Summary
本稿では、その場で作製された核酸マイクロアレイの合成と応用に関する新たな展開について述べた。具体的には、DNA合成のプロトコルをRNAに拡張する方法と、マイクロアレイを用いて検索可能な核酸ライブラリーを作成する方法を示す。
Abstract
フォトリソグラフィーは、リンアミド結合反応の効率とマイクロメートルサイズのミラーから反射される紫外線の精度と密度を組み合わせたため、ガラススライド上のDNAオリゴヌクレオチドを合成するための強力な技術です。フォトリソグラフィーは、わずか数時間で数十万から数百万の異なるDNA配列、100-nt以上に対応できるマイクロアレイを生み出します。この非常に大きな配列空間を用いて、マイクロアレイは、RNAの場合に特に関連する核酸・リガンド相互作用のメカニズムを探索するための理想的なプラットフォームです。我々は最近、その場所のフォトリソグラフィーと互換性のあるRNAリンアミドイトの新しいセットの調製について報告し、その後、RNAオリゴヌクレオチド、ホモポリマー、および混合塩基配列を増成するために使用された。ここでは、実験設計から、インストゥルメンタルセットアップ、アレイ合成、保護解除、最終ハイブリダイゼーションアッセイに向けて、4つの塩基をすべて含むテンプレート25mer配列を例にしたRNAマイクロアレイ製造のプロセスを詳細に説明する。並行して、ハイブリダイゼーションベースの実験を超えて、複雑な核酸ライブラリーへの安価なゲートウェイとしてマイクロアレイフォトリソグラフィーを利用します。そのために、高密度DNAマイクロアレイはベース感受性モノマー上で製造され、合成および保護解除後にDNAを簡単に切断して回収することができます。製造プロトコルは、合成誤差の数を制限するように最適化され、その効果に、β-カロテン溶液の層は、そうでなければ合成基板に反射し得るUV光子を吸収するために導入される。設計から切断および定量化にまで、ライブラリ準備の完全なプロセスを段階的に説明します。
Introduction
DNAマイクロアレイの実用化は、従来、2つの細胞集団間の遺伝子発現レベルの変動の研究において行われており、相補的な鎖および蛍光を検出方法1として用いた。時折、DNAマイクロアレイは、タンパク質などの非核酸リガンドとの結合イベントに進出し、結合風景の包括的な概要を提供する系統的配列順列の戦略を用いて、2、3、 4,5.このアプローチは、マイクロアレイを単なるハイブリダイゼーション表面から広範なシーケンスカバレッジを持つプラットフォームに効果的に変換し、RNA構造と機能のより豊かで複雑な世界の研究のための資産となります。非常に効率的なリンアミド結合反応6に支えられ、その中で合成されたDNAアレイは、DNA7の安価な供給源と見なされるようになった。遺伝子組み立て8、9、DNAベースのナノ構造体10、情報保存またはシーケンシング11、12用核酸材料。同様に、シーケンシング技術は、RNAオリゴヌクレオチド13の非常に複雑な混合物を生み出す方法の開発から利益を得る可能性が高い。この文脈では、オリゴヌクレオチドをその場で高密度で合成することを可能にするアレイ製造プロトコルは、核酸バイオテクノロジーの急速に拡大する分野のニーズを満たすために理想的に配置される。しかし、バイオテクノロジーと同じくらい多様な分野を持つ各アプリケーションの目的は、マイクロアレイ上のDNAを高スループットで、または非常に低い量の合成誤差14、15、またはその両方で生成する必要があり、DNAマイクロアレイの合成プロトコルを詳しく見ると、歴史的に、主にハイブリダイゼーションアッセイ用に最適化されています。一方、RNAマイクロアレイのその後の合成では、2'-OH機能の保護群に関連する難しさの大部分を有する困難が見られ、通常は標準的な固相合成においてシリル部分を除去する。フッ素系試薬、ガラスやシリコン表面と互換性のない化学物質。DNAおよびRNAマイクロアレイ合成におけるこれらの問題および課題は、最近、特にフォトリソグラフィーアプローチ16において、大きな研究の対象となっている。
フォトリソグラフィーは、結合前にUV光を使用してオリゴヌクレオチドのブロックを解除し、紫外線暴露のパターンを構築するためにマスクを必要とし、それによってオリゴヌクレオチドの成長を空間的に組織化し、制御する必要があります。物理マスクは、チルトが選択的にマイクロアレイ基板17、18、19に紫外線を反射するコンピュータ制御マイクロミラーに置き換えられました。UV源として、高出力LED源20から365nmの光を使用しています。現在のフォトリソグラフィのセットアップには、1024 × 768 ミラーを含むマイクロミラー アレイが装備されており、わずか 1.4 cm2の小さな領域で 780,000 個を超える個別にアドレス指定可能なスポット ("機能") に対応し、または 19200 の配列を持つ 1080p または>200万ミラー。したがって、デバイス内の各ミラーは、対応する機能で拡大されたシーケンスを直接制御できます。紫外線を除き、フォトリソグラフィーは固相合成技術のような機能を持ち、サイクルベースのリンアミドアミド化学を採用しています。RNA合成を成功させるためには、まったく異なる保護戦略が必要です。我々は、ヒドラジン-不他保護基21を有する光感受性RNAリンアミダントの新シリーズを開発した。これらのモノマーは、表面の完全性に影響を与えない穏やかな条件下でRNAを保護解除することを可能にします。最初の脱保護ステップは、チアノエチルホスホジエステル保護基を除去するためにトリエチルアミンを使用し、ヒドラジンは2'-OHおよびエキソサイクリックアミン機能でそれらを除去するために第2の別々のステップで使用される。そうすることで、RNAオリゴヌクレオチド〜30-ntの長さと任意の配列は、マイクロアレイ22、23上でその中で合成できるようになりました。並行して、我々はまた、最近、DNAとRNAフォトリソグラフィーのスループット、品質、速度の問題に取り組み始めました。全DNA及びRNAアミド(図1)の結合効率を測定し、酸化時間から活性化剤の選択、最適な紫外線曝露まで、オリゴヌクレオチド伸長サイクルにおける個々のステップを調査した24,25.我々は数秒で取り除くことができる新しい光感受性5'保護グループをもたらし、数十万人の100mersの合成を数時間の長いプロセス26に変換した。また、2つの基板を同時に27個公開することで、アレイ製造のスループットを倍増しました。最後に、ライブラリー調製の中心となるDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドをクチク、収集、分析する便利な方法として、塩基感受性スクシニル基を含むdTホスホラミダイトを導入した。
DNAおよびRNA固相合成の比較的平凡な側面にもかかわらず、特に核酸化学者にとって、マイクロアレイフォトリソグラフィーは、複雑なセットアップ、プロセスの慎重な制御および監督を必要とする非些細なアップグレードのままであり、オリゴヌクレオチドの性質および適用の種類に応じて、合成後処理のための別々の指示。本稿では、実験設計からデータ解析まで、DNAとRNAマイクロアレイの合成におけるDNAとRNAマイクロアレイの全体のステップバイステップの手順を詳細に提示し、機器の調製に重点を置いて提供したいと考えています。消耗 品。次に、マイクロアレイ製造の目的(すなわち、ハイブリダイゼーションまたは核酸ライブラリーの回収)に対応する合成脱保護法について説明する。
Protocol
1. マイクロアレイ設計
- テキストエディタで合成するシーケンスを書きます, 5'→3', シーケンスごとに1行.品質管理25merの場合は、シーケンス「GTCATCATCATGAACCCTCTTC」を使用します。DNAヌクレオチドにはA、C、G、T文字、RNAヌクレオチドには5、6、7、8の数字を使用します。
- ライブラリの準備の場合は、各シーケンスの 3' 末端に追加の数値 (つまり、9) を追加します。これは、ベースセンシティブモノマーのカップリングに対応します。
- 各シーケンスの後にコンマを付けなければなりません。コンマの後の各シーケンスに名前を割り当て、各レーンが [シーケンス,#sequence_name]形式 (角かっこなしなし) に従っていることを確認します。シーケンスの一覧を .txt ファイルとして保存します。
- MatLab を起動し、プログラムChipDesign.mを読み込みます。プログラムを実行します。
- プロパティパネルウィンドウで、マイクロアレイのEntireChipレイアウトファイルをロードします。目的が4つの同一の場所で配列全体を合成することを目的としている場合は、MilliChipレイアウトファイルをロードします。
- [プロパティパネル] ウィンドウで、[チップ仕様]の [コンテナー]を選択し、[合成領域]を選択します。[パターン]で、アドレス指定可能なフィーチャの正しい量を生成するパターンを選択し、シーケンス数をカウントする品質管理 25mer の場合は、25:36 パターンを選択します。
- [コンテナーを選択]で、[Fiducial] を選択します。 フィデューシャル特徴は、通常、合成領域のコーナーで合成され、ハイブリダイゼーションデータを抽出するために使用されます。Fiducial を選択すると、受託機能に合成され、正のコントロールとして機能するシーケンス (5'→3') を記述します。25mer実験では、同じDNA配列を使用します。
- [シーケンス]で、書き込まれたすべてのシーケンスを含むテキスト ファイルを読み込みます。ランダム化が選択されていることを確認します。プロジェクトタイトルの実験にタイトルを付け、リンカーシーケンスでTTTTTを書きます(T5リンカーに対応)。
- [生成]を押し、MaskGen_delta_rc1/Designsフォルダーの下にある配列設計ファイルとマスク (図2) を検索します。表示スクリプト、フローシーケンス、およびデザイン ファイルが含まれていることを確認します。
- ライブラリの準備のために、表示スクリプトを開きます。スクリプトの最初の行を正確にコピーする表示スクリプトの下部に余分な行を追加します(First_Mask.bmp 150を表示します)。これは、すべてのオリゴヌクレオチドの5'末端で末端光保護群を除去する。
- ジョブ作成者AutoJobプログラムを起動し、[テンプレートの読み込み] をクリックしてテンプレートを読み込み、[スクリプトの表示]をクリックして、MatLab によって生成された表示スクリプト ファイルを読み込みます。を押します。この手順では、ジョブファイルと呼ばれる一連の命令を作成し、マイクロミラーとDNAシンセサイザーとのコンピュータの通信を制御します。
2. スライドの準備と機能化
- 合成セル上の入口と出口チューブの位置に対応する 2 つの位置に 1 つのスライドをドリルします。CNC ルータで 0.9 mm のダイヤモンド ビットを使用して、正確かつ確実にドリルします。掘削されたスライドを超純水ですすいで、スライドラックに並べ替えます。
- アンモニアベースの特殊目的クリーナーの5%を含む水浴でスライドを35°Cで30分間超音波処理して表面をきれいにします。スライドを二重蒸留H2 Oで洗い流し、清潔で乾燥したラックに移します。
- ドリルラックにドリルおよびドリルされていない顕微鏡スライドを配置します。大型の等級シリンダでは、475mLのエタノール(EtOH)をddH2Oの25mL、10gのシラン化試薬(N-(3-トリトキシシルプロピル)-4-ヒドロキシブチルアミド)と1mLの酢酸を混合して機能化溶液を調製する。均質になるまでよくかき混ぜ、適切な閉じた容器に移します。
- ロードされたラックを容器に入れ、蓋を閉じ、室温で4時間の軌道シェーカーにそっと揺らせます。
- 4時間後、機能化溶液を廃棄し、EtOHの475 mL、ddH 2Oの25mL、酢酸1mLからなる洗浄液の500 mLに置き換えます。室温で20分間ゆっくりと撹拌し、廃棄し、500 mLの新鮮な洗浄液に置き換えます。
- 室温でさらに20分後、溶液を廃棄し、アルゴンの流れでスライドを乾燥させ、120°Cで予熱した真空オーブンでそれらを硬化させます。2時間後、オーブンと真空ポンプをオフにしますが、一晩減圧下にスライドを残します。その後、オーブンを大気圧に戻し、さらに使用するまでスライドをデシケータに保管します。
3. 合成試薬及び反応剤の調製
- リンアミド粉末(図1)を貯蔵温度(-25または-45°C)からデシケータの室温に持ち込みます。
- リンアミド酸塩が室温に達したら、標準DNAおよびRNAリンアミド化物の30mM濃度に達するために、超乾燥アセトニトリル(<30 ppm H2O)の体積で粉末を溶解し、ベース感受性dTモノマー(塩基感受性dTモノマーに対して50mM)ライブラリの準備)。湿度の痕跡をトラップするために、小さな分子ふるい袋を追加します。
- イミダゾール11gを乾燥DMSOの1Lに溶解することにより、DMSOで1%(w/w)イミダゾールの溶液を調出す。完全に溶解するまでよく振ります。溶液をDNAシンセサイザの補助ポートに取り付けます。これは、5'-フォトプロテクション群の完全な除去に必要な露光溶媒になります。
- ライブラリーの合成のために、ジクロロメタンの100mgのβ-カロテンを10mLのジクロロメタンに溶解することにより、ジクロロメタン中の1%(w/v)β-カロテンの溶液を調製する。琥珀色のガラス瓶でよく振り、アルミホイルで包みます。
4. マイクロアレイ合成の準備とモニタリング
- マイクロアレイ製造室の温度と湿度を記録し、DNAシンセサイザーが十分なヘリウム圧力下にあることを確認します。
- UV-LEDとその冷却ファンの電源を入れます。入ってくる紫外線の焦点面にUV強度計を取り付け、オンにします(図3A)。
- コンピュータで、ジョブファイル/マイクロミラー/合成ファイルコントローラソフトウェア(WiCellという名前)を起動します。次に、マイクロミラー デバイスを初期化し、DMD を右クリックしてオール ホワイトマスク ファイルを読み込み、[イメージの読み込み]を選択します。
- UVS アイコンを右クリックし、[UVシャッターを開く]を選択します。強度計の電力値(mW/cm2)を読み取り、60sを数えます。60 度後、電力値をもう一度読み取り、開始値と終了値を書き留めます。UVシャッタークローズを選択してシャッターを閉じ、強度計をオフにします。mW/cm 2 の平均 UV 強度値を計算します。
- 5'-NPPOCフォトデプロテクション(DNAおよびRNAマイクロアレイ)の6J/cm2の放射エネルギーに到達するために必要な露光時間を計算し、5'-BzNPPOCフォトデプロテクション(DNAライブラリ)の場合は3J/cm2を、単に
関係に従って計算します。 - DNAシンセサイザーワークステーションソフトウェアで、MatLabによって生成されたフローシーケンスの内容をコピーして貼り付けることによって、シーケンスエディタにシーケンスファイルを作成します。最初のカップリングに進む前に基板の表面を洗浄するために、3'端(デフォルトのサイクル文字:「s」)に余分な2つの洗浄ステップを追加します。シーケンス ファイルを保存してエクスポートします。
- ワークステーション ソフトウェアのプロトコル エディタで、シーケンス ファイルに存在する各文字と数字にちなんで名付けられた専用サイクルを含むプロトコルを作成します (シーケンス ファイルに文字 A、C、G、および T のみが含まれている場合など)。A、C、G、および T という名前の 4 つのサイクルが含まれています)
- DNAホスホラミド(サイクルA、C、G、T)の結合時間を15sに設定し、rUリンホラミサイト(サイクル8)では120s、rA、rCおよびrGリンアミド(サイクル5、6、7)の場合は300sに設定します。ライブラリの準備のために、ベース感度の高いクリーブ可能な dT モノマーのカップリングを 2 × 120 s (表1および表 2)に設定します。
- 各サイクルの 2 つのイベント 2 Out通信イベント間の待機時間が、必要な放射エネルギーに到達するために計算された UV 露出時間に対応していることを確認します。シーケンス ファイルに関しては、プロトコル ファイルを保存してエクスポートします。
- WiCellソフトウェアで、それぞれのサブウィンドウにジョブ、シーケンス、プロトコルファイルをロードし、[送信]をクリックして、シーケンスファイルとプロトコルファイルをDNAシンセサイザーに送信します。
- シーケンス ファイルで、各リンアミドマイトの結合数をカウントします。
- 各合成を実行するために必要なリンアミド溶液の必要量(μL単位)を測定するには、カップリングの数に60を掛けます。DNAシンセサイザー上のラインの安全性とプライミングのために各容積に250 μLを追加します。単一のカップリングのみを必要とするリンアミドには、250 μL のベースボリュームを使用します。
- プロトコルサイクルのポート文字/番号に対応するDNAシンセサイザー上のバイアルに溶液を素早く転送します。
- リンアミド化溶液でポートをプライムにし、試薬でラインを満たすために、それぞれ10個の素数パルスを使用します。反応細胞を取り付ける前にアセトニトリル洗浄ラインをプライムする。
- 合成細胞を組み立てるには、細胞の石英ブロック上に最初に厚い(250 μm)パーフルオロエラストマー(FFKM)ガスケットを置きます。最初のガスケットの上に掘削された機能性顕微鏡スライドを置き、スライドの穴が合成細胞の入口および出口管と接続していることを確認します。
- 2つ目の薄い(50 μm)ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ガスケットを掘削スライドの上に置き、2つの穴を囲みます。最後に、2番目のガスケットの上に2番目の機能を持つが未掘削のスライドを置きます(図3B)。組み立てられた二重基板セルの上に4ネジメタルフレームを置き、トルクドライバを使用して同じクランプ力(0.45 Nm)にネジを締めます。
- 入口と出口チューブをDNAシンセサイザーに取り付けます。アセトニトリル洗浄ラインをプライムし、基板を介したアセトニトリル(ACN)の適切な流れを確認します。この段階でACNの漏れが観察できる場合は、細胞を分解して再組み立てます。ACNプライミングの7サイクルを経た後、廃棄物ラインでのACNの体積を測定します。このボリュームは 2 mL である必要があります。
- 入ってくる紫外線の焦点面に合成セルを取り付けます。図書館調製の場合は、余分な入口と出口線をセルの背面に取り付け、β-カロテン溶液で裏室を充填する(溶液の2mLで十分である)。漏れがないことを確認してください(図3C)。
- 最初に WiCell ソフトウェアで実行をクリックして合成を開始します。ジョブ・ファイルの最初の WAIT コマンドで、DNA シンセサイザーの[スタート]を押します。
- 合成中に、マスクファイルの表示が紫外線露光とシャッターの開口部と一致することを定期的に確認します。
- 通常のマイクロアレイを合成した後、シンセサイザーから細胞を切断し、細胞を分解し、ダイヤモンドペンを使用して合成番号をガラススライドにエッチングします。各スライドの非合成面の番号をエッチングします。スライドを50 mL遠心チューブに移し、さらに使用するまで乾燥した場所に保管してください。
- ライブラリーマイクロアレイの合成後、まずβ-カロテン溶液をチャンバから排出し、次にCH2Cl2の2×5 mLを流して洗浄し、次に排水する。ステップ 4.21 に準拠して分解を続行します。合成された配列は肉眼で見えるかもしれません(図4)。
関係に従って計算します。5. DNAマイクロアレイの保護解除
- 染色ガラス瓶に20mLのEtOHと20 mLのエチレンディアミン(EDA)を充填します。DNAのみのマイクロアレイを瓶の中に縦に置き、蓋を閉め、スライドを残して室温で2時間保護します。
注意:EDAは、急性毒性、腐食性および可燃性液体である。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。 - 2時間後、ピンセットを使用してスライドを取り出し、二重蒸留H2 Oで十分にすすいでください。
- マイクロアレイ遠心分離機でスライドを数秒間乾燥させ、その後、デシケータに保存します。
6. RNAマイクロアレイの保護解除
- 50 mL遠心管で、2:3トリエチルアミン/ACN(それぞれ20mLおよび30mL)の乾燥溶液を調出す。1つのRNAマイクロアレイスライドを遠心管に移し、蓋を閉じてからプラスチックシールフィルムで包みます。室温で1時間30分、軌道シェーカーで遠心管をゆっくりと振ります。
- 1時間30分後、スライドを取り外し、2×20mLの乾燥ACNで洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。
注意: トリエチルアミンは、急性毒性、腐食性および可燃性液体です。アセトニトリルは有毒で可燃性です。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。
注: 最初の保護解除手順が完了しました。 - 0.5Mヒドラジン水和液を3:2ピリジン/酢酸で調圧します。まず、20mLの酢酸と30mLのピリジンを等級シリンダーに混ぜます。1.21 mLのヒドラジン水和物を加える前に、溶液が冷却するのを待ちます。得られた溶液の約40 mLを50mL遠心管に移す。
注意:ヒドラジン水和物は、急性毒性と腐食性液体です。ピリジンは非常に可燃性で急性毒性があります。酢酸は可燃性で腐食性があります。換気の良いヒュームフードで手袋を使用します。 - 最初の脱保護工程の後、RNAスライドをヒドラジン水和液に移し、蓋を閉じてプラスチックシールフィルムで包む。室温で2時間、軌道シェーカーでチューブをゆっくりと振ります。2時間後、スライドを取り外し、2×20 mLの乾燥ACNで洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で数秒間乾燥させます。
注: 2 回目の保護解除ステップが完了しました。 - RNAマイクロアレイにもDNAヌクレオチドが含まれている場合は、第3の保護解除工程を進めます。50 mLの遠心管で、EDAの20 mLをEtOHの20 mLと混合する。DNA/RNAマイクロアレイを1:1 EDA/EtOH溶液に追加し、室温で5分間放置します。
- 5分後、スライドを取り外し、2×20 mLの滅菌水で洗浄し、マイクロアレイ遠心分離機で乾燥させ、デシケータに保管します。
7. 蛍光標識された相補鎖とのハイブリダイゼーション
- アセチル化牛血清アルブミン(10mg/mL)とCy3ラベルの相補鎖(100nM)を解凍し、室温まで温めます。
- 1.5 mLの無菌マイクロ遠心管で、 2x MESバッファーの150 μL(200 mM 2-(N-モルフォリーノ)エタンスルホン酸;1.8M NaCl;40 mM EDTA;0.02% Tween-20)をCy3標識DNAの26.7 μL、アセチル化BSAおよび1μLの13.4 μLを混合する。渦。両方のスライドをハイブリダイゼーションに使用する場合は、ボリュームを 2 倍にします。
- ハイブリダイゼーションオーブンをデュプレックスのTm以下の温度にあらかじめ温めますが、フルマッチシーケンスと非一致シーケンスの間で良好な判引を確保するのに十分な高さです。品質管理25merの場合は、温度を42°C(59°CのTm)に設定します。
- 上記で調製したハイブリダイゼーション溶液中の各スライドおよびピペの合成領域の上に、自己接着性300μLハイブリダイゼーションチャンバを慎重に配置します。接着ドットでチャンバーの穴を覆い、アルミ箔でスライド全体を包みます。
- マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、カバーし、選択したハイブリダイゼーション温度で2時間ゆっくりと回転させます。
- 2時間後、スライドを取り外し、アルミ箔を取り外し、ハイブリダイゼーションチャンバを慎重に引き裂きます。スライドを30mLの非ストリンジェント洗浄バッファー(NSWB;0.9M NaCl、0.06 Mリン酸塩、6 mM EDTA、0.01%Tween20、pH 7.4)を含む遠心管に移し、室温で2分間激しく振ります。
- 30 mLのストリンジェントウォッシュバッファ(SWB;100mM MES、0.1 M NaCl、0.01%Tween20)を含む遠心管にスライドを移し、1分間激しく振ります。
- 最後に、最終洗浄バッファー(FWB;0.1x塩水ナトリウム)の30 mLを含む遠心管にスライドを移し、数秒間振ります。スライドをマイクロアレイ遠心分離機で乾かします。
- ドライマイクロアレイを下向きに、マイクロアレイスキャナのスライドホルダーに入れます。Cy3 ラベル付きデュプレックスの場合は、532 nm の励起波長、575 nm フィルター、および 350 のフォトマルチプライヤを使用して、5 μm の解像度でスキャンします。高解像度スキャンを .tif イメージ ファイルとして保存します (図 5A)。
8. データ抽出・分析
- データ抽出の前に、保存したアレイスキャンをイメージエディタで回転させて、スキャンの左上隅にある最も長い線維機能のチェーンを配置します。回転した画像を保存します。
- NimbleScanを起動し、ファイルを押す |配列スキャンを開いて読み込みます。次に、[デザインファイル] サブセクションの [参照] をクリックして、 を読み込みます。マイクロアレイ実験の設計中に自動的に生成されたndfデザインファイル。次に、[開く]をクリックします。
- [ビュー]で、[自動コントラスト/明るさ]をクリックします。スキャンの上に手動で揃えるアイコンをクリックします。スキャンの 4 つのコーナーに 4 つの正方形のマーカーを配置し、もう一度緑色のアイコンをクリックします。[分析]をクリックしてハイブリダイゼーション データを抽出し、[レポート]をクリックしてからプローブレポートをクリックします。
- を開きます。スプレッドシート エディタのプローブレポート ファイル。列 B と I を保持し、抽出されたデータからの平均値と標準偏差の計算を続行する前に残りを破棄します (図 5B)。
9. 図書館の保護解除、切断、回収
- DNAライブラリを脱保護して切り分けるには、50 mL遠心管に1:1乾燥EDA/トルエンの溶液を調調します。 スライドを切断液に浸し、スライドを閉じてプラスチックシールフィルムで包み、室温で2時間の軌道シェーカーで穏やかに回転させます。
- 2時間後、スライドを取り出し、綿密に乾燥したACNの2×20 mLで洗浄します。スライドを取り外し、空気を乾燥させます。
- ピペットを使用して、現在識別可能な合成領域の上に無菌H2 Oの100 μLを適用します。溶液を1.5 mLマイクロ遠心管に移す前に、溶液を数回上下にピプティングします。このプロセスを繰り返し、同じチューブに溶出するマイクロアレイを組み合わせます(図6)。
- 2×100μLのチップを蒸発して乾燥させ、ヌクレアーゼフリーH2Oの10μLに再溶解し、UV-Vis分光光度計で吸光度を測定します。
- C18樹脂を装備した10 μLピペット先端のDNAライブラリーを脱塩します。まず、溶出チップを0.1Mトリエチランモニウム酢酸トリエチランモニウム(TEAA)緩衝液に変換します。
- H2 O/ACN 1:1の3 x10 μLを目指して樹脂を濡らし、0.1 M TEAAバッファーの3 x 10 μLで洗浄して樹脂を平衡化します。チップをピペッティングしてDNAを結合し、樹脂を通して10回上下に溶出します。0.1 M TEAA バッファーの 3 x 10 μL、H2O の 3 x 10 μL で樹脂を洗浄します。
- H2O/ACN 1:1の10μLで樹脂を洗浄することにより、先端から脱塩DNAを溶出します。脱塩溶液を乾燥させ、無菌H2 Oの10 μLに再溶解し、UV-Vis分光光度計で吸光度を測定します(図7)。ライブラリを蒸発して乾燥させ、さらに使用するまで-20°Cで保存します。
Representative Results
DNAおよびRNAマイクロアレイハイブリダイゼーション
図5は、25mer配列(5'-GTCATCATGAACCACCCTTC-3'DNA形態)のDNAおよびRNAバージョンを含むマイクロアレイ上で行われたハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す。図5Aのスキャンは、Cy3蛍光の励起/発光スペクトルに対応する緑色のフォーマットで現れ、蛍光強度は0〜65536の任意の単位で記録される。アレイの設計は、プロトコルセクションで説明されている25:36の機能レイアウトに従いました。スキャンは、アレイの適切な向きの後に表示され、左上隅には最も長い線維の一覧が設定されます。ここで、fiducial特徴は25merのDNAバージョンを含み、原理的には、スキャンアライメントおよびデータ抽出を行うために常に正の蛍光シグナルを与えるべきである。ハイブリダイズマイクロアレイは均一に明るく見え、合成領域のエッジは通常中心よりも明るく(最大50%明るい)。大量のシーケンスレプリケートは、領域全体にランダムに分散され、空間アーティファクトの影響を軽減します。ここで、各配列(DNAおよびRNA)を2,000のランダムな位置で合成した。一般的に低蛍光ノイズ(背景)、<50 a.u.があり、ハイブリダイゼーションアッセイでは200:1~800:1の順に信号/雑音比が生じる。データ抽出後、蛍光強度が平均化され±SDをプロットします。
実験間の絶対蛍光値には有意な変動があります。ここでは、同じ製造パラメータと同じ合成後処理を用いて、3つの独立した合成の結果を示す。25mer DNAは、相補的なCy3標識DNA鎖にハイブリダイズすると、20,000から30,000の範囲のどこにでも蛍光シグナルを生成します。25mer RNAは、同じCy3標識DNA補体にハイブリダイズすると、15,000から20,000までの対応する特徴に蛍光強度を与えます。しかし、RNA/DNA二重の蛍光強度は、対応するDNA/DNAデュプレックスが20,000-30,000の範囲内で蛍光を続けると、時折8,000を下回ります。このような場合、RNAの結果は最適でないものと見なされる可能性があります。DNAまたはRNAの合成またはハイブリダイゼーションの失敗は、明らかな蛍光の欠如からスキャン中にすぐに顕著になります。RNA合成が失敗するか部分的に成功する機会が複数あり、議論の部分で概説されます。
図書館の保護解除、切断および回復
ライブラリの複雑さと密度に応じて、合成された配列の形状と輪郭は、倍率なしで、適切な照明の下で見ることができます(図4)。EDA/トルエンによる保護解除後、および切除されたライブラリーを収集するために水を添加する前に、現在保護されていないオリゴヌクレオチドを含む合成領域は、ガラススライドの残りの部分が現れるとき、親水性ゾーンとして目立つ場合があります。濁った疎水性層で覆われてる。合成領域の直接観察は、オリゴヌクレオチドの合成に使用される総面積に依存します:合成領域のより大きな使用は、表面上の親水性領域と疎水性領域の明確な区別の大きなチャンスに対応します。逆に、より少ないミラーと小さな機能を使用して合成されたライブラリは、すぐには観察できない場合があります。
同様に、脱塩後に回収されたDNAの量は、合成に使用される総面積に直接比例する。すべての特徴がオリゴヌクレオチド合成に使用される場合、切断および回復手順はDNAの25と30 pmolの間で得るべきである。したがって、合成領域の10%の使用は、DNAの約3pmolのみの余裕があります。
図 1.マイクロアレイフォトリソグラフィーによるオリゴヌクレオチド合成に用いられるDNAおよびRNAリンアミドサイトの化学構造。5'-OHにおける標準的なニトロフェニルプロピルキシオキシカルボニル(NPPOC)感光保護基は、ハイブリダイゼーション目的で通常のDNAおよびRNAマイクロアレイ合成に使用されています。複雑なDNAライブラリーの合成では、BzNPPOCがNPPOCの2倍の速さで除去され、マイクロアレイ合成時間が大幅に短縮され、5'-OHでより多くの光ラビアルベンジル-NPPOC(BzNPPOC)が好ましい。ライブラリー用DNAオリゴヌクレオチドはまた、3'末端にクリータブルdTモノマーの結合を必要とする。コクナイルエステル機能を持つこのモノマーは、保護解除中に切り取り、マイクロチップからDNAを採取できるようにします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.紫外線露光中にマイクロミラーデバイスに送信される画像ファイルとしてのマスクの例。白いピクセルは、合成セルに紫外線を反射し、「ON」位置に傾くミラーに対応します。黒いピクセルは、UV 光がセルから反射される "OFF" ミラーに対応します。したがって、白いピクセルは、ガラス基板上の対応する特徴で見つかったオリゴヌクレオチド上の次の着信リンオラミダイトの結合を可能にする。対応するミラーがあるフィーチャに合成されたオリゴヌクレオチドは、このマスクファイルでは、次のカップリングイベント中に黒いピクセルが不活性のままです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.マイクロアレイフォトリソグラフィー光学および合成セットアップの写真.(A) 紫外線露光用光回路。UV-LEDからの紫外線は、まず長方形断面ライトパイプを介して均質化され、マイクロミラーに反射します。「OFF」位置に傾いたマイクロミラーは合成細胞から離れた紫外線を反射しますが、「ON」位置のマイクロミラーは、最初に1:1オフナーリレーを通過することにより、焦点面に位置する合成セルに光を反射します。イメージングシステム。(B)合成細胞は、一旦組み立てられ、細胞の石英ブロック上に最初に配置されたドリルスライドから構成され、厚いPTFEガスケットで区切られた(図示せず)。次に、ドリルされていない2番目のスライドを掘削スライドの上に配置し、薄いPTFEガスケットで区切られています。金属フレーム(図示せず)は、アセンブリを一緒に保持します。(C)ライブラリー調製のために、合成細胞が入ってくる紫外線の焦点面に取り付けられると、クォーツブロックとドリルスライドの間に位置するチャンバは、CH2Cl2におけるβ-カロテンの1%溶液で満たされる。そうするために、追加の入口および出口の管は石英ブロックに付加され、オレンジ色の溶液は右端から左端に流れる。合成のための試薬および溶媒の流れは白い矢印で示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.合成領域は通常肉眼で見える。ここでは、DNAライブラリーは、合成直後にガラス表面に見ることができ、DNAはまだ保護された形で見ることができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.マイクロアレイ上でその中で合成された25mer DNAおよびRNA配列に対するハイブリダイゼーションアッセイ。 (A) ハイブリダイズDNAおよびRNAマイクロアレイ全体の蛍光スキャン。25mer DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドは、Cy3標識された補体鎖にハイブリダイズされる。アレイは5μmの分解能で532nmの励起波長でレーザーでスキャンした。(B) DNA:DNAとRNA:DNA二重の蛍光強度(任意単位)を3つの別々の実験で行う。その現場で合成されたRNAオリゴヌクレオチドに関する薄緑色のデータは、対応するDNA配列の蛍光強度と比較した場合、最適でないと考えることができる。誤差バーはSDですこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.マイクロアレイ上で合成されたDNAライブラリーの保護解除、切断および回収手順の概略表現。DNA配列は、ベース感受性のdTヌクレオシド(ズーム領域に示す)で成長する。合成後、EDA/トルエンにおけるDNAオリゴヌクレオチドの脱保護(塩基保護基は赤球として表される)は、脱光体物質を静電気的に表面に結合し、少量のペペテットアウトすることができる。合成された領域に水を入れます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.4,000の異なる配列を含む切り分けされた脱塩DNAライブラリーの代表的な吸光スペクトル(220〜350nm)、長さは100-ntである。合計940ngのDNAを単一のアレイ合成から単一のアレイ合成から単離し、DNA合計の30pmol、またはガラス基板当たり15pmolに相当する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.対応するリンオラミダイトがポート「A」にロードされたと仮定して、5'-BzNPPOC-dAの結合/酸化/光脱保護のための代表的なサイクルプロトコル。カップリング時間(秒単位)は「カップルモノマー」ラインに表示されます。UV光消光時間は、ここで3J/cm2(BzNPPOC光化学)の放射エネルギーに対応し、2つの「イベント2アウト」通信信号間の経過時間として算出される。
表 2.対応するRNAリン化体がポート「A」にロードされたと仮定して、5'-NPPOC-rAの結合/酸化/光脱保護のための代表的なサイクルプロトコル。カップリング時間(秒単位)は「カップルモノマー」ラインに表示されます。UV光消光時間は、ここで6J/cm2(NPPOC光化学)の放射エネルギーに対応し、2つの「イベント2アウト」通信信号間の経過時間として算出される。
Discussion
固相DNAとRNA合成は、すべての核酸化学実験室のパンとバターであり、フォトリソグラフィー成分の添加は明らかに複雑な操作であるが、紫外線によって媒介されるマイクロアレイ製造も非常に信頼性の高いプロセスである。.さらに、マイクロアレイ上のオンシチュRNA合成において利用可能な唯一の方法である。それでも、他の多段階実験手順と同様に、ヒューマンエラーの余地は十分にあります。
おそらく最も重要なステップは、合成誤差の少ないオリゴヌクレオチドを与えるために常に高収量の化学反応である必要があるので、リンの結合です。当社のマイクロアレイ合成プロトコルでは、製造プロセスがキャッピングをバイパスし、オリゴヌクレオチド精製を防止するため、リンアミド結合は全体的な合成品質にさらに重要です。99%を超えるステップワイドカップリング効率は、非常に短い結合時間(15s)24であっても、すべての感光性DNAおよびRNAリンアミドに対して計算されているが、特にdGアミドの場合には、より低い結合収率が時折発生する可能性がある。室温での可溶化リンアミド化物の安定性は以前に調査され、ヌクレオベースの性質に依存することが示され、グアノシンリンアミドミド質は29日の間に広範囲に分解されやすくなり、 30.しかし-25°Cで保存すると、30mM溶液としてACNに溶解したdGリンアミドミドが数週間安定であることが判明した。しかし、室温でのdGリンアミダン化溶液の相対的な不安定性は、DNAシンセサイザーに数日間付着してはならないことを意味する。
RNAリンアミド化物の場合、結合収率はリンアミド質の品質(31 P NMR分光法で評価可能)およびカップリング時間に大きく依存する。rA、rG、rC、rUの場合は5分間のカップリング時間が必要と思われます。実際、すべてのRNAリンアミド化物の凝縮時間を2分に短縮すると、ハイブリダイゼーションシグナルが有意に低下することがわかりました。
DNAシンセサイザー自体、ならびに試薬および溶媒は、オリゴヌクレオチド合成の最高収率を達成するために、確かに可能な限りクリーンである必要があります。しかしながら、不溶性材料、塩または粒子は、送達システムのラインおよびチューブに時間をかけて蓄積し、試薬および反応物の消費量の徐々に減少する。シンセサイザーの一般的な洗浄が低出力ボリュームを解決しない場合、パルス数の増加は代替ソリューションになる可能性があります。低リンアミド化の場合に特に有用であり、リンアミドミサイトと活性化剤の混合物のポンピングに対応するカップリングプロトコル内のライン(表1および表2のカップリングサブセクションの第3行)を可能にすることができる。合成品質に大きな悪影響を及ぼすことなく、6~9パルスを変更します。さらに、アミディット/アクチベータミックスを合成基板に持ち込むのに必要な活性化剤のパルス数(現在、カップリングサブセクションの4行目、表1および表2参照)は、DNAシンセサイザー自体に依存し、合成細胞のチューブの長さ。この数は、リンアミドを着色溶液に置き換え、カップリング用のガラス基板に着色ミックスをプッシュするために必要なパルスの数をカウントした後に調整することができます。
ここに記載される方法は、DNAおよびRNA合成が同じマイクロアレイ上で同時に進行することを可能にする。DNAとRNAのハイブリッドは、アレイ製造プロトコルに変更を与えることなく、および3段階の保護解除プロトコルが続く限り調製されてもよい。しかし、RNAのみのマイクロアレイは、2段階の保護を必要とします:最初にEt3 Nでデシアノエチル化、続いてヒドロキシルとヒドラジンによる塩基保護を行います。DNA核酸塩基は、これらの条件下で完全に保護されていないことが判明し、フェノキシアセチル(Pac)基の完全な除去に影響を与えるためにEDAの追加ステップが必要です。EDAによるこの余分な治療は、DNAマイクロアレイ31の標準的な保護保護よりも短い(5分)であるが、トリエチルアミンおよびヒドラジン治療後に完了するためにそれを駆動するのに十分である。さらに、EDAとの短い反応時間は、完全に保護されたRNAオリゴヌクレオチドの暴露を基本条件に制限する。
スポッティングまたはDNA転写32、33、34のような代替方法に対するその代わりのRNAアレイ合成における利点は、合成されたRNAマイクロチップを使用するまで保護された形態で保存する能力であり、従って回避する。潜在的なRNA劣化のリスク。一方、RNAの合成後の手順は、消耗品や試薬が無菌に保たれ、RNaseフリー条件下で処理が行われることを意味します。なお、ハイブリダイゼーションミックスへのRNase阻害剤の添加は、RNA特徴に対してより強いハイブリダイゼーションシグナルを得られなかったことがわかった。
ベース感受性モノマー上のDNAライブラリの合成は、表面上のいくつかの制御配列の合成よりも複雑であり、そのため、確かに設計エラーが発生しやすくなります。しかし、シーケンス設計(すなわち、性質とシーケンス数)が正しいと仮定すると、このリストを露出マスクのコレクションに変換し、順序付けされた一連のカップリングサイクルは簡単なプロセスのままです。しかし、標準的なマイクロアレイ合成からの重要なバリエーションが存在し、高密度ライブラリアレイの製造を成功させるために重要です。
まず、基感受性dTモノマーは、リンカーの合成後の第1のリンオラミダイトとして結合される。このモノマー(図1)の結合収量(図1)は、ACN濃度を30mMから50mMに増加させることにより、または繰り返すことによって、その組み込み率を改善するための努力がなされる理由である。カップリングステップ:新鮮なモノマーを使用した2つの連続したカップリング反応、または2つの別々の連続したカップリングサイクル。
第2の変化は、365nmの光を便利に吸収する合成細胞の後部チャンバにβ-カロテン溶液を添加することです。これは、UV 光がアレイ基板に反射するのを防ぐため、フォトリソグラフィーセットアップの重要な変更です。実際に、基板間の間質媒体を横断した後、着信UV光は掘削されたスライドを通って出て、細胞の石英ブロックに達する。フレネル方程式は、垂直に入射された紫外線の約4%が、3つの下流のエアガラス界面(第2基板の出口側と石英ブロックの両側)から反射し、合成基板に戻ると予測しています。光保護オリゴヌクレオチドの意図しない暴露につながる。回折と散乱はまた、「オフターゲット」光消光に寄与し、したがって、合成の誤差率に直接影響を与えるヌクレオチド挿入に寄与するが、これらの寄与は反射よりもはるかに小さく、主に合成密度を減らす(特徴間のギャップを残す)。細胞の下部チャンバにおけるβ-カロテン溶液のレベルは、アレイ合成の最初の数分の間にのみわずかに減少する傾向があるため、監視し、再調整する必要があることがわかりました。
最後に、3番目の変化は、おそらく静電相互作用を介して、表面に結合した切り分けされたDNAライブラリーを保持するトルエンのEtOHを置き換える脱保護ソリューションです。ACN洗浄後に少量の水を合成領域に塗布することで、図書館を便利に回収することができます。しかし、このプロセスは、EDAおよびトルエン中の水分含有量が最小限であれば、核酸が保護解除カクテルに完全に不溶性を与える場合にのみ成功する。あるいは、DNAライブラリーは、アンモニア9、10、14、35を用いてチップを切断し、次いでDNA含有水性アンモニア溶液を一晩55°Cに加熱して更に非保護化してもよい。しかし、アンモニアを用したDNAライブラリーの回収はRNAと互換性がない。塩基板上のRNAオリゴヌクレオチドは、上述したのと同じEDA/トルエン手順を用いて表面から溶出することができるが、Et3Nおよびヒドラジン2段階脱保護戦略28の後の最終段階でのみである。
特定の基本的な治療を必要とせずにマイクロアレイからオリゴヌクレオチドプールを回収するための代替戦略が存在し、原理的にはフォトリソグラフィーと互換性があり、酵素の使用に依存する。例えば、単一のデオキシウラシルヌクレオチドは、ウラシルDNAグリコセラーゼ(UDG)の標的であり、DNA配列の残りの部分から切除することができ、または単一のRNA単位は、RNase H型酵素およびホスホジエステル結合5'によって、リーブされたRNAに認識することができる。、5' DNA パート23を解放します。
DNA、RNA、ハイブリッドDNA/RNAマイクロアレイの合成に対して、強力で信頼性の高い高密度手法を採用しました。これらは、ハイブリダイゼーションまたは結合アッセイ36のプラットフォームとして機能するだけでなく、複雑な核酸ライブラリーを生成するための迅速かつ安価な方法を表す。DNAベースのデジタルデータストレージの場合、マイクロアレイフォトリソグラフィーは「書き込み」のボトルネック(すなわち、合成による情報の符号化)に対する潜在的な解決策となる可能性があります。DNAおよびde novo遺伝子アセンブリにおけるデジタル符号化の成功は、合成レベルでエラー率に変換する配列忠実度に依存する。現在のアレイ製造プロトコルにおける合成エラーと光学エラーについて、他の場所で議論し、報告します。並行して、製造規模とスループットをさらに向上させる取り組みが進められています。
Disclosures
著者は、彼らが任意の営利団体と提携していないと証明します。
Acknowledgments
この研究は、オーストリア科学基金(FWF助成金P23797、P27275およびP30596)とスイス国立科学財団(グラント#PBBEP2_146174)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slide functionalization | |||
| Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
| CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
| Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
| N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
| Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
| Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
| Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
| Microarray synthesis | |||
| 0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
| 0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
| 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
| 250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
| 2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
| 365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
| 5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
| 5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
| Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
| Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
| DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
| DNA and RNA microarray deprotection | |||
| Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
| Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
| Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
| Imidazole | Sigma | 56750 | |
| Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
| Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
| Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
| β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
| Hybridization and scanning | |||
| 20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
| 5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
| Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
| BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
| EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
| GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
| Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
| MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
| MES sodium | Sigma | M3058 | |
| NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
| SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
| Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
| Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
| Data extraction | |||
| Excel | Microsoft | For data extraction | |
| MatLab | MathWorks | Microarray design | |
| NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
| Desalting and quantification | |||
| NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Toluene | Merck | ||
| ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |
References
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