Summary
正交人肝转移性黑色素瘤异种移植小鼠模型是利用手术正位植入技术与患者衍生的肿瘤块和针注射技术与培养人类uveal黑色素瘤细胞系创建。
Abstract
近几十年来，与传统的人类细胞相比，皮下植入的患者衍生异种移植肿瘤或培养的人类细胞系越来越被公认为研究免疫缺陷小鼠中人类癌症的更具代表性的模型。线体外。最近，在小鼠中开发了正位植入患者衍生的肿瘤异种移植（PDX）模型，以更好地复制患者肿瘤的特征。肝正交异种小鼠模型有望成为一个有用的癌症研究平台，为肿瘤生物学和药物治疗提供见解。然而，肝正交肿瘤的植入一般是复杂的。在这里，我们描述了我们治疗患者衍生的肝转移性黑色素瘤肿瘤的正射体植入方案。我们培养人类肝脏转移性黑色素瘤细胞系到免疫缺陷小鼠。这些方案可以使用具有患者衍生的Uveal黑色素瘤块的外科正交植入技术或具有培养人类细胞系的针注射技术，从而持续获得高技术成功率。我们还描述了CT扫描检测内部肝肿瘤和再植入技术使用冷冻肿瘤实现再移植的协议。这些方案共同为肝转移性黑色素瘤的肝正位肿瘤小鼠模型在转化研究中提供了更好的平台。
Introduction
乌韦黑色素瘤是西方成人最常见的眼内恶性肿瘤。在过去50年中，美国1、2个州的乌韦黑色素瘤发病率（百万分之5.1）保持稳定。乌韦黑素瘤产生于虹膜、纤毛体或胆囊中的黑色素细胞，当它发生转移时，它是一种极其致命的疾病。乌韦黑色素瘤转移患者1岁时死亡率为80%，转移初步诊断后2年死亡率为92%。从转移诊断到死亡的时间通常很短，不到6个月，没有治疗3，4。癌症通过血液扩散，并倾向于主要转移到肝脏（89-93%）4，5。为进一步研究肝转移性黑色素瘤，迫切需要一种有效的小鼠模型。对于转化研究，有一个明确的需求，以生成肝脏局部转移性黑色素瘤小鼠模型。
患者衍生的肿瘤异种移植（PDX）小鼠模型有望提供个性化的医学策略。这些模型可能是临床结果的预测，可用于临床前药物评估，并用于肿瘤生物学研究6。代表性的PDX模型是异位植入肿瘤的异种移植小鼠，它们在皮下部位有肿瘤。大多数研究人员可以做手术的皮下植入没有特殊的做法7，8。它们也可以很容易地监测皮下肿瘤。虽然皮下PDX模型在研究阶段开始流行，但在实际应用方面还是有一些障碍。皮下植入迫使患者衍生的肿瘤在肿瘤来源不同的微环境中移植，从而导致移植失败和减缓肿瘤生长9，10，11， 12，13，14.对于PDX模型来说，正交可能更理想和合理，因为它使用与原始肿瘤15、16相同的器官。
最近，我们开发了患者衍生肝转移性黑色素瘤肿瘤的外科正交植入技术，以及使用NOD培养的人类肝转移性黑色素瘤细胞系的针注射技术。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ （NSG） 小鼠17，18.该协议使技术成功率始终居高不下。我们还建立了CT扫描技术，用于检测内部肝肿瘤，并在PDX平台中开发了冷冻肿瘤的再植入。研究发现，乌韦黑素瘤肿瘤异种移植模型保持原患者肝肿瘤的特征，包括其组织病理学和分子特征。这些技术共同为肝正位肿瘤模型在转化研究中提供了更好的平台。
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Protocol
根据机构审查委员会批准的协议，参与研究的患者应提供书面同意，允许将废弃的手术样本用于研究和基因研究。该协议严格按照国家卫生研究院《照料和使用实验室动物指南》中的建议执行，并经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 新鲜患者衍生肿瘤组织的集合
- 从手术或医院手术室的针头活检中获得患者衍生的肿瘤组织。
- 将肿瘤组织放入含有汉克斯平衡盐溶液（HBSS）溶液的100 mL容器中。
- 在实验室将组织转移到无菌罩（生物安全等级 2）。
- 尽快继续执行步骤 2。
注：出于安全原因，将已知艾滋病毒或乙型或丙型肝炎感染者排除在外。
2. 新鲜患者衍生肿瘤组织的处理
- 将组织放入含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 50 mL 管中。对于洗涤组织，在管中加入PBS，从管中丢弃PBS两次。
- 将组织转移到含有冰上PBS的培养皿中。
- 使用无菌钳子和剪刀，去除组织的坏死部分。在步骤 2.3 到 2.5 期间保持组织湿润和寒冷。对于针活检样品，跳过步骤 2.3 和 2.5，不要切割样品。
注：坏死组织在触摸时通常容易破裂。 - 将组织切成1毫米3块，用于手术肝脏植入。
- 在培养皿中将组织的其余部分切成 2 mm 的立方体。
- 将它们转移到一个1.7毫米的微管与4%的形式分析，到另一管基因组和蛋白酶分析。
- 将微管放入含有液氮的液氮罐中。将管转移到-80°C冷冻室永久存放。
注：从患者中取出样品到组织处理之间的时间不应超过 30 分钟。
3. 手术肝脏植入与患者衍生的肿瘤组织
- 用70%的乙醇喷洒进入引擎盖进行手术的所有物体。
注：这包括手术器械、加热垫和麻醉机。 - 测量棉签和织物板的重量。
- 将鼠标置于感应室中，用3~5%的子胶蒸发器麻醉小鼠。
- 一旦鼠标完全麻醉，将其放在加热垫上。将单体胶锥放在鼠标的鼻塞上，吸入1.5~3%的异常鲁兰，以维持麻醉。
注：在整个过程中，鼠标需要放在加热垫上。缺乏暖气可能导致体温过低。 - 当老鼠的脚被超细钳刺时，不反应确认适当的麻醉。
- 手术前，在侧翼使用27G针头在侧翼上注射丁丙诺啡（0.6毫克/千克）。
- 在腹部涂抹70%乙醇，向上和向下铺毛。展开毛皮后，确认左侧亚成本区域下方的皮肤更容易可视化，以便更容易切割。不要从腹部上掉下毛皮。
注：毛皮在手术后会隐藏切口部位，防止小鼠在手术后划伤切口。但是，您可以根据机构标准来割毛以防止切口部位的感染。 - 应用碘，让它被吸收到皮肤中。
- 在鼠标上放置一个2厘米孔的无菌手术窗帘。
- 用弯曲的超细钳提起腹部皮肤，用弯曲的剪刀做一个1厘米的横向左下部皮肤切口。
- 将弯曲的剪刀尖插入切口皮肤下方，稍微打开，将围肠从皮肤中分离出来。用封闭的刀片从切口中收回剪刀。
注：在鼠标内打开和关闭剪刀可能会导致损坏和出血。 - 找到围肠下的肝脏。通过围阴层确认深红色。
- 用弯曲的剪刀，在围肠内做一个1厘米的横向切口。如果腹托动脉从切削刃出血，立即停止烧灼的出血。
- 用弯曲的超细钳子抓住脂肪组织，将棉签的边缘插入左肝叶下方，然后用另一只手向下滚动拭子，将肝脏带出。
注：抓住脂肪组织对于防止脂肪组织粘在棉签上非常重要。 - 将肝脏外在棉签上，将肝脏放在无纺布吸收织物上。
注：织物板在稳定肝脏和吸收出血方面起着两个重要作用。 - 使用无菌的 11 号手术刀在切口中形成一个口袋，同时用棉签轻柔地按切口部位，使其宽度和深度为 5 mm。
- 刀片与肝脏表面平行插入，并水平切割。
- 用棉签按切口部位以阻止任何出血。
注：不要保持刀片垂直，否则您将突破肝脏，并伤害肝脏中间的大血管。
- 向上卷起棉签，打开切口部位，用弯曲的超细钳将1毫米3立方的肿瘤组织植入口袋。在反向旋转和按下时，缩回钳子，同时滚动棉签。
注：用棉签压压切口部位，同时缩回钳子有助于防止口袋内的肿瘤位移。 - 植入后，轻轻将棉签从切口部位取下。尽快继续步骤 3.19。
- 在切口部位放置一个可吸收的附中。
- 确认赫比其中大部分斯。如果出血继续，在切口部位添加更多止血。
- 用钳子（最好是钝端）将肝脏从织物片上剥下，并将肝脏放回腹腔。
- 使用 5-0 可吸收缝合，使用双连体缝合。
- 使用 5-0 可吸收缝合，缝合三连字。
注：三重结扎有助于防止手术切口脱血。 - 观察鼠标，直到完全清醒，并将其放回笼子里。
- 测量棉签和织物片的重量，在手术过程中出血量。在手术前将它们与原来的重量进行比较。在手术期间减少出血到小鼠循环血量的10%以下。
4. 培养的人类肝脏转移性乌韦瘤细胞系的收集和处理
- 准备培养的细胞。
- 使用单元格计数器收集单元格并计算单元格编号。
- 在15 mL管中为10.0 x 106个细胞制备适量的细胞悬浮液。
- 在室温下，在离心机中以 300 x g旋转管 5 分钟。
- 拆下 15 mL 管中的上清液。将细胞颗粒留在管的底部。
- 将 50 μL 的 RPMI 1640 介质加入 1.7 mL 管中。
- 用剪刀切割 200 μL 尖端的尖端，以扩大尖端开口。
- 使用带有切尖的移液器将 60 μL 的基底膜基质加入具有 RPMI 的 1.7 mL 管中。
- 在 1.7 mL 管中混合 RPMI 和基质。漩涡吧
- 将110 μL的混合物加入15 mL管中的细胞颗粒中。将细胞悬架转移到新的1.7 mL管中。
- 注射针头前，将管子放在冰上。
5. 培养的人类肝脏转移性黑色素瘤细胞系植入肝脏的手术针
- 按照步骤 3.1 到 3.15 中的上述协议进行操作。
- 用27G针的微注射器收集细胞悬浮液。
- 沿着肝脏表面插入针头，将针头的尖端推进 5 毫米深。
- 将20μL细胞悬浮液注入肝脏。
- 烧除肝脏的插入点，以防止注射的细胞渗出。确认赫比其中大部分斯。
- 按照步骤 3.21 到 3.24 中的上述协议进行操作。
6. CT 扫描
- 将鼠标放入处于唤醒状态的抑制器中。
- 用无菌酒精垫擦拭尾巴，以便进行消毒和血管化。
- 在1mL注射器上用27G针通过尾静脉注射100μL的CT造影剂。
- 在进行 CT 扫描之前，在注射后等待 4 小时。
注：它需要4小时，直到代理被肝Kupffer细胞占用。 - 注射后四小时，将肿瘤携带小鼠置于诱导室中，用3~5%蒸发的共二苯二苯对小鼠进行麻醉。
- 一旦小鼠完全麻醉，将其置于CT上的易感位置。将异常芦锥放在小鼠的鼻塞上，吸入1.5~3%的异常胶，以维持麻醉。
- 当老鼠的脚被超细钳刺时，不反应确认适当的麻醉。
- 进行 CT 扫描 15 分钟。
- 确保鼠标在 CT 扫描后完全唤醒，并将其放回笼子。
- 评估肿瘤的存在，测量CT图像上的肿瘤大小。
注：造影剂增强正常肝肿，使患者容易识别未增强的肿瘤。不要曲解胆囊和胃肿瘤。
7. 收获和加工组织
- 使用CO2对小鼠实施安乐死，然后用将食指和拇指放在头骨后面，然后通过尾巴底部拉身体，进行宫颈脱位。尽快继续步骤 7.2。
- 将鼠标置于苏皮位置，用 70% 的乙醇喷洒腹部。
- 使用无菌钳子和无菌剪刀在西风处理下进行3厘米横切口，以暴露腹部器官。
- 切除肿瘤组织，执行步骤 2.1 到 2.2。
- 在培养皿中将肿瘤的其余部分切成2毫米的立方体。
- 将它们转移到具有低温介质的低温管中，用于冷冻保存后重新植入。
- 将管子放入装有异丙醇的低温冷冻容器中。
- 将容器转移到 -80°C 冷冻室进行临时存放。请勿将装有冷冻介质的冷冻管直接放入液氮罐中。以-1°C/min的冷却速率缓慢冷冻，以保存肿瘤组织。
- 第二天，将管子转移到液氮罐中永久存放。
8. 重新植入
- 将管子冷冻在液氮罐中，直到准备植入组织。尽量减少组织接触室温，以保持活力，增加移植的机会。
- 在37°C水浴中解冻冷冻管。
- 执行步骤 2.2_2.4。
- 如步骤 3.1_3.24 所述，将解冻的肿瘤植入小鼠体内。
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Representative Results
手术正交植入采用肝囊法，可在六个月内将人肝转移性黑色素瘤肿瘤移植到小鼠肝脏，成功率高达80%。异种移植肿瘤在肝脏中作为无女儿结节的单独肿瘤移植（图1和图3A）。手术正交注射技术进入肝脏使用微针成功地移植培养人类肝脏转移性黑色素瘤细胞在肝脏在所有情况下（图2和图3B）。然而，有些病例在主肿瘤周围传播。造影剂在CT上检测肝脏中的肿瘤，包括1毫米大小的小肿瘤（图3B）。冷冻肿瘤的重新植入成功地在小鼠肝脏中建立了它们，成功率很高。冷冻保存后重新植入的异种移植肿瘤保留了原患者肿瘤和预冷冻保存肿瘤的特征。
图1：患者衍生的肿瘤异种小鼠模型通过手术正交肝植入。小鼠在肿瘤植入6个月后被安乐死。色素黑色肿瘤（黑色箭头）是乌韦黑色素瘤。肿瘤被移植在肝脏的左叶。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：肝正交人细胞系衍生肿瘤异种移植小鼠模型采用针注射方法。小鼠在肿瘤注射8周后被安乐死。色素黑色肿瘤（黑色箭头）是乌韦黑色素瘤。肿瘤被移植在肝脏的左叶。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：肝肿瘤在肝脏左叶的CT图像。肝肿瘤在增强的CT上检测，正常肝组织通过造影剂增强。白色箭头表示肝脏旁边的胃。（A） 图1所示的肿瘤（黑色箭头）。外科正交植入形成一个孤独的肿瘤。（B）图 2所示的肿瘤（黑色箭头）。针注射方法形成许多小肿瘤的集群。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：肝口袋方法的技术提示。（A-C）肝脏的左叶（白色箭头）可以通过 1 厘米切口使用棉签（黑色箭头）从腹部外露出。不需要伸缩器来扩大切口。（D） 棉签轻轻地压在切口上.它在手术刀（绿色箭头）切口后获得造节。（E） 棉签向上滚动（弯曲的红色箭头）。这解除肝气肿打开切口。肿瘤黄色箭头）通过超细钳（蓝色箭头）通过切口插入肝脏口袋。（F） 棉签向下滚动（弯曲的红色箭头），以防止口袋中插入的肿瘤退缩。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
目前的正交异种异种移植模型是劳动密集型的，耗时的，而且创建成本很高。正交肿瘤异种移植小鼠模型建立于20多年前的19，20，21。然而，这种技术是复杂的，需要使用特殊设备，如微针支架和6-0至8-0在显微镜下细缝合。肿瘤和正常的肝脏组织必须仔细缝合，以便缝合不会损坏脆弱的肝脏组织。传统技术导致并发症，如血肿和坏死22。最近，一种改进的技术被开发出来，以解决这些问题23。这种改良技术使用可吸收的止血材料，而不是缝合，以覆盖肝脏表面的肿瘤。然而，这种改良的方法不能完全覆盖肝肿大肿瘤。肿瘤的一部分暴露在外部。我们开发了一种外科正交植入技术——肝囊法——将肿瘤完全安置在18号肿瘤内。我们的方法在肝脏中制造口袋，为肿瘤提供自然环境。肝袋法比传统技术简单，使我们能够在手术开始几分钟内完成植入肝脏。这种方法导致肝脏形成一个孤独的肿瘤，不会触发转移，至少只要我们观察小鼠，而针注射单细胞悬浮液往往传播为肝内转移17。单独肿瘤更适合评估肿瘤生长，并且有助于评估药物试验的疗效。
与原来的肝袋法18相比，我们修改了方法，以增强植入技术。首先，在手术过程中不使用缩回器来最小化切口的大小。当切口较小时，我们可以缩短手术的缝纫时间。腹部有1厘米切口，我们可以很容易地用棉签将左叶带到外面（图4A-C）。其次，棉签在做肝袋后停止止回止回，打开肝袋，使肿瘤块插入，并将肿瘤块留在口袋中，而不会将肿瘤推回口袋（图4D- F）平均出血量大约小于小鼠循环血量的10%。出血减少为手术提供了极大的信心。第三，织物板可用于固定腹部外的肝瓣。肝叶粘在床单上，从而防止叶滑回腹部（图4C）。人们可以很容易用手术刀切割肝脏表面，并注射针头到肝脏表面。因此，脆弱的肝脏组织不会受伤。
我们提供了此方法的两个故障排除提示。首先，当使用小切口位时，有时左叶不可见。在这种情况下，左叶可能粘在隔膜上。在左叶和隔膜之间插入钝边钳，以剥离叶。其次，当肿瘤块被放在肝袋与钳子，肿瘤可以坚持在钳子和拉回它。在退去钳子时，用棉签按切口。这很好地防止肿瘤从口袋里脱位。
异种移植肿瘤被小鼠组织包围，即使它们是正射植入的。患者衍生肿瘤中的人类基质细胞不可避免地被小鼠基质细胞所取代。理想情况下，小鼠模型最好在肿瘤周围提供人体基质组织。奇美人化肝小鼠或人性化免疫小鼠模型将有助于研究乌韦黑色素瘤的移植，并评估药物代谢是否与人-肝或人免疫环境24、25相同。
正交肝肿瘤异种移植小鼠模型需要通过成像研究验证肿瘤的建立。市售的CT造影剂，为小鼠肝脏CT图像开发，允许在CT上检测内部肝肿瘤。造影剂特别增强CT上的正常肝脏。很容易区分肿瘤26的未增强位点。该剂在CT上检测主要肿瘤周围小于1毫米（子结节）的微小肿瘤。该剂可以被小鼠容忍，并使得定期监测肝肿瘤成为可能。该制剂将用于评估抗癌药物对肝局部异种移植肿瘤的疗效。
一般来说，建议将PDX模型保持在相对较低的通道数（小于10），以保存原始患者衍生肿瘤27、28、29的遗传和组织完整性。大多数研究人员避免制作PDX模型的多个段落来减少通道和动物的数量。一旦患者衍生的肿瘤暂时保存在冰柜中，我们就能够控制PDX模型在较低的通道数，而不会浪费小鼠。这称为生物银行战略。癌症生物库是维持肿瘤特征和减少小鼠数量28，30的合理方法。建立适当的生物库法可以调整PDX模型的供应，以满足患者的治疗计划或小鼠药物疗效试验。我们实现了冷冻肿瘤的重新植入，用于癌症生物库。我们希望这一成功能促进PDX平台在不久的将来的使用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Ohara、K.斋藤和太太郎审阅了手稿。作者承认福克斯大通癌症中心的Sato博士对这份手稿的编辑和英文协助进行了批判性评论。本文所述工作得到了邦尼·克罗尔研究基金、马克·文齐尔研究基金、托马斯·杰斐逊大学眼黑色素瘤研究基金、大阪社区基金会和大阪市JSPS KAKENHI赠款号JP 18K15596的支持。大学。A. Aplin博士实验室的研究得到了NIH资助R01 GM067893的支持。该项目还由院长的变革科学奖，托马斯杰斐逊大学方案倡议奖资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1x, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 mL TB syringe with 27 G needle | BD | 309623 | |
| 1.7 mL tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27 G needle | BD | 780301 | |
| 27 G needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µL micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µL micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μL tip |
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