Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

אורתופון האדם גרורות הכבד uveal מלנומה מבע מודלים העכבר נוצרו באמצעות שיטות כירורגי אורתוקפית עם קטע הגידול המטופל נגזר וטכניקות הזרקת מחט עם הגוף האנושי תרבותי שורות מלנומה.

Abstract

בעשורים האחרונים, תת-עורי מושתל החולה הנגזר גידולים מבע או שורות התאים האנושיים האדם מוכר יותר ויותר כמודלים מייצגים יותר ללמוד סרטן האדם עכברים חיסוני מאשר תא אנושי מסורתי הוקמה קווי מבחנה לאחרונה, אורתולמריחה על החולה מושתל הגידול מבע (pdx) מודלים בעכברים פותחו כדי לשכפל יותר תכונות של גידולים החולה. הכבד אורתובסיס מודל העכבר מקבל השתל צפוי להיות פלטפורמת מחקר שימושי לסרטן, מתן תובנות לתוך ביולוגיה של הגידול וטיפול בסמים. אולם, השתלת הגידול אורתוטופית מסובכת בדרך כלל. כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים שלנו עבור השתלת הנושא האורתודפית של החולה-נגזר הכבד-מלנומה וגרורתית גידולים בסרטן. אנחנו מתורבתים האדם מתורבת uveal מלנומה מסרטן קווי לתוך עכברים חיסוני. הפרוטוקולים יכולים לגרום בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה באמצעות טכניקה השרשה כירורגית אורתודופית עם נתחי החולה הנגזר מלנומה סרטן או טכניקה הזרקת מחט עם קו הגוף האנושי מתורבת. אנו גם לתאר פרוטוקולים עבור סריקת CT כדי לזהות גידולים בכבד הפנים לבין טכניקות מחדש השרשה באמצעות גידולים קריואופרשמורות כדי להשיג מחדש. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים של העכבר הגידול אורתופפית של מלנומה גרורתית בכבד במחקר טרנסלtional.

Introduction

מלנומה uveal היא הגידול הנפוץ ביותר התוך העינית ממאיר בקרב מבוגרים בעולם המערבי. במהלך 50 השנים האחרונות, השכיחות של מלנומה uveal (5.1 מקרים למיליון) נשאר יציב בארצות הברית1,2. מלנומה uveal נובע מלנוציטים ב איריס, גוף סיליארי, או choroid, וזה מחלה קטלנית ביותר כאשר הוא מפתח גרורות. שיעור התמותה של חולים עם גרורות מלנומה uveal היה 80% בשנה 1 ו 92% ב 2 שנים לאחר האבחנה הראשונית של גרורות. הזמן בין האבחנה של גרורות ומוות הוא בדרך כלל קצר, פחות מ 6 חודשים, בלי להתייחס לטיפול3,4. הסרטן מתפשט דרך הדם ונוטה להיות גרורות נגד הכבד (89-93%)4,5. מודל העכבר האפקטיבי הוא הצורך בדחיפות לחקירה נוספת של מלנומה הכבד-גרורתי מסרטן. עבור מחקר translational, יש דרישה ברורה כדי ליצור מודל העכבר מלנומה גרורתית מסרטן הכבד uveal.

החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) מודלים העכבר צפויים לספק אסטרטגיות תרופות מותאמת אישית. מודלים אלה עשויים להיות ניבוי של תוצאות קליניות, להיות שימושי עבור הערכת תרופות טרום קלינית, ולשמש למחקרים ביולוגיים של גידולים6. הנציג pdx מודלים הם למריחה על הגידול עכברים מבע, אשר יש גידול באתרים תת עורית. רוב החוקרים יכולים לעשות ניתוח להשתלה תת עורית ללא אימון מיוחד7,8. הם יכולים גם לפקח על גידולים תת עורית בקלות. למרות מודלים PDX תת עורית הפך פופולרי בשלב המחקר, יש להם כמה מכשולים במעבר לשימוש מעשי. השרשה תת-עורית כוחות החולה-נגזר גידולים לתוך מיקרופט בסביבה שונה ממקור הגידול, כך שהוא מוביל לכשל בתיאום וצמיחה איטית הגידול 9,10,11, .12,13,14 אורתופפית מהווה גישה אידיאלית ורציונלית לדגם pdx, משום שהוא משתמש באותו איבר כמו הגידול המקורי15,16.

לאחרונה, פיתחנו פרוטוקולים עבור טכניקות השרשה כירורגי השתלת החולה-נגזר בכבד-מלנומה בסרטן ושיטות הזרקת מחט טכניקות עם הגוף האנושי-גרורתי בכבד האדם מלנומה ומסרטן קו בהנהון. Cg-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg) עכברים17,18. הפרוטוקולים כתוצאה בעקביות שיעורי הצלחה טכנית גבוהה. כמו כן הקמנו CT סריקת טכניקות שימושיות כדי לזהות גידולים בכבד הפנים, ופיתחנו מחדש השרשה של גידולים בתוך פלטפורמת PDX. מצאנו כי uveal מלנומה גידול מודלים מבע לשמור על המאפיינים של גידול בכבד החולה המקורי, כולל תכונות histopathological ומולקולרית שלהם. יחד, טכניקות אלה מספקים פלטפורמה טובה יותר עבור מודלים הגידול הכבד הנושא עבור מלנומה uveal במחקר טרנסלtional.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

חולים הרשומים במחקר צריך לספק הסכמה בכתב המאפשר את השימוש של דגימות כירורגי שנמחקו למטרות מחקר ומחקרים גנטיים, על פי הלוח סקירה מוסדית מאושר פרוטוקול. פרוטוקול זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות ומאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC).

1. אוסף של מטופל טרי- רקמת הגידול נגזר

  1. השג רקמת סרטן נגזר החולה מהניתוח או ביופסיה מחט בחדר הניתוח של בית החולים.
  2. לשים את רקמת הגידול במיכל 100 mL המכיל הנקס ' מאוזן תמיסת מלח (HBSS) פתרון על קרח.
  3. להעביר את הרקמה לתוך מכסה סטרילי (Biosafety טיחות רמה 2) במעבדה.
  4. . המשך לשלב 2 בהקדם האפשרי
    הערה: מטעמי בטיחות, לא לכלול חולים עם HIV ידוע או צהבת B או C זיהומים.

2. עיבוד של מטופל טרי-רקמת הגידול נגזר

  1. שים את הרקמה בשפופרת 50 mL המכילה מלוחים מואגור פוספט (PBS) על קרח. כדי לשטוף את הרקמה, להוסיף PBS בצינור ולהיפטר PBS מהצינור פעמיים.
  2. העבירו את הרקמה לצלוחית פטרי המכילה PBS על הקרח.
  3. באמצעות מלקחיים ומספריים סטרילי, להסיר את החלקים נמק של הרקמה. השאר את הרקמה לחה וקרה במהלך השלבים 2.3 עד 2.5. עבור דגימות ביופסיה מחט, לדלג על צעד 2.3 ו 2.5, ואל תחתוך את הדגימות.
    הערה: רקמת הנקרוטיק מתפרקת לעתים קרובות בקלות כאשר היא נוגעת.
  4. חותכים את הרקמה לתוך 1 מ"מ3 קוביות עבור השתלת כבד כירורגי.
  5. חותכים את שאר הרקמה לקוביות של 2 מ"מ בצלחת פטרי.
  6. להעביר אותם 1.7 מ"מ microtube עם 4% פורמלין ניתוח היסטולוגית לצינור אחר עבור הניתוח גנומית ופרוטמית אחרת.
  7. שימו את המיקרוצינוריות בצנצנת חנקן נוזלי עם חנקן נוזלי. העבר את הצינורות ל-80 מקפיא ° c לאחסון קבוע.
    הערה: הזמן בין הסרת לדוגמה של המטופל ועיבוד רקמות לא יעלה על 30 דקות.

3. השתלת כבד כירורגי עם החולה-רקמת הגידול נגזר

  1. רסס את כל החפצים שמגיעים לשכונה לניתוח עם 70% אתיל אלכוהול.
    הערה: הדבר כולל כלי ניתוח, רפידות חימום ומכונות הרדמה.
  2. למדוד את המשקל של ספוגית כותנה סדין בד.
  3. באמצעות הצבת אותו בחדר האינדוקציה, יש להניח עכבר עם 3 – 5% מכשיר אידוי.
  4. לאחר העכבר מורדם לחלוטין, למקם אותו במיקום פרקדן על כרית חימום. הניחו את הקונוס של העכבר על חוטם העכברים כדי לשאוף 1.5 – 3% איזוofלשמירה על ההרדמה.
    הערה: העכבר צריך להיות על כרית החימום במהלך ההליך כולו. היעדר חימום עלול לגרום להיפותרמיה.
  5. לאשר הרדמה נכונה על ידי תגובה לא כאשר הרגל של העכבר הוא נדקר עם מלקחיים ultrafine.
  6. הכנס בופרנורפין (0.6 מ"ג/ק"ג) תת-עורי על הצלע באמצעות מחט של 27 גרם על מזרק מיקרו לפני הניתוח.
  7. החל 70% אתיל אלכוהול לבטן ופזר את הפרווה כלפי מעלה וכלפי מטה. לאחר הפצת הפרווה, לאשר הדמיה קלה יותר של העור מתחת לאזור subcostal שמאל לחיתוך קל יותר. אל תגלח את הפרווה מהבטן.
    הערה: הפרווה תסתיר את האתר החתך לאחר הניתוח ולמנוע את העכבר מגרד את הפעולה לאחר החתך. עם זאת, אתה יכול לגלח את הפרווה כדי למנוע זיהום של אתר החתך בהתאם לסטנדרטים מוסדיים.
  8. למרוח יוד ולתת לו להיקלט לתוך העור.
  9. מניחים לעטוף כירורגי סטרילי עם חור 2 ס מ על העכבר.
  10. מתיחת עור הבטן עם מלקחיים מעוקל ultrafine ולעשות 1 ס מ רוחב רוחבי שמאל חתך העור עם מספריים מעוקלים.
  11. הכנס את קצה המספריים העקומים מתחת לעור החתך ופתח אותם מעט כדי להפריד את הצפק מהעור. למשוך את המספריים מן החתך עם להבים סגורים.
    הערה: פתיחה וסגירה של מספריים בתוך העכבר יכול לגרום לנזק ודימום.
  12. . תאתר את הכבד מתחת לצפק אשר צבע אדמדם כהה דרך צפק.
  13. עם מספריים עקומים, לעשות חתך רוחב 1 ס מ בצפק. אם עורק הצפק מדמם מהקצה החדשני, מייד לעצור את הדימום עם הקאטרי.
  14. לתפוס רקמת שומן באמצעות מלקחיים מעוקל ultrafine עם יד אחת, להכניס את הקצה של מספוגית כותנה מתחת האונה השמאלית הכבד לגלגל את הספוגית כלפי מטה עם היד השנייה כדי להוציא את הכבד.
    הערה: רקמת שומן תופס חשוב לשמור על רקמת השומן לדבוק ספוגית כותנה.
  15. לנקות את הכבד על משטח הכותנה ולהניח את הכבד על גיליון בד סופג שאינו ארוג.
    הערה: הסדין בד משחק שני תפקידים חיוניים בייצוב הכבד וקליטת דימום.
  16. לעשות חתך 5 מ"מ ברוחב ועומק באמצעות להב סטרילי No. 11 אזמל ליצור כיס בתוך הכימומה בזמן לחיצה בעדינות על אתר החתך עם ספוגית כותנה.
    1. הכנס את הלהב במקביל עם פני השטח של הכבד לחתוך אופקית.
    2. לחצו על החתך עם משטח כותנה כדי לעצור שטף דם.
      הערה: אין לשמור על הלהב אנכית, אחרת תוכלו לפרוץ את הכבד ולפגוע בכלים גדולים באמצע הכבד.
  17. לגלגל את משטח הכותנה כלפי מעלה כדי לפתוח את האתר החתך והשתל 1 מ"מ3 קוביה של רקמת הגידול לתוך הכיס עם מלקחיים באולטרסאונד מעוקל. למשוך את מלקחיים תוך כדי לגלגל את הכותנה בסיבוב הפוך לוחץ למטה.
    הערה: לחיצה על האתר החתך עם ספוגית כותנה תוך כדי לעצור את מלקחיים מסייע למנוע עקירה של הגידול בתוך הכיס.
  18. בעדינות לקחת את הכותנה לנקות את האתר החתך לאחר השרשה. . המשך לשלב 3.19 בהקדם האפשרי
  19. שימו השמת שנספג. באתר החתך
  20. . תאשר הומוסטזיס אם הדימום ממשיך, הוסיפו. עוד הדימומים באתר החתך
  21. לקלף את הכבד את הסדין בד עם מלקחיים (רצוי קהה-הסתיים) ולשים את הכבד בחזרה לחלל הבטן.
  22. תפר צפק עם ליגטורה כפולה באמצעות תפר שנספג 5-0.
  23. תפר עור עם ליגטורה משולשת באמצעות תפר 5-0.
    הערה: הקשירה המשולשת מסייעת. למנוע חתך ניתוחי
  24. להתבונן בעכבר עד הערה לגמרי ולשים אותו בחזרה בכלוב.
  25. למדוד את המשקל של הספוגית כותנה ואת הסדין בד עם דם על הנפח דימום במהלך הניתוח. להשוות אותם עם משקולות המקורי שלהם לפני הניתוח. להפחית את הדימום במהלך הניתוח פחות מ 10% של במחזור נפח הדם בעכבר.

4. איסוף ועיבוד של מתורבת שורה של הכבד האנושי מסרטן קו מלנומה

  1. הכן תאים מתורבתים.
  2. אסוף תאים וחשב את מספר התא באמצעות מונה תאים.
  3. הכן כמות מתאימה של השעיית תאים עבור 10.0 x 106 תאים בשפופרת של 15 מ ל.
  4. ספין הצינור ב 300 x g עבור 5 דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את הסופרנטנט. בצינור 15 מ ל תשאיר את הגלולה הסלולרית. בתחתית השפופרת
  6. הוסף 50 μL של RPMI 1640 בינונית לתוך שפופרת של 1.7 mL.
  7. גזור את הקצה של קצה 200 μL עם מספריים כדי להגדיל את פתיחת הקצה.
  8. הוסף 60 μL של מטריצת קרום המרתף באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך לתוך הצינור 1.7 mL כי יש RPMI.
  9. לערבב RPMI ומטריצה בצינור 1.7 mL. . מערבולת את זה
  10. הוסף 110 μL של התערובת לתוך הגלולה התא בצינור 15 מ"ל. להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חדש 1.7 mL.
  11. שמור את השפופרת על הקרח לפני הזרקת המחט.

5. השתלת מחט כירורגית של מתורבת לכבד האדם מסרטן מלנומה קו לתוך הכבד

  1. בצע את הפרוטוקול הנ ל משלבים 3.1 עד 3.15.
  2. לאסוף את ההשעיה התא עם מיקרומזרק עם המחט 27 G.
  3. הכנס את המחט לאורך המשטח של הכבד ולקדם את קצה המחט 5 מ"מ עמוק יותר.
  4. הכנס 20 μL של תא הבולם לתוך הכבד.
  5. לצרוב את נקודת ההכנסה של הכבד כדי למנוע את התאים מוזרק דולף החוצה. . תאשר הומוסטזיס
  6. בצע את הפרוטוקול הנ ל משלבים 3.21 עד 3.24.

6. סריקת CT

  1. מניחים את העכבר לתוך הרסן במצב ער.
  2. נגב את הזנב עם כרית אלכוהול סטרילית לחיטוי והסנה.
  3. הכנס 100 μL של סוכן ניגודיות CT דרך הווריד הזנב עם מחט של 27 גרם על מזרק 1 מ ל.
  4. המתן 4 שעות לאחר ההזרקה לפני נטילת סריקת CT.
    הערה: זה לוקח 4 שעות עד שהסוכן. נלקח מתאי הכבד
  5. ארבע שעות לאחר ההזרקה, מורדם את העכבר נושאת הגידול עם 3 – 5% מתאדה isofלאנה על ידי הצבת אותו בחדר אינדוקציה.
  6. ברגע שהעכבר מורדם לגמרי, הצב אותו בתנוחה הנוטה ב-CT. מניחים את החרוט על החרטום של העכבר כדי לשאוף 1.5 – 3% isoffor תחזוקה של הרדמה.
  7. לאשר הרדמה נכונה על ידי תגובה לא כאשר הרגל של העכבר הוא נדקר עם מלקחיים ultrafine.
  8. . תעשה סריקת סי. טי. במשך 15 דקות
  9. ודא כי העכבר עד שהוא התעורר במלואו לאחר סריקת ה-CT והחזר אותו לכלוב.
  10. הערכה לקיומו של הגידול ולמדוד את גודל הגידול על תמונות CT.
    הערה: הסוכן ניגודיות מגביר את הכבד הרגיל מכימומה, כך שקל לזהות גידול בלתי משופר. לא לפרש את הכיס המרה ואת הבטן כמו גידול.

7. קציר ועיבוד רקמות

  1. עכברים המתת חסד באמצעות CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם על ידי הצבת אצבע המפתח ואת האגודל מאחורי הגולגולת ומושך את הגוף על ידי בסיס הזנב. . המשך לשלב 7.2 בהקדם האפשרי
  2. מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הבטן עם 70% אתיל אלכוהול.
  3. השתמש מלקחיים סטרילי מספריים סטרילי לעשות חתך רוחבי 3 ס מ מתחת לתהליך xiphoid לחשוף את איברי הבטן.
  4. בלו את רקמת הגידול ולבצע שלבים 2.1 כדי 2.2.
  5. חותכים את שאר הגידול לתוך 2 מילימטר קוביות בצלחת פטרי.
  6. להעביר אותם צינור הקפאה עם cryomedium עבור השרשה מחדש לאחר הקפאת ההזמנה.
  7. שימו את הצינורות במיכל הקפאה מקפיא מלא באיזופנול.
  8. העבירו את המכולה למקפיא של 80 ° c לאחסון זמני. לא לשים את הקריוצינורות עם cryomedium ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי. להקפיא אותם לאט בקצב קירור של 1 ° צ'/מינימום כדי לשמר את רקמת הגידול.
  9. ביום למחרת, להעביר את הצינורות לתוך מיכל חנקן נוזלי עבור אחסון קבוע.

8. השרשה מחדש

  1. לשמור על הצינורות קפואים צנצנת חנקן נוזלי עם חנקן נוזלי עד מוכן רקמת השתל. מזער את חשיפת הרקמה לטמפרטורת החדר כדי לשמור על יכולת הקיום ולשפר את סיכויי החרט.
  2. הפשרת שפופרת הקפאה באמבט מים ב37 ° c.
  3. בצע את שלבים 2.2 – 2.4.
  4. שתל את הגידול המושתל לתוך עכברים כמתואר בשלבים 3.1 – 3.24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתלת כירורגית אורתוטופית באמצעות שיטת כיס הכבד יכולה להשתיל גידול מלנומה גרורתית של הכבד האנושי לתוך הכבד של העכבר עם שיעור הצלחה גבוהה של 80% בתוך שישה חודשים. הגידול של מבע מעפיב הכבד כגידול בודד ללא נודולים בת (איור 1 ואיור 3a). ההזרקה כירורגית הזרקת הטכניקה לתוך הכבד באמצעות מיקרוסויונלס בהצלחה חרט מנופה של האדם האנושי-גרורתי הכבד מלנומה בתאי הסרטן בכבד בכל המקרים (איור 2 ואיור 3b). עם זאת, מקרים מסוימים הפצתו סביב הגידול העיקרי. הסוכן ניגודיות מזהה גידולים בכבד ב-CT, כולל גידולים קטנים של גודל 1 מ"מ (איור 3B). Re-השרשה של גידולים הקריואופרסטית בהצלחה הקימו אותם בכבד העכבר עם שיעורי הצלחה גבוהה. השתלת מחדש גידולים מבע לאחר הקפאה קריוגנית זמנות לשמור על המאפיינים של גידולים החולה המקורי וגידולים טרום הקפאת השמורים.

Figure 1
איור 1: החולה-נגזר הגידול מודל העכבר של השתל על ידי כירורגית אורתוקפית הכבד השתלת. העכבר הורמתת לאחר 6 חודשים לאחר השתלת הגידול. הגידול השחור פיגמנט (חץ שחור) הוא מלנומה מסרטן. הגידול ממוקם מנופה באונה השמאלית של הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כבד אורתוקמד תא האדם קו הנגזר הגידול מבע מודל העכבר באמצעות שיטת הזרקת מחט. העכבר הורדמים 8 שבועות לאחר הזרקת הגידול. הגידול השחור פיגמנט (חץ שחור) הוא מלנומה מסרטן. הגידול ממוקם מנופה באונה השמאלית של הכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות CT של גידולים בכבד באונה השמאלית של הכבד. גידולים בכבד מזוהים ב-CT משופר. רקמת הכבד נורמלי מוגברת על ידי סוכן ניגודיות. חיצים לבנים מציינים את הבטן ליד הכבד. (א) הגידול (חץ שחור) שהוצג בעבר באיור 1. השרשה כירורגית. יוצרת גידול בודד (ב) הגידולים (חץ שחור) המוצגים בעבר באיור 2. הזרקת מחט שיטה צורות מקבץ של גידולים קטנים רבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: טיפים טכניים לשיטת כיס הכבד. (A-C) האונה השמאלית (חצים לבנים) של הכבד ניתן לחשוף מתוך הבטן באמצעות ספוגית כותנה (חץ שחור) באמצעות חתך 1 ס מ. . מפסק אינו נדרש להרחיב את החתך (ד) כותנה ספוגית לוחץ על החתך ברכות. הוא מקבל הומוקיפאון לאחר ביצוע חתך על ידי אזמל (החץ הירוק). (ה) ספוגית כותנה מתגלגל כלפי מעלה (חץ אדום מעוקל). זה מרים את הכבד בתור. לפתוח את החתך החץ הצהוב הגידול) מוכנס לכיס הכבד דרך החתך על ידי מלקחיים ultrafine (חץ כחול). (ו) מנגב כותנה מתגלגל כלפי מטה (חץ אדום מעוקל) כדי למנוע גידול מוסף בכיס לסגת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדגמים הנוכחיים של מודלים של השתל הנוכחי הינם עתירי עבודה, זמן רב, ויקרים ליצירה. אורתובנושא הגידול מבע מודלים עכבר לסרטן הכבד הוקמו לפני יותר משני עשורים19,20,21. עם זאת, טכניקה זו היא מסובכת ודורשת שימוש בציוד מיוחד, כגון בעל מחט מיקרו ו 6-0 כדי 8-0 תפרים משובחים מתחת למיקרוסקופ. סרטן ורקמות הכבד הנורמלי חייב להיות תפור בזהירות כך תפר אינו פוגע רקמת הכבד שברירי. הטכניקות הקונבנציונליות מובילות לסיבוכים, כגון שטף דם ונמק22. לאחרונה פותחה טכניקה ששונתה כדי לפתור בעיות אלה23. טכניקה מותאמת זו משתמשת בחומרי ספיגה הומוסטטיים במקום תפר כדי לכסות את הגידול על משטח הכבד. עם זאת, שיטה זו שונה לא לחלוטין לכסות את הגידול בתוך הכבד מכסה. . חלק מהגידול נחשף לבחוץ פיתחנו שיטת השתלת כירורגית אורתוטופית-שיטת כיס הכבד-כדי לבית את הגידול לחלוטין בתוך ה-מכימומה18. השיטה שלנו עושה כיס בכבד כדי לספק סביבה טבעית עבור גידולים. שיטת כיס הכבד היא פשוטה יותר מאשר הטכניקה המקובלת, המאפשרת לנו לסיים את השרשה לתוך הכבד תוך מספר דקות מתחילת המבצע. שיטה זו יוצרת היווצרות של גידול בודד בכבד ואינו מפעיל גרורות, לפחות כל עוד הבחנו בעכברים, בעוד הזרקת מחט של השעיית תא בודד נוטה להפיץ כגרורות פנים-כבד17. גידול בודד מתאים יותר כדי להעריך את הצמיחה הגידול יהיה שימושי כדי להעריך את היעילות בניסוי התרופה.

לעומת שיטת כיס הכבד המקורי18, שינו את השיטות שלנו כדי לשפר את הטכניקות של השרשה. ראשית, מפסק לא נעשה שימוש במהלך ניתוח כדי למזער את גודל החתך. כאשר החתך קטן יותר, נוכל לקצר את זמן התפירה בניתוח. עם חתך של 1 ס מ בבטן, אנחנו יכולים להביא בקלות את האונה השמאלית בחוץ עם מספוגית כותנה (איור 4A-C). שנית, ספוגית כותנה משחק שלושה תפקידים חשובים על ידי עצירת הומוסטזיס לאחר ביצוע כיס הכבד, פתיחת כיס הכבד כדי להיות מסוגל להכניס קטע הגידול ושמירה על נתח הגידול בכיס מבלי לדחוף את הגידול בחזרה (איור 4D- F). נפח דימום ממוצע היה פחות מ 10% של במחזור נפח הדם בעכברים. . פחות דימום סיפק ביטחון רב בניתוח שלישית, סדין בד שימושי לתיקון אונה הכבד מחוץ לבטן. האונה הכבד מקל על הסדין ולכן היא מונעת האונה להחליק בחזרה לתוך הבטן (איור 4C). ניתן בקלות לחתוך את משטח הכבד עם אזמל ולהזריק מחט למשטח הכבד. כתוצאה מכך, רקמת הכבד השברירית אינה נפגעת.

אנו מציגים שני טיפים לפתרון בעיות עבור שיטה זו. ראשית, כאשר נעשה שימוש באתר חתך קטן, לפעמים אונה שמאלית אינה גלויה. במצב הזה, האונה השמאלית. נוטה לדבוק בסרעפת הכניסו מלקחיים מקצה לראש בין האונה השמאלית לסרעפת כדי לקלף את האונה. שנית, כאשר קטע הגידול ממוקם בכיס הכבד עם מלקחיים, הגידול יכול לדבוק מלקחיים ולמשוך חזרה עם זה. לחץ על החתך עם ספוגית כותנה תוך נסיגה מלקחיים. זה עובד טוב כדי למנוע את שיבוש הגידול מתוך הכיס.

גידולים xenograft מוקפים רקמת העכבר, אף על פי שהם אורתולמריחה על העור. תאים סטרומה האדם בגידולים שמקורם בחולה מוחלפים באופן בלתי נמנע על ידי תאים סטרומה העכבר. באופן אידיאלי, מודל העכבר היה טוב יותר לספק רקמות סטרומה האדם סביב גידולים. כימאריק הומניזציה בעכבר הכבד או הומניזציה מודלים העכבר החיסונית יהיה מועיל ללמוד את החרט של מלנומה uveal ולהעריך אם חילוף החומרים של התרופה זהה לסביבה האנושית או החיסונית האנושית24,25.

אורתוטופית הכבד הגידול מודלים העכבר לצורך אימות של הקמת הגידול עם לימודי הדמיה. הסוכן לעומת CT זמין באופן מסחרי, שפותחה עבור תמונות CT הכבד של העכבר, מאפשר זיהוי של גידולים בכבד הפנים במצב החיים ב-CT. סוכן הקונטרסט מגביר במיוחד. את הכבד הרגיל בסי. טי קל להבדיל את האתר בלתי משופר של הגידול26. הסוכן מזהה גידולים זעירים פחות מ 1 מ"מ (גושים בת) סביב גידולים עיקריים ב-CT. הסוכן יכול להיות נסבל על ידי העכבר, ומאפשר לנטר גידולים בכבד מעת לעת. הסוכן ישמש כדי להעריך את היעילות של תרופות נגד סרטן נגד גידולים מקומיים בכבד מבע.

בדרך כלל, מומלץ לשמור על מודלים pdx ב מספר מעבר נמוך יחסית (פחות מ 10) כדי לחסוך שלמות גנטית והיסטולוגית של הגידול המקורי הנגזר מטופל27,28,29. רוב החוקרים נמנעים מביצוע מספר מעברים מדגמי PDX כדי להקטין את מספר המעברים והחיות. לאחר המטופל נגזר גידולים נשמרים זמנית במקפיא, אנחנו יכולים לשלוט PDX מודלים במעבר נמוך מספר מבלי לבזבז עכברים. זה נקרא אסטרטגיית biobanking. Biobank סרטן היא גישה רציונלית כדי לשמור על מאפייני הגידול כדי להקטין את מספר עכברים28,30. הקמת שיטה מתאימה biobanking יכול להתאים את האספקה של מודלים PDX כדי לענות על תוכנית הטיפול של המטופל או משפט יעילות של תרופה לעכבר בעתיד. השגנו מחדש השרשה של גידולים שמורים עבור סרטן biobanking. אנו מקווים כי הצלחה זו מקלה על שימוש בפלטפורמת PDX בעתיד הקרוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו אסירי תודה על מסיה אוהרה, ק. סאיטו, ומסיה טראי, על סקירת כתב היד. המחברים מכירים ביקורת קריטית עבור העריכה והעזרה האנגלית של כתב יד זה על ידי ד ר... סאטו בבית הסרטן פוקס צ'ייס מרכז. העבודה שתוארה בזאת היתה נתמכת על ידי קרן בוני קרול מחקר, הקרן מחקר ויינזירופ, קרן מלנומה לחקר העין באוניברסיטת תומס ג'פרסון, קרן הקהילה של אוסקה, ו-JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 18K15596 באוסקה סיטי אוניברסיטת. מחקרים במעבדה של ד ר א. אפלין תמכו על ידי NIH גרנט R01 GM067893. פרויקט זה מומן גם על ידי פרס המדע הטרנספורמטיבי של דיקן, פרס היוזמה התוכניתית של אוניברסיטת תומס ג'פרסון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4, (3), 145-151 (2018).
  2. Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
  3. Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98, (3), 383-389 (1991).
  4. Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123, (12), 1639-1643 (2005).
  5. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119, (5), 670-676 (2001).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4, (11), 1670-1680 (2009).
  8. Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16, (8), 2352-2362 (2010).
  9. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3, (3), 413-422 (1993).
  10. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1, (3), 471-475 (2010).
  11. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14, (20), 6456-6468 (2008).
  12. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3989-3998 (2007).
  13. Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3, (5-6), 469-482 (2009).
  14. Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
  15. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, (8), 451-452 (2015).
  16. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85, (2), 217-221 (2009).
  17. Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186, (1), 43-56 (2016).
  18. Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15, (1), 145 (2017).
  19. Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, (20), 9345-9349 (1991).
  20. Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6, (6), 2556-2561 (2000).
  21. Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72, (10), 2683-2691 (2012).
  22. Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
  23. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25, (79), e50544 (2013).
  24. Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46, (4), 1186-1190 (2014).
  25. Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
  26. Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6, (9), e25692 (2011).
  27. Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14, (5), 574-583 (2012).
  28. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12, (15), 4652-4661 (2006).
  29. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  30. Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6, (5), 14495 (2015).
הדור של מלנומה האדם Uveal האנושי פלטפורמת Xהשתל בעכברים חיסוני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter