate alınarak ilgili hale gelmektedir gen montajı için nükleik asit malzemesi8,9, DNA tabanlı nanoyapılar10, bilgi depolama veya sıralama11,12. Aynı şekilde, sıralama teknolojileri RNA oligonükleotid13 çok karmaşık karışımları verim yöntemleringeliştirilmesinden yararlanmak olasıdır. Bu bağlamda, oligonükleotidlerin yerinde ve yüksek yoğunlukta sentezlemesine olanak tanıyan dizi üretim protokolleri, hızla genişleyen nükleik asit biyoteknolojisi alanının ihtiyaçlarını karşılamak için ideal bir şekilde yerleştirilmiştir. Ancak, biyoteknoloji gibi çeşitli bir alan ile, her uygulamanın amacı mikrodizi dna ya yüksek iş çıkışlı ya da sentetik hataları çok düşük miktarda14,15, ya da her ikisi ile üretilmesi gerektirebilir, gerektiren bir DNA mikrodizilerinin sentez protokollerine daha yakından bakın, tarihsel olarak, öncelikle melezleştirme tahlilleri için optimize edilmiştir. Bu arada, RNA mikrodizilerinin yerinde sentezinin zorlu bir çaba olduğu tespit edilmiştir, 2'-OH fonksiyonu için koruma grubu ile ilişkili zorluk çoğu ile, genellikle standart katı faz sentezinde silil moiety ile kaldırılır flor bazlı reaktifler, cam veya silikon yüzeylerile uyumsuz kimyasallar. Bu sorunlar ve DNA ve RNA mikrodizi sentezinde zorluklar son zamanlarda çalışma büyük bir vücut konusu olmuştur, fotolitografi yaklaşımı ile özellikle16.
Fotolitotografi kaplin önce oligonükleotidlerin engelini kaldırmak için UV ışığı kullanır ve uv maruziyeti bir desen oluşturmak için maskeler gerektirir, bu nedenle mekansal organize ve oligonükleotidlerin büyümesini kontrol. Fiziksel maskeler olan eğim seçici microarray substrat üzerine UV ışığı nı yansıtan bilgisayar kontrollü mikroaynalar tarafından değiştirildi17,18,19. UV kaynağı olarak, yüksek güç LED kaynak20365 nm ışık kullanın. Mevcut fotolitografik kurulumlar 1024 × 768 aynalar içeren mikroayna dizileri ile donatılmıştır, 780.000 'den fazla bireysel adreslenebilir noktalar ("özellikler") sadece 1.4 cm2küçük bir alanda karşılık gelen , veya 1080p dizileri ile 1920 × 1080, veya >2 milyon ayna. Bu nedenle, aygıttaki aynaların her biri, ilgili özellikte yetiştirilen dizi üzerinde doğrudan denetime sahiptir. UV ışığı dışında fotolitografi katı fazlı sentez tekniği gibi işlev görür ve çevrim bazlı fosforamidit kimyasını benimser. Sadece RNA sentezinin başarılı olması için tamamen farklı bir koruma stratejisi gerektirir. Hydrazine-labile koruma grupları 21'i taşıyan ışığa duyarlı RNAfosforamiditleri serisi geliştirdik. Bu monomerler, Yüzeyin bütünlüğünü etkilemeyen hafif koşullar altında RNA'nın korunmasını sağlar. İlk deprotection adım siyanotil fosfodiester koruma grupları kaldırmak için triethylamin kullanır, hidrazin 2'-OH ve ekzosiklik amin fonksiyonları bu kaldırmak için ikinci, ayrı bir adımkullanılır iken. Bunu yaparken, RNA oligonükleotidler ~ 30-nt uzunluğunda ve herhangi bir dizi şimdi mikrodiziler 22,23üzerinde yerinde sentezlenebilir . Buna paralel olarak, son zamanlarda DNA ve RNA fotolitografisinde üretim, kalite ve hız sorularını da ele almaya başladık. Tüm DNA ve RNA amiditleri için kaplin verimliliklerinin >%99'unu ölçtük (Şekil 1) ve oligonükleotid uzama döngüsündeki her bir adımı oksidasyon süresinden aktivatör seçimine ve optimal UV maruziyetine kadar inceledik24 , 25- Biz birkaç saat süren bir süreç içine 100mers yüz binlerce sentezi dönüştürerek, sadece saniyeler içinde kaldırılabilir yeni ışığa duyarlı 5 ' koruma grupları getirdik26. Biz de aynı anda iki substrat açığa çıkararak dizi imalatı nın üretim iki katına çıkardık27. Son olarak, biz cleave, toplamak ve DNA ve RNA oligonükleotidler, kütüphane hazırlık merkezi dir analiz etmek için uygun bir yol olarak bir baz duyarlı süksinil grubu içeren bir dT fosforamidit tanıttı28.
ÖZELLIKLE nükleik asit kimyagerleri için DNA ve RNA katı faz sentezinin nispeten dünyevi yönüne rağmen, mikrodizi fotolitografisi karmaşık bir kurulum, sürecin dikkatli kontrolü ve denetimi gerektiren önemsiz olmayan bir yükseltme olmaya devam eder ve oligonükleotidin niteliğine ve uygulama türüne bağlı olarak sentetik sonrası kullanım için ayrı talimatlar. Bu makalede, dna ve RNA mikrodizilerinin fotolitografi ile, deneysel tasarımdan veri analizine kadar tüm adım adım sentezinin ayrıntılı bir sunumunun sunulmasını, aletlerin hazırlanmasına ve Sarf. Daha sonra mikrodizi imalatının amacına karşılık gelen sentetik koruma sonrası koruma yöntemlerini (yani hibridizasyon veya nükleik asit kitaplıklarının geri kazanımı) açıklıyoruz.
Protocol
1. Microarray tasarım
- Dizileri bir metin düzenleyicisinde sentezlenecek, 5'→3', her sıra için bir satır olarak yazın. Kalite kontrol 25mer için "GTCATCATCATCATGAACCACCACCGGTC" dizisini kullanın. DNA nükleotitleri için A, C, G ve T harflerini ve RNA nükleotitleri için 5, 6, 7 ve 8 sayılarını kullanın.
- Kitaplık hazırlığı durumunda, her dizinin 3' ucuna fazladan bir sayı (örneğin, 9) ekleyin. Bu, temelduyarlı monomerin kaplinine karşılık gelecektir.
- Her sekans bir virgül le takip edilmelidir. Virgülden sonra her diziye bir ad atayın ve her şeridin [sıralı,#sequence_name] biçimini (parantez olmadan) izlediğini doğrulayın. Dizilistesini .txt dosyası olarak kaydedin.
- MatLab'ı çalıştırın ve chipdesign.mprogramını yükleyin. Programı çalıştırın.
- Özellik Paneli penceresinde, microarray EntireChip düzen dosyasını yükleyin. Amaç, tüm diziyi dört aynı konumda sentezlemekse, MilliChip düzen dosyasını yükleyin.
- Özellik Paneli penceresinde, Chip Belirtimialtında, Kapsayıcı sonra Sentez Alanı seçin. Desenaltında, sıraları × çoğaltma sayısı sayma, adreslenebilir özelliklerin doğru miktarda verir desen seçin. Kalite kontrol 25mer için 25:36 deseni seçin.
- Select Container'ınaltında, Fiducial'ıseçin. Fiducial özellikler genellikle sentez alanının köşelerinde sentezlenir ve hibridizasyon verilerini ayıklamak için kullanılır. Fiducial seçili ile, fiducial özellikler üzerinde sentezlenecek ve pozitif bir kontrol olarak hareket edilebilen bir dizi (5'→3') yazın. 25mer deneyi için aynı DNA dizisini kullanın.
- Sequencealtında, tüm yazılı sıraları içeren metin dosyasını yükleyin. Randomize'nin seçildiğinden emin olun. Proje Başlığı'ndaki denemeye bir başlık verin ve LinkerSequence'de TTTTT (T5 bağlantıcısına karşılık gelen) yazın.
- Oluşturtuşuna basın, ardından MaskGen_delta_rc1/Designs klasörü altında dizi tasarım dosyalarını ve maskelerini (Şekil2)bulun. Bir ekran komutdosyası, akış sırası ve tasarım dosyasıiçerdiğinden emin olun.
- Kitaplık hazırlama için ekran komut dosyasını açın. Ekran komut dosyasının altına, komut dosyasının ilk satırını tam olarak kopyalayan fazladan bir satır ekleyin (örneğin, First_Mask.bmp 150'yigörüntüleyin). Bu, tüm oligonükleotidlerin 5' ucundaki terminal foto-koruma grubunu ortadan kaldıracaktır.
- İş yaratıcısı AutoJob programını başlatın, Yük Şablonu'nutıklatarak bir şablon yükleyin, ardından MatLab tarafından oluşturulan ekran komut dosyası dosyasını yüklemek için Ekran Komut Dosyası'na tıklayın. Oluşturtuşuna basın. Bu adım, mikroaynalar ve DNA sentezleyicisi ile bilgisayarın iletişimini kontrol edecek bir iş dosyası olarak adlandırılan bir dizi yönerge oluşturur.
2. Slayt hazırlama ve işlevselleştirme
- Sentez hücresi üzerindeki giriş ve çıkış borularının konumuna karşılık gelen iki pozisyonda bir slayt delin. Hassas ve güvenilir bir şekilde delmek için CNC yönlendiricide 0,9 mm elmas biti kullanın. Delinmiş slaytları ultra saf suyla durulayın ve bir kaydırak rafına yerleştirin.
- 35 °C'de 30 dakika boyunca amonya bazlı özel amaçlı temizleyicinin %5'ini içeren bir su banyosundaki slaytları sonicating ederek yüzeyleri temizleyin. Slaytı çift distile H2O ile durulayın ve temiz, kuru bir rafa aktarın.
- Bir slayt rafında delinmiş ve delinmemiş mikroskop slaytları düzenleyin. Büyük bir silindirde, 475 mL etanol (EtOH) ile 25 mL ddH2O, 10 g silanlaştırıcıreaktif (N -(3-triethoxysilylyl)-4-hidroksibütirramide) ve 1 mL asetik asit karıştırılarak işlevselleştirme çözeltisini hazırlayın. Homojen sonra uygun, kapalı bir kapta transfer kadar iyice karıştırın.
- Yüklü rafı konteynerin içine yerleştirin, kapağı kapatın ve kabın oda sıcaklığında 4 saat boyunca orbital shaker üzerinde hafifçe sallanmasına izin verin.
- 4 saat sonra işlevselleştirme çözeltisini atın ve 475 mL EtOH, 25 mL ddH2O ve 1 mL asetik asitten oluşan 500 mL yıkama çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yavaşça çalkalayın, ardından 500 mL taze yıkama çözeltisi ile değiştirin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika sonra, çözeltiyi atın, bir argon akışı ile slaytları kurutun ve önceden ısıtılmış vakumlu fırında 120 °C'de pişirin. 2 saat sonra, fırın ve vakum pompası kapatın ama bir gecede azaltılmış basınç altında slaytlar bırakın. Daha sonra fırını atmosfer basıncına geri getirin ve slaytları daha fazla kullanılana kadar kurutucuda saklayın.
3. Sentez reaktiflerinin ve reaktanlarının hazırlanması
- Fosforamidit tozlarını (Şekil1) depolama sıcaklığından (-25 veya -45 °C) bir kurutucuda oda sıcaklığına getirin.
- Fosforamiditler oda sıcaklığına ulaştığında, standart DNA ve RNA fosforamiditleri için 30 mM konsantrasyona ve baza duyarlı dT monomer için 50 mM konsantrasyona ulaşmak için tozu ultra kuru asetonitrril (<30 ppm H2O) hacmi ile çözündürün . kütüphane hazırlama). Nem herhangi bir iz tuzak için küçük bir moleküler elek çantası ekleyin.
- 11 g imidazoli kuru DMSO'nun 1 L'sine eriterek DMSO'da %1 (w/w) imidazol çözeltisi hazırlayın. Tamamen eriyene kadar iyice çalkalayın. Çözeltiyi DNA sentezleyicisinin yardımcı noktasına takın. Bu 5'-photoprotecting grubunun tam kaldırılması için gerekli pozlama çözücü olacaktır.
- Kütüphanelerin sentezi için, 10 mL diklorotan içinde 100 mg β-karoten eriterek diklorometan %1 (w/v) β-karoten çözeltisi hazırlayın. Bir kehribar cam şişede iyice çalkalayın sonra alüminyum folyo sarın.
4. Mikrodizi sentezinin hazırlanması ve izlenmesi.
- Mikrodizi üretim odasında sıcaklık ve nemi kaydedin ve DNA sentezleyicisinin yeterli helyum basıncı altında olduğundan emin olun.
- UV LED'i ve soğutma fanını açın. Gelen UV ışığının odak düzlemine bir UV yoğunluk ölçer takın ve açın (Şekil 3A).
- Bilgisayarda, iş dosyası/ mikroayna/sentez dosyaları denetleyici yazılımı (WiCellolarak adlandırılır) başlatın. Daha sonra mikroayna aygıtını açın ve DMD'ye sağ tıklayarak tamamen beyaz bir maske dosyasını yükleyin, ardından Load Image'ı seçin.
- UVS simgesine sağ tıklayın ve UV Shutter Open'ı seçin. Yoğunluk ölçerdeki güç değerini (mW/cm2)okuyun ve 60 s'yi sayın. 60'lardan sonra güç değerini yeniden okuyun ve başlangıç ve bitiş değerlerini not edin. UV Deklanşörünü seçerek deklanşörü kapatın ve yoğunluk ölçeri kapatın. mW/cm 2'deki ortalamaUV yoğunluğu değerini hesaplayın.
- 5'-NPPOC fotodekoruma (DNA ve RNA mikrodizileri) için 6 J/cm2 ve 5'-BzNPPOC fotodekoruma (DNA kütüphaneleri) için 3 J/cm2 parlak bir enerjiye ulaşmak için gereken pozlama süresini hesaplayın.
- DNA synthesizer Workstation yazılımında, MatLab tarafından oluşturulan akış dizisinin içeriğini kopyalayıp yapıştırarak Sıra Düzenleyicisi'nde bir dizi dosyası oluşturun. İlk bağlantıya geçmeden önce yüzeylerin yüzeyini yıkamak için 3' sonunda (varsayılan döngü harfi: "s") fazladan iki yıkama adımı ekleyin. Sıra dosyasını kaydedin ve dışa aktarın.
- İş İstasyonu yazılımının Protokol Düzenleyicisi'nde, sıra dosyasında bulunan harflerin ve sayıların her birinin adını taşıyan özel bir döngü içeren bir protokol oluşturun (örneğin, bir sıra dosyası yalnızca A, C, G ve T harflerini içeriyorsa, protokol dosyası A, C, G ve T olarak adlandırılan dört döngü içerir).
- DNA fosforamiditleri (A, C, G ve T döngüleri) için kaplin süresini 15 s'ye, rU fosforamidit için 120 s'ye (döngü 8) ve rA, rC ve rG fosforamiditleri için 300 s'ye (5, 6 ve 7 döngüleri) ayarlayın. Kitaplık hazırlama için, taban duyarlı, bölünmez dT monomer 2 × 120 s (Tablo 1 ve Tablo 2)bağlantı ayarlayın.
- Her döngüdeki iki Olay 2 Out iletişim olayı arasındaki bekleme süresinin, gerekli radyant enerjiye ulaşmak için hesaplanan UV maruziyet süresine karşılık geldiğinden emin olun. Sıra dosyasına gelince, protokol dosyasını kaydedin ve dışa aktarın.
- WiCell yazılımında, iş, sıra ve protokol dosyalarını kendi alt pencerelerine yükleyin ve sıra ve protokol dosyalarını DNA sentezleyicisine göndermek için Gönder'i tıklatın.
- Sıra dosyasında, her fosforamidit için bağlantı sayısını sayın.
- Her sentezi gerçekleştirmek için gerekli fosforamidit çözeltisinin gerekli hacmini (μL olarak) ölçmek için, bağlantı sayısını 60 ile çarpın. DNA sentezleyicisi üzerindeki çizginin güvenliği ve astarlanması için her ses hacmine 250°L ekleyin. Yalnızca tek bir bağlantı gerektiren fosforamiditler için 250 μL'lik bir taban hacmi kullanın.
- Çözeltiyi protokol döngülerinde bağlantı noktası harfine/sayısına karşılık gelen DNA sentezleyicisindeki şişelere hızlıca aktarın.
- Hatları reaktifle doldurmak için her biri 10 asal darbe ile fosforamidit çözeltileri ile bağlantı noktalarını asal. Reaksiyon hücresini takmadan önce asetonitril yıkama hattını asal olarak takın.
- Sentez hücresini monte etmek için, hücrenin kuvars bloğuna önce kalın (250 μm) perfloroelastomer (FFKM) conta yerleştirin. İlk contanın üzerine delinmiş, işlevsel leştirilmiş bir mikroskop kaydırağı yerleştirin ve slaytlar üzerindeki deliklerin sentez hücresinin giriş ve çıkış borusuyla bağlantı kurduğunu doğrulayın.
- İki deliği çevreleyen ikinci, ince (50 m) politetrafloroetilen (PTFE) contasını delinmiş kaydırağın üzerine yerleştirin. Son olarak, ikinci contanın üzerine ikinci, işlevsel ama delinmemiş bir slayt yerleştirin (Şekil 3B). Monte edilmiş çift substrat hücresinin üzerine 4 vidalı metal bir çerçeve yerleştirin ve tork tornavida kullanarak vidayı aynı bağlama kuvvetine (0,45 Nm) sıkın.
- Giriş ve çıkış tüplerini DNA sentezleyicisine takın. Asetonitril yıkama hattını asal olarak asallayın ve yüzeylerden uygun asetonitril (ACN) akışını doğrulayın. Bu aşamada ACN sızıntısı görülebiliyorsa hücreyi sökün ve yeniden monte edin. 7 döngü ACN astarı geçtikten sonra atık hattındaki ACN hacmini ölçün. Bu hacim 2 mL olmalıdır.
- Sentez hücresini gelen UV ışığının odak düzlemine takın. Kütüphane hazırlığı nda hücrenin arkasına fazladan giriş ve çıkış hattı takın ve arka hazneyi β-karoten çözeltisi ile doldurun (2 mL çözelti yeterlidir). Sızıntı olmadığından emin olun (Şekil 3C).
- Önce WiCell yazılımında Çalıştır'a tıklayarak senteze başlayın. İş dosyasındaki ilk BEKLE komutunda DNA sentezleyicisinde Başlat'a basın.
- Sentez sırasında, maske dosyalarının görüntülenmesinin UV ışınlarına maruz kalma ve deklanşörün açılmasıyla çakıştığını düzenli olarak doğrulayın.
- Düzenli mikrodizilerin sentezinden sonra, hücreyi sentezleyiciden ayırın, hücreyi sökün ve sentez numarasını cam slaytlara yapıştırmak için elmas bir kalem kullanın. Her slaydın sentezedilmeyen yüzündeki sayıyı etch. Slaytları 50 mL'lik santrifüj tüplere aktarın ve daha fazla kullanıma kadar kurutulmuş bir alanda saklayın.
- Kütüphane mikrodizilerinin sentezinden sonra, önce β-karoten çözeltisini hazneden boşaltın, sonra 2 × 5 mL CH2Cl2akarak yıkayın, sonra süzün. Adım 4.21'e göre sökmeye devam edin. Sentezlenen dizi çıplak gözle görülebilir (Şekil 4).
5. DNA mikrodizi deprotection
- Boyama cam kavanozu 20 mL EtOH ve 20 mL etilenedamin (EDA) ile doldurun. DNA'ya özel mikro diziliyi kavanoza dikey olarak yerleştirin, kapağı kapatın ve slaytları oda sıcaklığında 2 saat boyunca korumak için bırakın.
DİkKAT: EDA akut toksik, aşındırıcı ve yanıcı bir sıvıdır. İyi havalandırılan bir duman kaputunda eldivenlerle çalışın. - 2 saat sonra, cımbız kullanarak slaytları alın ve çift distile H2O ile iyice durulayın.
- Birkaç saniye için bir mikrodizi santrifüj slaytlar kuru sonra bir kurutucu saklayın.
6. RNA mikrodizi deprotection
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpte, 2:3 trietilamin/ACN (sırasıyla 20 mL ve 30 mL) kuru bir çözelti hazırlayın. Santrifüj tüpü içine bir RNA mikrodizi slayt aktarın, kapağı kapatın sonra plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Yavaşça oda sıcaklığında 1saat ve 30 dakika için bir orbital shaker üzerinde santrifüj tüp sallayın.
- 1h ve 30 dk sonra, slayt çıkarın, 2 × 20 mL kuru ACN ile yıkayın sonra birkaç saniye için bir mikrodizi santrifüj kuru.
DİkKAT: Trietitamin akut toksik, aşındırıcı ve yanıcı bir sıvıdır. Asetonitril toksik ve yanıcıdır. İyi havalandırılan bir duman kaputunda eldivenlerle çalışın.
NOT: İlk korumadan arındırıcı adım tamamlandı. - 0,5 M hidrazin hidrat çözeltisi hazırlayın 3:2 piridin/asetik asit. İlk olarak, mezun silindirde 20 mL asetik asit ve 30 mL piridin karıştırın. 1.21 mL hidrazin hidrat eklemeden önce çözeltinin soğumasını bekleyin. Elde edilen çözeltinin yaklaşık 40 mL'sini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
DİkKAT: Hidrazin hidrat akut toksik ve aşındırıcı bir sıvıdır. Piridin son derece yanıcı ve akut toksiktir. Asetik asit yanıcı ve aşındırıcıdır. İyi havalandırılan bir duman kaputunda eldivenlerle çalışın. - İlk korumasız adımdan sonra RNA kaydıraktan hidrat çözeltisine aktarın, kapağı kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın. Yavaşça oda sıcaklığında 2 saat için bir orbital shaker üzerinde tüp sallayın. 2 saat sonra, slayt çıkarın, 2 × 20 mL kuru ACN ile yıkayın ve birkaç saniye mikrodizi santrifüj kuru.
NOT: İkinci korumadan arındırıcı adım tamamlandı. - Eğer RNA mikrodizi de DNA nükleotitleri içeriyorsa, üçüncü bir korumasız adım ile devam edin. 50 mL'lik bir santrifüj tüpte 20 mL EDA ile 20 mL EtOH karıştırın. DNA/RNA mikrodizisini 1:1 EDA/EtOH çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- 5 dakika sonra, slayt çıkarın, steril su 2 × 20 mL ile yıkayın sonra bir mikrodizi santrifüj kuru ve bir kurutucu saklayın.
7. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik ile hibridizasyon
- Asetilatlı büyükbaş hayvan serum albumini (10 mg/mL) ve Cy3 etiketli tamamlayıcı iplikçik (100 nM) ve oda sıcaklığına kadar ısınır.
- 1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpte, karışımı 150 μL 2x MES tampon (200 mM 2-(N-morolino)etanesülfonik asit; 1.8 M NaCl; 40 mM EDTA; 0.02% Tween-20) ile 26.7 μL Cy3 etiketli DNA, 13.4 μL asetil gevezelik BSA ve 110 μL steril H2O Mix. Girdap. Her iki slayt da melezleme için kullanılacaksa, ses düzeyini iki katına çıkar.
- Çift yönlü T m'nin altındaki bir sıcaklığa kadar bir melezleme fırını önceden ısıtın, ancak tam eşlemeli ve eşleşmeyen sekanslar arasında iyi bir ayrım sağlayacak kadar yüksek. Kalite kontrol 25mer için sıcaklığı 42 °C(Tm/ 59 °C) olarak ayarlayın.
- Yukarıda hazırlanan hibridizasyon çözeltisinde her slayt ve pipet üzerine kendi kendine yapışkan 300 μL hibridizasyon odasını dikkatlice yerleştirin. Yapışkan nokta ile odanın delikleri kapak ve alüminyum folyo tüm slayt sarın.
- Mikrodizi kaydırağı hibridizasyon fırınına yerleştirin, kapağını kapatın ve seçilen hibridizasyon sıcaklığında 2 saat boyunca yavaşça döndürülsün.
- 2 saat sonra, slayt ayırmak, alüminyum folyo kaldırmak ve dikkatle hibridizasyon odası yırtmak. Slaytları 30 mL'lik Sıkı Olmayan Yıkama Tamponu (NSWB; 0,9 M NaCl, 0,06 M fosfat, 6 mM EDTA, %0,01 Tween20, pH 7,4) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca şiddetle çalkalayın.
- Kaydırağı 30 mL'lik Sıkı Yıkama Tamponu (SWB; 100 mM MES, 0,1 M NaCl, %0,01 Ara 20) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve 1 dakika boyunca şiddetle sallayın.
- Son olarak, slaytı 30 mL Final Wash Tampon (FWB; 0,1x sodyum salin sitrat) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve birkaç saniye sallayın. Bir mikrodizi santrifüj slayt kuru.
- Kuru mikrodizi, sentez alanı aşağı bakacak şekilde, mikrodizi tarayıcı slayt tutucu yerleştirin. Cy3 etiketli dubleksler için 532 nm uyarma dalga boyu, 575 nm filtre ve 350 fotoçarpan ile 5 μm çözünürlükte tarayabilirsiniz. Yüksek çözünürlüklü tcan'ı .tif görüntü dosyası olarak kaydedin (Şekil 5A).
8. Veri ayıklama ve analizi
- Veri ayıklamadan önce, kaydedilen dizi tonu'nu görüntü düzenleyicisinde döndürün, böylece tamanın sol üst köşesindeki en uzun güvenilir özellik zincirini oluşturun. Döndürülen görüntüyü kaydedin.
- ÇevikScanbaşlatın, sonra Dosya | Dizi tonu'nu açın ve yükleyin. Daha sonra, Tasarım dosyası alt bölümünde Gözat'ı tıklatarak, 'yi yükleyin. mikrodizi deneyinin tasarımı sırasında otomatik olarak oluşturulan ndf tasarım dosyası. Sonra Aç'ı tıklatın.
- Görünümde, Otomatik Karşıtlık/Parlaklık'ıtıklatın. Sancak'ın üzerinde El ile hizala simgesine tıklayın. Tarayın dört köşesine dört kare şeklinde işaretçiler yerleştirin ve şimdi yeşil simgesini yeniden tıklatın. Analiz, Raporlar sonra Sonda Raporu'nu tıklatarak hibritleştirme verilerini ayıklayın.
- Açın. bir elektronik tablo düzenleyicisinde sonda raporu dosyası. B ve I sütunlarını tutun ve çıkarılan verilerden ortalama değerleri ve standart sapmayı hesaplamaya devam etmeden önce geri kalanını atın (Şekil5B).
9. Kütüphane deprotection, dekolte ve kurtarma
- DNA kitaplıklarını korumak ve ayırmak için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpte 1:1 kuru EDA/toluen çözeltisi hazırlayın. Dekolte çözeltisi içine slayt batırın, slayt kapatın ve plastik sızdırmazlık filmi ile sarın, sonra yavaşça oda sıcaklığında 2 saat için bir orbital shaker döndürün.
- 2 saat sonra, slayt çıkarın ve 2 × 20 mL titizlikle kuru ACN ile yıkayın. Kaydırağı çıkarın ve havanın kurumasını bekleyin.
- Bir pipetle, 100 μL steril H2O'yu artık fark edilebilir sentez alanının üzerine uygulayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarmadan önce çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın. İşlemi tekrarlayın ve aynı tüpe dönüşen mikrodiziyi birleştirin (Şekil6).
- 2 × 100 μL talaş kuruluğa elüat buharlaşın ve 10 μL nükleaz içermeyen H2O. UV-Vis spektrofotometreüzerindeki emiciliği ölçün.
- C18 resin ile donatılmış 10 μL pipet ucu ndaki DNA kitaplığını tuzdan arındırın. İlk olarak, 0.1 M triethylamonnium asetat (TEAA) tamponlanmış çözeltiiçine çip eluate dönüştürün.
- H2O/ACN 1:1'in 3 x 10 μL'si ile reçineyi ıslayın ve 0,1 M TEAA tamponunun 3 x 10 μL'si ile yıkayarak reçineyi dengeleyin. Çipi reçineden 10 kat yukarı ve aşağı emerek DNA'yı bağlayın. Reçineyi 3 x 10 μL 0,1 M TEAA tamponu, 3 x 10 μL H2O ile yıkayın.
- Rekarni 10 μL H2O/ACN 1:1 ile yıkayarak tuzsuz DNA'yı uçtan uzaklaştırın. Tuzsuz çözeltiyi kurutun ve 10 μL steril H2O'ya yeniden çözün. Uv-Vis spektrofotometrede emiciliği ölçün (Şekil7). Kuruluk için kütüphane buharlaştırın ve daha fazla kullanım akadar -20 °C'de saklayın.
Representative Results
DNA ve RNA mikrodizi hibridizasyonu
Şekil 5, 25mer dizisinin (5'-GTCATCATCATGAACCACCGGTC-3' DNA formunda) DNA ve RNA versiyonlarını içeren bir mikrodizi üzerinde yapılan melezleme testinin sonuçlarını göstermektedir. Şekil 5A'daki tazyik, Cy3 floresanının uyarma/emisyon spektrumuna karşılık gelen yeşil ölçekte görünür ve floresan yoğunluğu 0 ile 65536 arasında rasgele birimlerde kaydedilir. Dizi tasarımı, protokol bölümünde açıklanan 25:36 özellik düzenini izledi. Tama, dizinin doğru yönlendirmesi sonrasında gösterilir ve sol üst köşe en uzun fiducial özellikler zinciriyle doldurulur. Burada, fiducial özellikler 25mer'in DNA versiyonunu içerir ve ilke olarak, tbmfik hizalama ve veri çıkarma işlemi gerçekleştirmek için her zaman pozitif floresan sinyali vermelidir. Melezleştirilmiş mikrodizi düzgün parlak görünmelidir, sentez alanının kenarları ancak genellikle merkezi daha parlak olan (%50'ye kadar parlak). Alan boyunca rastgele dağıtılan büyük miktarda dizi çoğaltma, mekansal eserlerin etkisini azaltır. Burada, her dizi (DNA ve RNA) 2.000 rasgele yerlerde sentezlendi. Genellikle düşük floresan gürültüsü (arka plan), <50 a.u., hibridizasyon tahlillerinde 200:1 ile 800:1 arasında bir sinyal/gürültü oranına yol açar. Veri ayıklamadan sonra floresan yoğunlukları ortalama olarak alınır ve ±SD çizilir.
Deneyler arasında mutlak floresan değerlerinde önemli değişkenlik vardır. Burada, aynı üretim parametreleri ve aynı post-sentetik işleme kullanarak üç bağımsız syntezs için sonuçları göstermektedir. 25mer DNA, tamamlayıcı Cy3 etiketli DNA iplikçik hibrid, floresan sinyalleri 20.000 ila 30.000 arasında değişen verecek, çok nadiren yukarıda veya altında. 25mer RNA, aynı Cy3 etiketli DNA komplemanı için hibridize edildiğinde, 15.000 ile 20.000 arasında değişen ilgili özellikleri floresan yoğunlukları verecektir. Ancak, RNA/DNA duplekslerinin floresan yoğunluğu zaman zaman 8.000'in altına düşer, buna karşılık gelen DNA/DNA dubleksleri 20.000-30.000 aralığında floresan olacaktır. Bu gibi durumlarda, RNA sonuçları sub-optimal olarak kabul edilebilir. Bir sentez veya hibridizasyon yetmezliği, DNA veya RNA için, floresan bariz eksikliği tarama sırasında hemen fark edilecektir. RNA sentezinin başarısız olması veya kısmen başarılı olması için birden fazla fırsat vardır ve bunlar tartışma bölümünde özetlenecektir.
Kütüphane deprotection, dekolte ve kurtarma
Kütüphanenin karmaşıklığına ve yoğunluğuna bağlı olarak, sentezlenen dizinin şekli ve anahattı büyütme den önce ancak uygunışıklandırma altında (Şekil 4), DNA hala korumalı formda görülebilir. EDA/toluen ile korumadan sonra ve sulu kütüphaneyi toplamak için su ilavesinden önce, artık korumasız olan oligonükleotidleri içeren sentez alanı, cam kaydıraktan geri kalan ların ortaya çıkacağı hidrofilik bir bölge olarak öne çıkabilir. bulanık hidrofobik bir tabaka ile kaplıdır. Sentez alanının doğrudan gözlemlenmesi, oligonükleotidlerin sentezlenmesinde kullanılan toplam alana bağlıdır: sentez alanının daha fazla kullanılması yüzeydeki hidrofilik ve hidrofobik bölgeler arasında daha fazla ayrım olasılığına karşılık gelecektir. Tersine, daha az ayna kullanılarak ve daha küçük özelliklere sahip olarak sentezlenen kitaplıklar hemen gözlemlenebilir olmayabilir.
Benzer şekilde, tuzsuzlama dan sonra kurtarılan DNA miktarı sentez için kullanılan toplam alan ile doğru orantılıdır. Tüm özellikler oligonükleotid sentezi için kullanılırsa, dekolte ve geri kazanım işlemi 25 ile 30 pmol arasında DNA verilmelidir. Bu nedenle sentez alanının %10'luk bir kullanımı sadece 3 pmol civarında DNA'yı karşılayacaktır.
Şekil 1 . Mikrodizi fotolitografi ile oligonükleotid sentezinde kullanılan DNA ve RNA fosforamiditlerinin kimyasal yapıları. Standart nitrofenilpropiloksikarbonil (NPPOC) 5'-OH'da ışığa duyarlı koruma grupları hibridizasyon amacıyla düzenli DNA ve RNA mikrodizi sentezinde kullanılmaktadır. Kompleks DNA kütüphanelerinin sentezi için, 5'-OH'da daha fazla fotolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) tercih edilir, çünkü BzNPPOC nppoc'dan iki kat daha hızlı çıkarılır ve bu da toplam mikrodizi sentez süresini önemli ölçüde azaltır. Kütüphaneler için DNA oligonükleotidler de 3 'sonunda bir dekolte dT monomer kaplin gerektirir. Succinyl ester fonksiyonu taşıyan bu monomer, deprotection sırasında cleaved olacak, DNA mikroçip toplanan için izin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 . UV pozlama sırasında mikroayna cihazına gönderilen bir görüntü dosyası olarak maske örneği. Beyaz pikseller, "ON" pozisyonunda eğilecek aynalara karşılık gelir ve uv ışığını sentez hücresine yansıtır. Siyah pikseller , UV ışığının hücreden uzağa yansıtılabildiği "OFF" aynalarına karşılık gelir. Beyaz piksel bu nedenle cam yüzeylerde ilgili özellikleri bulunan oligonükleotidler üzerinde bir sonraki gelen fosforamidit kaplin için izin verecektir. Bu maske dosyasında, siyah pikseller bir sonraki bağlantı sırasında hareketsiz kalacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 . Mikrodizi fotolitografi optik ve sentez kurulum fotoğrafları. (A) UV ışınlarına maruz kalmak için optik devre. UV-LED'den gelen UV ışığı önce dikdörtgen-kesitışık borusu ile homojenize edilir, sonra mikroaynalara yansır. "KAPALI" konuma yatırılan mikroaynalar sentez hücresinden uzak UV ışığını yansıtır, ancak "AÇIK" konumundaki mikroaynalar, ilk olarak 1:1 Offner Rölesi'nden geçerek, odak düzleminde bulunan sentez hücresine ışığı yansıtacaktır. görüntüleme sistemi. (B) Sentez hücresi, bir kez monte edildikten sonra, kalın bir PTFE contası ile ayrılmış hücrenin kuvars bloğuna ilk yerleştirilen delinmiş bir slayttan oluşur (gösterilmez). İkinci, delinmemiş olmayan slayt daha sonra ince bir PTFE conta ile ayrılmış, delinmiş slayt üzerine konumlandırılır. Metal bir çerçeve (gösterilmez) montajı bir arada tutar. (C). Kütüphane hazırlama için, sentez hücresi gelen UV ışığının odak düzlemine bağlandıktan sonra, kuvars bloğu ile delinmiş kaydırak arasında yer alan oda, CH2Cl 2'deki β-karoten %1'lik bir çözelti ile doldurulur. Bunu yapmak için kuvars bloğuna ek bir giriş ve çıkış borusu eklenir ve turuncu çözelti en sağdan en sola doğru akar. Sentez için reaktiflerin ve çözücülerin akışı beyaz oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 . Sentez alanı genellikle çıplak gözlegörülebilir. Burada, sentezden hemen sonra cam yüzeyde dna kütüphanesi görülebilir ve DNA hala korumalı formdadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 . 25mer DNA ve RNA dizilerinin hibritizasyon tahlilleri mikrodiziler üzerinde yerinde sentezlenir. (A) Tüm melezlenmiş DNA ve RNA mikrodizifloresan floresan tkamı. 25mer DNA ve RNA oligonükleotidler Cy3 etiketli tamamlayıcı iplikçikleriyle melezlenmiştir. Dizi 5 μm çözünürlükte 532 nm uyarma dalga boyunda bir lazer ile tarandı. (B) DNA'nın floresan yoğunlukları (rasgele birimler:DNA ve RNA:DNA dubleksleri üç ayrı deneyde. Insitu sentezlenen RNA oligonükleotidler için açık yeşil veri suboptimal olarak kabul edilebilir, ilgili DNA dizilerinin floresan yoğunluğu ile karşılaştırıldığında. Hata çubukları SD'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 . Mikrodiziler üzerinde sentezlenen DNA kütüphaneleri için dekoruma, dekolte ve kurtarma prosedürünün şematik gösterimi. DNA dizileri baza duyarlı bir dT nükleoziti üzerinde yetiştirilir (yakınlaştırılmış alanda gösterilir). Sentezden sonra, EDA/toluen'deki DNA oligonükleotidlerinin (baz koruma grupları kırmızı küreler olarak temsil edilir) korunmasından sonra, korumasız malzemeyi elektrostatik olarak yüzeye bağlı bırakır ve daha sonra az miktarda sentezlenen alana su. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7 . Temsili emici spektrum (220 - 350 nm) bir yarık, tuzsuz DNA kütüphanesi içeren 4.000 farklı dizileri, uzunluğu 100-nt. Toplam 940 ng DNA tek bir dizi sentezinden izole edildi, dna toplam 30 pmol veya cam substrat başına 15 pmol karşılık gelen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. 5'-BzNPPOC-dA'nın bağlantı/oksidasyon/fotodekoruma için temsili döngü protokolü, ilgili fosforamiditin "A" noktasına yüklendiğini varsayarsak. Kaplin süresi (saniye cinsinden) "çift monomer" satırında gösterilir. Uv fotodekoruma süresi, burada 3 J /cm2 (BzNPPOC fotokimya) parlak bir enerjiye karşılık gelen, iki "Olay 2 Out" iletişim sinyalleri arasında geçen süre olarak hesaplanır.
Tablo 2. 5'-NPPOC-rA'nın bağlantı/oksidasyon/fotodekoruma için temsili döngü protokolü, ilgili RNA fosforamiditinin "A" noktasına yüklendiğini varsayarsak. Kaplin süresi (saniye cinsinden) "çift monomer" satırında gösterilir. Uv fotodekoruma süresi, burada 6 J /cm2 (NPPOC fotokimya) parlak bir enerjiye karşılık gelen, iki "Olay 2 Out" iletişim sinyalleri arasında geçen süre olarak hesaplanır.
Discussion
Katı fazLı DNA ve RNA sentezi her nükleik asit kimya laboratuvarının ekmek ve tereyağıdır ve fotolitografi bileşeninin eklenmesi kuşkusuz karmaşık bir işlem olmasına rağmen, UV ışığı ile aracılık edilen mikrodizi imalatı da çok güvenilir bir süreçtir. . Buna ek olarak, mikrodiziler üzerinde yerinde RNA sentezi için tek mevcut yöntemdir. Yine de, herhangi bir çok aşamalı deneysel prosedür olduğu gibi, insan hatası için yeterli oda var.
Belki de en kritik adım bir fosforamidit in kaplanmasıdır, çünkü birkaç sentetik hata içeren oligonükleotidleri karşılayabilmek için sürekli olarak yüksek verimli kimyasal reaksiyon olması gerekir. Mikrodizi sentez protokolümüzde, fosforamidit kaplini genel sentez kalitesi açısından daha da önemli dir, çünkü üretim süreci kapamayı atlar ve oligonükleotid arınmasını önler. %99'un üzerindeki kademeli bağlantı verimliliği, çok kısa bağlantı süreleri (15 s)24 için bile, ışığa duyarlı DNA ve RNA fosforamiditleri için hesaplanmıştır, ancak özellikle dG amiditleri söz konusu olduğunda, daha düşük bağlantı verimleri bazen oluşabilir. Oda sıcaklığında çözünür fosforamiditlerin stabilitesi daha önce araştırılmış ve nükleobaz doğasına bağlı olduğu gösterilmiştir, guanozin fosforamiditler sadece birkaç gün içinde geniş bozulmaeğilimli29, 30'a kadar. Ancak -25 °C'de depolandığında, 30 mM çözeltisi olarak ACN'de çözünmüş dG fosforamiditlerinin birkaç hafta stabil olduğu bulunmuştur. DG fosforamidit çözeltilerinin oda sıcaklığındaki göreceli kararsızlığı, dna sentezleyicisine birkaç gün bağlı tutulmaması gerektiği anlamına gelmez.
RNA fosforamiditler için kaplin verimi fosforamidit kalitesine (31P NMR spektroskopisi ile değerlendirilebilir) ve bağlantı süresine çok bağlıdır. rA, rG, rC ve rU için 2 dk için 5 dakikalık kaplin süreleri gerekli görünmektedir. Gerçekten de, tüm RNA fosforamiditleri için yoğuşma süresini 2 dk'ya düşürmenin hibridizasyon sinyallerini önemli ölçüde azaltdığını gördük.
DNA sentezleyicinin kendisi, reaktifler ve çözücüler, oligonükleotid sentezinin en yüksek verimelde etmek için kesinlikle mümkün olduğunca temiz olması gerekir. Ancak, çözünmez malzeme, tuzlar veya parçacıklar, zaman içinde hatlar ve dağıtım sisteminin boru, reaktifler ve reaktanların tüketiminde kademeli bir azalmaya yol açabilir birikebilir. Synthesizer'ın genel olarak temizlenmesinin düşük çıkış hacmini çözmediği durumlarda, bakliyat sayısındaki artış alternatif bir çözüm olabilir. Özellikle düşük fosforamidit tüketiminde yararlı, fosforamidit ve aktivatör karışımının pompalanmasına karşılık gelen bağlantı protokolündeki çizgi (Tablo 1 ve Tablo 2'dekibağlantı alt bölümü üçüncü satırı ) sentez kalitesi üzerinde kayda değer bir olumsuz etkisi olmadan 6 ila 9 darbeler. Ayrıca, amidit/aktivatör karışımını sentez substratına getirmek için gerekli olan aktivatör ünyatlarının sayısı (şu anda 6, bağlantı alt bölümünde dördüncü satır, bkz. Tablo 1 ve Tablo 2) DNA sentezleyicisinin kendisine ve sentez hücresinde tüp uzunluğu. Bu sayı, fosforamiditin renkli bir çözelti ile değiştirilmesi ve renkli karışımı kaplin için cam alt tabakaya itmek için gereken bakliyat sayısı sayıldıktan sonra ayarlanabilir.
Burada açıklanan yöntem, DNA ve RNA sentezinin aynı mikrodiziüzerinde aynı anda ilerlemesini sağlar. DNA ve RNA melezleri de dizi üretim protokollerinde herhangi bir değişiklik yapılmadan ve üç aşamalı korumasız protokole uyulması sürece hazırlanabilir. Ancak, rna sadece mikrodizilleri sadece iki adımlı bir deprotection gerektirir unutulmamalıdır: Et ile bir decyanoethylation ilk3N hidroksil ve hidrazin ile baz deprotection. DNA nükleobazlarının bu koşullar altında tamamen korumasız olduğu saptandı ve fenoksiasetil (Pac) gruplarının tamamen çıkarılmasını etkilemek için EDA'da ek bir adıma ihtiyaç vardır. EDA ile bu ekstra tedavi daha kısa (5 dk) DNA mikrodizilerinin standart deprotection için daha31, ama trietitamin ve hidrazin tedavileri sonra tamamlanması için sürücü yeterlidir. Buna ek olarak, EDA ile kısa bir reaksiyon süresi temel koşullara tamamen deprotected RNA oligonükleotid maruz kalma sınırlar.
Tespit veya DNA transkripsiyon32,33,34 gibi alternatif yöntemler üzerinde in situ RNA dizi sentezinin bir avantajı kullanıma kadar korunan formda sentezlenen RNA mikroçip saklamak için yeteneği, böylece kaçınarak potansiyel RNA bozulma riski. Diğer taraftan, RNA için sentetik sonrası prosedürler, sarf malzemelerinin ve reaktiflerin steril tutulduğunu ve elleçlemenin RNase içermeyen koşullar altında yapıldığını ima eder. Dikkat, biz hibridizasyon karışımı rna inhibitörü eklenmesi RNA özellikleri için güçlü hibridizasyon sinyalleri verim vermedi bulundu.
DNA kitaplıklarının tabana duyarlı bir monomer üzerindeki sentezi, yüzeydeki birkaç kontrol dizisinin sentezinden daha karmaşıktır ve bu nedenle tasarım hatalarına kesinlikle daha yatkındır. Ancak, sıralı tasarımın (yani, doğa ve dizi sayısının) doğru olduğunu varsayarsak, bu listeyi pozlama maskeleri koleksiyonuna dönüştürmek ve sıralı bir dizi bağlantı döngüsü basit bir süreç olmaya devam etmektedir. Ancak, standart mikrodizi sentezinden önemli varyasyonlar mevcuttur ve yüksek yoğunluklu bir kütüphane dizisinin başarılı bir şekilde üretilmesi için önemlidir.
İlk olarak, baza duyarlı dT monomer bağlayıcı sentezinden sonra ilk fosforamidit olarak birleştiğinde. Bu monomerin (Şekil1)kaplin veriminin nispeten düşük olduğu saptandı, yaklaşık %8528,bu nedenle ACN'deki konsantrasyonunu 30 mM'den 50 mM'ye çıkararak veya bağlantı adımı: taze monomerler veya iki ayrı ama ardışık bağlantı döngüleri kullanarak iki ardışık bağlantı reaksiyonları.
İkinci değişiklik, sentez hücresinin arka haznesine 365 nm ışığı uygun şekilde emen β-karoten çözeltisinin eklenmesidir. Bu, UV ışığının dizi alt tabakasına geri yansımasını önlediği için fotolitografi kurulumunda önemli bir değişikliktir. Gerçekten de, substratlar arasında interstisyel ortam geçtikten sonra, gelen UV ışığı delinmiş slayt üzerinden çıkar ve hücrenin kuvars bloğuna ulaşır. Fresnel denklemleri, dik olay UV ışığının ~% 4 üç aşağı hava-cam arayüzleri(2 substrat ve kuvars bloğun her iki tarafında çıkış tarafı) her yansıtacak ve geri sentez substrat üzerine tahmin, foto-korumalı oligonükleotidlerin istenmeyen maruziyetine yol açması. Kırınım ve saçılma aynı zamanda "hedef dışı" fotodekoruma ve dolayısıyla sentezhata oranını doğrudan etkileyen nükleotit eklemeye katkıda bulunur, ancak bu katkılar yansımalardan çok daha küçüktür ve esas olarak sentez yoğunluğunu azaltmak (özellikler arasında boşluklar bırakarak). Hücrenin alt odasındaki β-karoten çözeltisinin seviyesinin sadece dizi sentezinin ilk dakikalarında hafif çetrene düştüğünü ve bu nedenle izlenmesi ve yeniden ayarlanması gerektiğini bulduk.
Son olarak, üçüncü değişiklik deprotection çözümdür, toluen için EtOH yerine, hangi muhtemelen elektrostatik etkileşimler yoluyla, yüzeye bağlı aralıklı DNA kütüphanesi tutar. ACN yıkamadan sonra sentez alanına az miktarda su uygulanması, kütüphanenin rahatlıkla toplanmasını sağlar. Ancak eda ve toluen'deki su içeriği çok az sayılsa da bu işlem ancak nükleik asidi korumasız kokteylde tamamen çözünmez hale getirir. Alternatif olarak, DNA kütüphaneleri amonyağı9,10,14,35, daha sonra dna içeren sulu amonyan çözeltisi 55 ° C gecede ısıtılarak daha fazla deprotected kullanarak çip kapalı yarık olabilir. Ancak amonya kullanarak DNA kitaplıklarının geri kazanımı RNA ile uyumlu değildir. Bir baz-dekolte edilebilir substrat üzerinde RNA oligonükleotidler yukarıda açıklanan aynı EDA / toluen prosedürü kullanılarak yüzeyden eluted olabilir, ancak et3N ve hidrazin iki adım koruma stratejisi28sonra sondan bir önceki aşamada sadece .
Belirli bir temel tedaviye gerek kalmadan oligonükleotid havuzları mikrodizilerden kurtarmak için alternatif stratejiler vardır, prensipte fotolitografi ile uyumludur ve enzimlerin kullanımına dayanır. Örneğin, tek bir deoksiurasil nükleotit urasil-DNA glikozilazının (UDG) hedefi olabilir ve DNA dizisinin geri kalanından çıkarılabilir veya tek bir RNA ünitesi RNa H tip 2 enzimleri ve fosfodiester bağı 5' tarafından RNA cleaved'e kabul edilebilir. , 5' DNA bölüm23serbest .
Artık DNA, RNA ve melez DNA/RNA mikrodizilerinin sentezi için güçlü, güvenilir ve yüksek yoğunluklu bir metoduz var. Bu sadece hibridizasyon veya bağlayıcı tahliller için platformlar olarak hizmet edemez36, ama aynı zamanda karmaşık nükleik asit kütüphaneleri üretmek için hızlı ve ucuz bir yol temsil. DNA tabanlı dijital veri depolama için, mikrodizi fotolitografi "yazma" darboğaz için potansiyel bir çözüm haline gelebilir (yani, sentez ile bilgi kodlama için). DNA ve de novo gen montajında dijital kodlamadaki başarı, sentez düzeyinde hata oranına dönüşen sıralı sadakate bağlıdır. Mevcut dizi üretim protokollerimizdeki sentetik ve optik hatalar tartışılacak ve başka yerlerde raporlanacaktır. Buna paralel olarak, üretim ölçeğini ve üretim ini daha da artırmak için çalışmalar devam etmektedir.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir kar amacı gütmeyen kuruluş ile hiçbir ilişkisi olduğunu belgelemek.
Acknowledgments
Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu (FWF p23797, P27275 ve P30596 hibe) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Grant #PBBEP2_146174) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide functionalization | |||
| Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
| CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
| Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
| N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
| Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
| Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
| Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
| Microarray synthesis | |||
| 0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
| 0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
| 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
| 250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
| 2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
| 365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
| 5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
| 5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
| Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
| Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
| DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
| DNA and RNA microarray deprotection | |||
| Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
| Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
| Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
| Imidazole | Sigma | 56750 | |
| Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
| Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
| Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
| β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
| Hybridization and scanning | |||
| 20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
| 5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
| Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
| BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
| EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
| GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
| Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
| MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
| MES sodium | Sigma | M3058 | |
| NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
| SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
| Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
| Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
| Data extraction | |||
| Excel | Microsoft | For data extraction | |
| MatLab | MathWorks | Microarray design | |
| NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
| Desalting and quantification | |||
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Toluene | Merck | ||
| ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |
References
- Bumgarner, R. Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules. Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).
- Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).
- Franssen-van Hal, N. L. W., et al. Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays. Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support. Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides. Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).
- Kosuri, S., et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).
- Richmond, K. E., et al. Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis. Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).
- Schmidt, T. L., et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nature Communications. 6, (2015).
- Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).
- Erlich, Y., Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science. 355 (6328), 950-953 (2017).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Cleary, M. A., et al. Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis. Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).
- LeProust, E. M., et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).
- Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).
- Fodor, S. P. A., et al. Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science. 251 (4995), 767-773 (1991).
- Singh-Gasson, S., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).
- Pease, A. C., et al. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).
- Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).
- Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays. Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).
- Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition. Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).
- Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography. Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).
- Agbavwe, C., et al. Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays. Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).
- Sack, M., et al. Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups. Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).
- Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis. Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).
- Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression. Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).
- Lietard, J., et al. Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography. Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).
- Krotz, A. H., et al. Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).
- Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).
- McGall, G. H., et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).
- Collett, J. R., et al. Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers. Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).
- Buenrostro, J. D., et al. Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).
- Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).
- Tian, J., et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).
- Lietard, J., et al. Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).
