Summary
Des modèles de souris de xénogreffe de xénogreffe de mélanome uastatique de foie humain orthotopic ont été créés utilisant des techniques orthotopic chirurgicales d'implantation orthotopic avec le morceau patient-dérivé de tumeur et les techniques d'injection d'aiguille avec les lignes humaines cultivées de cellules de mélanome uveal.
Abstract
Au cours des dernières décennies, les tumeurs xénogreffes dérivées du patient ou les lignées cellulaires humaines cultivées ont été de plus en plus reconnues comme des modèles plus représentatifs pour étudier les cancers humains chez les souris immunodéficientes que les cellules humaines établies traditionnelles. lignes in vitro. Récemment, des modèles orthotopiquement implantés de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) chez les souris ont été développés pour mieux reproduire des dispositifs des tumeurs patientes. On s'attend à ce qu'un modèle orthotopic de souris de xénogreffe de foie soit une plate-forme utile de recherche de cancer, fournissant des perspicacités dans la biologie de tumeur et la thérapie de drogue. Cependant, l'implantation orthotopic de tumeur de foie est généralement compliquée. Ici nous décrivons nos protocoles pour l'implantation orthotopic des tumeurs uvéal de mélanome uveal foie-métastatique patient-dérivées. Nous avons cultivé les lignées de cellules uvéales métastatiques de mélanome de foie humain dans les souris immunodéficientes. Les protocoles peuvent avoir comme conséquence des taux de succès technique uniformément élevés utilisant une technique orthotopic chirurgicale d'implantation avec des morceaux de tumeur uveal de mélanome patient-dérivée ou une technique d'injection d'aiguille avec la ligne humaine cultivée de cellules. Nous décrivons également des protocoles pour le balayage de CT pour détecter des tumeurs intérieures de foie et pour des techniques de ré-implantation utilisant des tumeurs cryoconservées pour réaliser le re-engraftment. Ensemble, ces protocoles fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles orthotopiques de souris de tumeur de foie du mélanome uvéal métastatique de foie dans la recherche translationnelle.
Introduction
Le mélanome uvéal est la tumeur maligne intraoculaire la plus commune parmi des adultes dans le monde occidental. Au cours des 50 dernières années, l'incidence du mélanome uvéal (5,1 cas par million) est restée stable aux États-Unis1,2. Le mélanome uvéal provient des mlanocytes dans l'iris, le corps ciliaire, ou la choroïde, et c'est une maladie extrêmement mortelle quand il développe la métatasie. Le taux de mortalité des patients présentant la métastase uvéal de mélanome était 80% à 1 an et 92% à 2 ans après diagnostic initial des métastases. Le temps entre le diagnostic des métastases et la mort est généralement court, moins de 6 mois, sans égard à la thérapie3,4. Le cancer se propage dans le sang et tend à métastaser principalement le foie (89-93%)4,5. Un modèle efficace de souris est urgent nécessaire pour davantage d'investigation du mélanome uvéal foie-métastatique. Pour la recherche translationnelle, il y a une demande claire pour produire un modèle métastatique de souris de mélanome métastatique foie-localisé.
On s'attend à ce que les modèles de souris de xénogreffe de tumeur patient-dérivé (PDX) fournissent des stratégies individualisées de médecine. Ces modèles pourraient être prédictifs des résultats cliniques, être utiles pour l'évaluation préclinique de drogue, et être employés pour des études biologiques des tumeurs6. Les modèles représentatifs de PDX sont des souris xénogreffes ectopiques implantées par tumeur, qui ont la tumeur aux emplacements sous-cutanés. La plupart des chercheurs peuvent faire la chirurgie pour l'implantation sous-cutanée sans pratique spéciale7,8. Ils peuvent également surveiller les tumeurs sous-cutanées facilement. Bien que les modèles sous-cutanés PDX est devenu populaire dans la phase de recherche, ils ont quelques obstacles à passer à l'utilisation pratique. L'implantation sous-cutanée force les tumeurs patient-dérivées à engraft à un microenvironnement différent de l'origine de tumeur, de sorte qu'elle mène à l'échec d'engraftment et à la croissance lente de tumeur 9,10,11, 12,13,14. L'engraftment orthotopic peut être une approche plus idéale et rationnelle pour un modèle de PDX parce qu'il emploie le même organe que la tumeur originale15,16.
Récemment, nous avons développé des protocoles pour les techniques orthotopic d'implantation chirurgicale des tumeurs uveal de mélanome et uvéal de foie-dérivées patient-dérivées et des techniques d'injection d'aiguille avec une ligne de cellules uvéal uveal de mélanome de foie-métastatique de culture dans NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris17,18. Les protocoles se traduisent par des taux de réussite technique toujours élevés. Nous avons également établi des techniques de balayage de CT qui sont utiles pour détecter des tumeurs intérieures de foie, et nous avons développé la ré-implantation des tumeurs cryopréservées dans la plate-forme de PDX. Nous avons constaté que les modèles de xénogreffe de tumeur de mélanome uvéal maintiennent les caractéristiques de la tumeur originale de foie de patient, y compris leurs dispositifs histopathologiques et moléculaires. Ensemble, ces techniques fournissent une meilleure plate-forme pour les modèles de tumeur orthotopic de foie pour le mélanome uvéal dans la recherche translationnelle.
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Protocol
Les patients inscrits à l'étude devraient fournir un consentement écrit permettant l'utilisation d'échantillons chirurgicaux jetés à des fins de recherche et d'études génétiques, selon un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel. Ce protocole a été réalisé dans le strict respect des recommandations du Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé et approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC).
1. Collection de tissu tumoral frais dérivé du patient
- Obtenir le tissu de tumeur patient-dérivé de la chirurgie ou d'une biopsie d'aiguille dans une salle d'opération d'hôpital.
- Mettre le tissu tumoral dans un récipient de 100 ml contenant la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks sur la glace.
- Transférer le tissu dans une hotte stérile (niveau de biosécurité 2) en laboratoire.
- Passez à l'étape 2 dès que possible.
REMARQUE: Pour des raisons de sécurité, excluez les patients atteints d'infections connues du VIH ou de l'hépatite B ou C.
2. Traitement du tissu tumoral frais dérivé du patient
- Mettre le tissu dans un tube de 50 ml contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) sur la glace. Pour laver le tissu, ajouter le PBS dans le tube et jeter le PBS du tube deux fois.
- Transférer le tissu dans un plat Petri contenant du PBS sur la glace.
- À l'aide de forceps stériles et de ciseaux, retirer les parties nécrotiques du tissu. Gardez le tissu humide et froid pendant les étapes 2.3 à 2.5. Pour les échantillons de biopsie à aiguilles, sautez les étapes 2.3 et 2.5 et ne coupez pas les échantillons.
REMARQUE: Le tissu nécrotique se brise souvent facilement lorsqu'il est touché. - Couper le tissu en cubes de 1 mm3 pour l'implantation chirurgicale du foie.
- Couper le reste du tissu en cubes de 2 mm dans le plat Petri.
- Transférez-les dans un microtube de 1,7 mm avec 4% de formaline pour l'analyse histologique et dans un autre tube pour l'analyse génomique et protéomique.
- Mettre les microtubes dans un bocal à azote liquide avec de l'azote liquide. Transférer les tubes dans un congélateur de -80 oC pour un stockage permanent.
REMARQUE: Le délai entre l'enlèvement de l'échantillon du patient et le traitement des tissus ne doit pas dépasser 30 min.
3. Implantation chirurgicale de foie avec le tissu de tumeur patient-dérivé
- Vaporiser tous les objets entrant dans le capot pour la chirurgie avec 70 % d'alcool éthylique.
REMARQUE: Cela comprend les instruments chirurgicaux, les coussins chauffants et les appareils d'anesthésie. - Mesurer le poids d'un coton-tige et d'une feuille de tissu.
- Anesthésiez une souris avec un vaporisateur d'isoflurane de 3 à 5 % en la plaçant dans la chambre d'induction.
- Une fois que la souris est entièrement anesthésiée, placez-la en position de supine sur un coussin chauffant. Placez le cône d'isoflurane sur le museau de la souris pour inhaler 1,5 à 3 % d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie.
REMARQUE: La souris doit être sur le coussin chauffant pendant toute la procédure. Le manque de chauffage peut causer l'hypothermie. - Confirmer une bonne anesthésie par aucune réaction lorsque le pied de la souris est piqué avec des forceps ultrafines.
- Injecter de la buprénorphine (0,6 mg/kg) sous-cutanée sur le flanc à l'aide d'une aiguille de 27 G sur une micro seringue avant la chirurgie.
- Appliquer 70% d'alcool éthylique sur l'abdomen et étendre la fourrure vers le haut et vers le bas. Après l'épandage de la fourrure, confirmer une visualisation plus facile de la peau en dessous de la zone sous-costale gauche pour une coupe plus facile. Ne pas raser la fourrure de l'abdomen.
REMARQUE: La fourrure cachera le site d'incision après chirurgie et empêchera la souris de gratter l'opération de poteau d'incision. Cependant, vous pouvez raser la fourrure pour prévenir l'infection du site d'incision selon les normes institutionnelles. - Appliquer l'iode et laisser être absorbé dans la peau.
- Placez un drapé chirurgical stérile avec un trou de 2 cm sur la souris.
- Soulevez la peau abdominale avec des forceps ultrafines incurvées et faites une incision de la peau subcostale gauche de 1 cm avec des ciseaux incurvés.
- Insérez la pointe des ciseaux incurvés sous la peau de l'incision et ouvrez-les légèrement pour séparer le péritoine de la peau. Retirez les ciseaux de l'incision avec des lames fermées.
REMARQUE: L'ouverture et la fermeture des ciseaux à l'intérieur de la souris peuvent causer des dommages et des saignements. - Localiser le foie sous le péritoine. Confirmer une couleur rougeâtre foncée à travers le péritoine.
- Avec des ciseaux incurvés, faire une incision transversale de 1 cm dans le péritoine. Si une artère péritonéale saigne du tranchant, arrêtez immédiatement le saignement par cautérisation.
- Prenez le tissu adipeux à l'aide de forceps ultrafins incurvés d'une main, insérez le bord d'un coton-tige sous le lobe du foie gauche et roulez l'écouvillon vers le bas avec l'autre main pour faire ressortir le foie.
REMARQUE: Saisir les tissus adipeux est important pour empêcher le tissu adipeux de coller à l'écouvillon de coton. - Extérisez le foie sur l'écouvillon de coton et placez le foie sur une feuille de tissu absorbante non tissée.
REMARQUE: La feuille de tissu joue deux rôles essentiels dans la stabilisation du foie et l'absorption de l'hémorragie. - Faire une incision de 5 mm de largeur et de profondeur à l'aide d'une lame stérile de scalpel no 11 pour former une poche dans le parenchyme tout en appuyant doucement sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton.
- Insérez la lame en parallèle avec la surface du foie et coupez horizontalement.
- Appuyez sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton pour arrêter toute hémorragie.
REMARQUE: Ne gardez pas la lame verticale, sinon vous briserez le foie et blesserez de grands vaisseaux au milieu du foie.
- Rouler l'écouvillon de coton vers le haut pour ouvrir le site d'incision et implanter un cube de 1 mm3 de tissu tumoral dans la poche avec des forceps ultrafines courbés. Retirez les forceps en roulant l'écouvillon de coton en rotation inverse et en appuyant vers le bas.
REMARQUE: Appuyer sur le site d'incision avec l'écouvillon de coton tout en rétractant les forceps aide à empêcher le déplacement de la tumeur à l'intérieur de la poche. - Retirez délicatement l'écouvillon de coton du site d'incision après l'implantation. Passez à l'étape 3.19 dès que possible.
- Mettez un hemostat absorbable sur le site d'incision.
- Confirmer l'hémostase. Si le saignement continue, ajouter plus d'hémostat sur le site d'incision.
- Épluchez le foie de la feuille de tissu avec des forceps (de préférence émoussés) et remettez le foie dans la cavité abdominale.
- Sutoétone de suture avec la ligature double utilisant la suture absorbable 5-0.
- Suturer la peau avec la triple ligature utilisant la suture absorbable 5-0.
REMARQUE: La triple ligature aide à prévenir la déhiscence chirurgicale d'incision. - Observez la souris jusqu'à ce qu'elle soit complètement éveillée et remettez-la dans la cage.
- Mesurer le poids de l'écouvillon de coton et de la feuille de tissu avec du sang pour le volume de saignement pendant la chirurgie. Comparez-les avec leur poids d'origine avant la chirurgie. Réduire les saignements pendant la chirurgie à moins de 10% du volume sanguin circulant chez la souris.
4. Collecte et traitement de la ligne de cellules de mélanome uvéal métastatique de foie humain cultivé
- Préparer les cellules cultivées.
- Recueillir les cellules et calculer le nombre de cellules à l'aide d'un compteur cellulaire.
- Préparer une quantité appropriée de suspension cellulaire pour 10,0 x 106 cellules dans un tube de 15 ml.
- Faire tourner le tube à 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse à température ambiante.
- Retirez le supernatant dans le tube de 15 ml. Laissez la pastille cellulaire au fond du tube.
- Ajouter 50 oL de rpMI 1640 milieu dans un tube de 1,7 ml.
- Couper la pointe d'une pointe de 200 l à l'aide de ciseaux pour agrandir l'ouverture de la pointe.
- Ajouter 60 l de matrice membranaire du sous-sol à l'aide d'une pipette avec la pointe coupée dans le tube de 1,7 ml qui a RPMI.
- Mélanger le RPMI et la matrice dans le tube de 1,7 ml. Vortex.c'est.
- Ajouter 110 l de mélange dans la pastille cellulaire dans le tube de 15 ml. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 1,7 ml.
- Gardez le tube sur la glace avant l'injection d'aiguille.
5. Implantation chirurgicale d'aiguille de culture humaine de foie Métastatique de mélanome uvéal ligne dans le foie
- Suivez le protocole ci-dessus des étapes 3.1 à 3.15.
- Recueillir la suspension cellulaire avec une microseringue avec une aiguille de 27 G.
- Insérez l'aiguille le long de la surface du foie et avancez la pointe de l'aiguille 5 mm plus profond.
- Injecter 20 ll de suspension cellulaire dans le foie.
- Cauteriser le point d'insertion du foie pour empêcher les cellules injectées de s'échapper. Confirmer l'hémostase.
- Suivez le protocole ci-dessus des étapes 3.21 à 3.24.
6. Tomodensitome
- Placez la souris dans un restrainer dans l'état éveillé.
- Essuyez la queue avec un tampon d'alcool stérile pour la désinfection et la vasodilatation.
- Injecter 100 l d'agent de contraste CT à travers la veine de la queue avec une aiguille de 27 G sur une seringue de 1 ml.
- Attendez 4 h après l'injection avant de passer la tomodensitome.
REMARQUE: Il faut 4 h jusqu'à ce que l'agent soit pris par les cellules Kupffer du foie. - Quatre heures après l'injection, anesthésier la souris porteuse de tumeur avec 3-5% d'isoflurane vaporisé en le plaçant dans la chambre d'induction.
- Une fois que la souris est entièrement anesthésiée, placez-la en position couchée sur un CT. Placez le cône d'isoflurane sur le museau de la souris pour inhaler 1,5 à 3 % d'isoflurane pour l'entretien de l'anesthésie.
- Confirmer une bonne anesthésie par aucune réaction lorsque le pied de la souris est piqué avec des forceps ultrafines.
- Faites une tomodensitome pendant 15 min.
- Assurez-vous que la souris jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillée après la tomodensitome et la remettre dans la cage.
- Évaluer l'existence de la tumeur et mesurer la taille de la tumeur sur les images CT.
REMARQUE: L'agent de contraste améliore le parenchyme normal de foie de sorte qu'il soit facile de reconnaître la tumeur non améliorée. Ne pas mal interpréter la vésicule biliaire et l'estomac comme tumeur.
7. Récolte et traitement des tissus
- Euthanasier les souris à l'aide du CO2 suivie d'une luxation cervicale en plaçant l'index et le pouce derrière le crâne et en tirant le corps par la base de la queue. Passez à l'étape 7.2 dès que possible.
- Placez la souris en position de supine et vaporisez l'abdomen avec 70% d'alcool éthylique.
- Utilisez des forceps stériles et des ciseaux stériles pour faire une incision transversale de 3 cm au-dessous du processus xiphoïde pour exposer les organes abdominaux.
- Accise le tissu tumoral et effectuez des étapes 2.1 à 2.2.
- Couper le reste de la tumeur en cubes de 2 mm dans le plat Petri.
- Transférez-les dans un tube cryogénique avec cryomédium pour la réimplantation après la cryoconservation.
- Mettre les tubes dans un récipient de congélation cryogénique rempli d'isopropanol.
- Transférer le contenant dans un congélateur de -80 oC pour un stockage temporaire. Ne mettez pas les cryotubes avec cryomedium directement dans un réservoir d'azote liquide. Congelez-les lentement à un taux de refroidissement de -1 oC/min pour préserver le tissu tumoral.
- Le lendemain, transférer les tubes dans un réservoir d'azote liquide pour un stockage permanent.
8. Réimplantation
- Gardez les tubes congelés dans un pot d'azote liquide avec de l'azote liquide jusqu'à ce qu'ils soient prêts à implanter le tissu. Réduire au minimum l'exposition du tissu à la température ambiante afin de maintenir la viabilité et d'augmenter les chances d'engraftment.
- Décongeler le tube cryoconservé dans un bain d'eau de 37 oC.
- Effectuer des étapes 2.2-2.4.
- Implanter la tumeur décongelée chez les souris comme décrit dans les étapes 3.1-3.24.
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Representative Results
L'implantation orthotopique chirurgicale utilisant la méthode de poche de foie peut transplanter la tumeur uveal de mélanome uastatique de foie humain dans le foie de souris avec un taux de succès élevé de 80% dans un délai de six mois. La tumeur de xénogreffe s'engrafte dans le foie comme tumeur solitaire sans nodules de fille (figure 1 et figure 3A). La technique d'injection orthotopique chirurgicale dans le foie à l'aide de microaiguilles a réussi à greffer des cellules de mélanome uvéal uvéal humain métastatique dans le foie dans tous les cas(figure 2 et figure 3B). Cependant, quelques cas ont eu la diffusion autour de la tumeur principale. L'agent de contraste détecte les tumeurs dans le foie sur CT, y compris les petites tumeurs de 1 mm de taille (Figure 3B). La réimplantation des tumeurs cryoconservées les a établies avec succès dans le foie de souris avec des taux de succès élevés. Les tumeurs de xénogreffe réimplantées après cryoconservation conservent les caractéristiques des tumeurs patientes originales et des tumeurs pré-cryoconservées.
Figure 1 : Modèle patient-dérivé de souris de xénogreffe de tumeur par l'implantation orthotopic chirurgicale de foie. La souris a été euthanasiée après 6 mois après implantation de tumeur. La tumeur noire pigmentée (flèche noire) est mélanome uvéal. La tumeur est greffée dans le lobe gauche du foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le modèle de souris de xénogreffe de tumeur orthotopic de ligne humaine de foie-dérivé de ligne utilisant la méthode d'injection d'aiguille. La souris a été euthanasiée 8 semaines après injection de tumeur. La tumeur noire pigmentée (flèche noire) est mélanome uvéal. La tumeur est greffée dans le lobe gauche du foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images de CT des tumeurs de foie dans le lobe gauche du foie. Des tumeurs de foie sont détectées sur le tissu normal amélioré de foie est augmenté par l'agent de contraste. Des flèches blanches indiquent l'estomac à côté du foie. (A) La tumeur (flèche noire) qui a été précédemment montrée dans la figure 1. L'implantation orthotopique chirurgicale forme une tumeur solitaire. (B) Les tumeurs (flèche noire) montrées précédemment dans la figure 2. Méthode d'injection d'aiguille forme un groupe de nombreuses petites tumeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Conseils techniques pour la méthode de poche de foie. (A-C) Le lobe gauche (flèches blanches) du foie peut être exposé hors de l'abdomen à l'aide d'un coton-tige (flèche noire) par une incision de 1 cm. Un rétracteur n'est pas nécessaire pour élargir l'incision. (D) L'écouvillon de coton presse doucement sur l'incision. Il obtient l'hémostase après avoir fait une incision par le scalpel (flèche verte). (E) L'écouvillon de coton roule vers le haut (flèche rouge courbée). Cela soulève le parenchyme du foie pour ouvrir l'incision. La flèche jaune tumorale) est insérée dans la poche du foie par l'incision par des forceps ultrafines (flèche bleue). (F) L'écouvillon de coton roule vers le bas (flèche rouge courbée) pour empêcher une tumeur insérée dans la poche de reculer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les modèles actuels de xénogreffe orthotopique sont laborieux, longs et coûteux à créer. Les modèles orthotopiques de souris de xénogreffe de tumeur pour le cancer du foie ont été établis il y a plus de deux décennies19,20,21. Cependant, cette technique est compliquée et nécessite l'utilisation d'équipements spéciaux, tels qu'un porte-aiguilles et 6-0 à 8-0 sutures fines au microscope. La tumeur et le tissu hépatique normal doivent être cousus soigneusement de sorte que la suture n'endommage pas le tissu hépatique fragile. Les techniques conventionnelles conduisent à des complications, telles que l'hématome et la nécrose22. Récemment, une technique modifiée a été développée pour résoudre ces problèmes23. Cette technique modifiée utilise des matériaux hémostatiques absorbables au lieu de suture pour couvrir la tumeur sur la surface du foie. Cependant, cette méthode modifiée ne couvre pas complètement la tumeur dans le parenchyme de foie. Une partie de la tumeur est exposée à l'extérieur. Nous avons développé une technique chirurgicale d'implantation orthotopic-la méthode de poche de foie-pour loger la tumeur entièrement à l'intérieur du parenchyme18. Notre méthode fait une poche dans le foie pour fournir un environnement naturel pour les tumeurs. La méthode de poche de foie est plus simple que la technique conventionnelle, nous permettant de finir l'implantation dans le foie dans quelques minutes à partir du début de l'opération. Cette méthode entraîne la formation d'une tumeur solitaire dans le foie et ne déclenche pas de métastases, du moins aussi longtemps que nous avons observé les souris, tandis que l'injection d'aiguille d'une suspension de cellule unique tend à se diffuser comme métastases intra-hépatiques17. Une tumeur solitaire est plus appropriée pour évaluer la croissance de tumeur et serait utile pour évaluer l'efficacité dans un essai de drogue.
Par rapport à la méthode originale de poche de foie18,nous avons modifié nos méthodes pour améliorer des techniques d'implantation. Tout d'abord, un rétracteur n'a pas été utilisé pendant la chirurgie pour minimiser la taille de l'incision. Lorsque l'incision est plus petite, nous pouvons raccourcir le temps de couture en chirurgie. Avec une incision de 1 cm dans l'abdomen, nous pouvons facilement apporter le lobe gauche à l'extérieur avec un coton-tige (Figure 4A-C). Deuxièmement, un coton-tige joue trois rôles importants en arrêtant l'hémostase après avoir fait la poche du foie, en ouvrant la poche du foie pour être en mesure d'insérer un morceau de tumeur et en conservant le morceau de tumeur dans la poche sans repousser la tumeur(figure 4D- F). Le volume moyen de saignement était approximativement moins de 10% du volume de sang circulant chez les souris. Moins de saignements fourni une grande confiance dans la chirurgie. Troisièmement, une feuille de tissu est utile pour fixer le lobe du foie à l'extérieur de l'abdomen. Le lobe du foie colle à la feuille et ainsi il empêche le lobe de glisser de nouveau dans l'abdomen (Figure 4C). On peut facilement couper la surface du foie avec un scalpel et injecter une aiguille à la surface du foie. Par conséquent, les tissus hépatiques fragiles ne sont pas blessés.
Nous présentons ont deux conseils de dépannage pour cette méthode. Tout d'abord, lorsqu'un petit site d'incision est utilisé, parfois un lobe gauche n'est pas visible. Dans cette situation, le lobe gauche est susceptible de coller au diaphragme. Insérez des forceps émoussés entre le lobe gauche et le diaphragme pour éplucher le lobe. Deuxièmement, quand un morceau de tumeur est placé dans la poche de foie avec des forceps, la tumeur peut coller aux forceps et tirer en arrière avec elle. Appuyez sur l'incision à l'œuvre avec un coton-tige tout en retirant les forceps. Cela fonctionne bien pour empêcher la dislocation de la tumeur de la poche.
Les tumeurs de Xénogreffe sont entourées par le tissu de souris, même si elles sont orthotopiquement implantées. Les cellules stromales humaines dans les tumeurs patient-dérivées sont inévitablement remplacées par des cellules stromales de souris. Idéalement, le modèle de souris avait mieux fournir le tissu stromal humain autour des tumeurs. La souris de foie humanisée de chimérique ou les modèles humanisés de souris immunitaires serait utile pour étudier l'engraftment du mélanome uvéal et pour évaluer si le métabolisme de drogue est le même qu'un environnement humain-foie ou humain-immune24,25.
Les modèles orthotopiques de souris de souris de tumeur de foie exigent la vérification de l'établissement de tumeur avec des études de formation image. L'agent de contraste de CT disponible dans le commerce, développé pour des images de CT de foie de souris, permet la détection des tumeurs intérieures de foie dans l'état vivant sur CT. L'agent de contraste améliore spécifiquement le foie normal sur le CT. Il est facile de distinguer le site non amélioré de la tumeur26. L'agent détecte les tumeurs minuscules moins de 1 mm (nodules de fille) autour des tumeurs principales sur CT. L'agent peut être toléré par la souris, et permet de surveiller les tumeurs du foie périodiquement. L'agent serait employé pour évaluer l'efficacité des drogues anticancéreuses contre les tumeurs de xénogreffe foie-localisées.
Généralement, il est recommandé de maintenir des modèles de PDX à un nombre relativement bas de passage (moins de 10) pour conserver l'intégrité génétique et histologique de la tumeur patient-dérivée originale27,28,29. La plupart des chercheurs s'abstiennent de faire plusieurs passages des modèles PDX pour réduire le nombre de passages et d'animaux. Une fois que les tumeurs dérivées du patient sont temporairement conservées dans un congélateur, nous sommes en mesure de contrôler les modèles PDX à un nombre de passage inférieur sans gaspiller les souris. C'est ce qu'on appelle la stratégie de biobanque. Une biobanque de cancer est une approche rationnelle pour maintenir des caractéristiques de tumeur et pour réduire le nombre de souris28,30. L'établissement d'une méthode de biobanque appropriée peut ajuster l'offre de modèles PDX pour répondre au plan de traitement du patient ou à un essai d'efficacité de médicament de souris à l'avenir. Nous avons réalisé la réimplantation des tumeurs cryoconservées pour la biobanque de cancer. Nous espérons que ce succès facilitera l'utilisation de la plate-forme PDX dans un proche avenir.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à M. Ohara, K. Saito et M. Terai d'avoir examiné le manuscrit. Les auteurs reconnaissent l'examen critique pour l'aide éditoriale et anglaise de ce manuscrit par le Dr R. Sato au Fox Chase Cancer Center. Les travaux décrits ci-contre ont été soutenus par le Bonnie Kroll Research Fund, le Mark Weinzierl Research Fund, le Eye Melanoma Research Fund de l'Université Thomas Jefferson, la Osaka Community Foundation et le JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 à Osaka City Université. Les études menées dans le laboratoire du Dr A. Aplin ont été appuyées par la subvention des NIH R01 GM067893. Ce projet a également été financé par un Dean's Transformative Science Award, un Thomas Jefferson University Programmatic Initiative Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1x, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 mL TB syringe with 27 G needle | BD | 309623 | |
| 1.7 mL tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27 G needle | BD | 780301 | |
| 27 G needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µL micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µL micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μL tip |
References
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