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Cancer Research

免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

オルソトピックヒト肝転移性ブドウ球色黒色移植マウスモデルは、培養ヒトブドウ色腫細胞株を用いた患者由来腫瘍チャンクおよび針注射技術を用いた外科的オルトトピック移植技術を用いて作成された。

Abstract

ここ数十年、皮下移植患者由来異種移植片腫瘍または培養ヒト細胞株は、従来の確立されたヒト細胞よりも免疫不全マウスにおけるヒト癌を研究する代表的なモデルとしてますます認識されているインビトロの行。近年、マウスに直交移植患者由来腫瘍異種移植片(PDX)モデルが開発されており、患者腫瘍の特徴をより良く複製することが挙げられる。肝臓の正接異種移植片マウスモデルは、腫瘍生物学と薬物療法に関する洞察を提供する有用な癌研究プラットフォームであることが期待される。しかしながら、肝臓の正形トピック腫瘍移植は一般に複雑である。ここでは、患者由来肝転移性うveveal黒色腫腫瘍のオルソトピック移植のためのプロトコルについて説明する。ヒト肝転移性ブドウ球色黒色腫細胞株を免疫不全マウスに培養した。このプロトコルは、患者由来のブドウ色腫腫瘍の塊を持つ外科的オルトトピック移植技術または培養ヒト細胞株を用いた針注入技術のいずれかを用いて、一貫して高い技術的成功率をもたらすことができます。また、内部肝腫瘍を検出するCTスキャンや、再移植を達成するために凍結保存腫瘍を用いた再移植技術についても説明する。一緒に, これらのプロトコルは、翻訳研究における肝転移性ウVEVE性黒色腫の肝直芽性腫瘍マウスモデルのためのより良いプラットフォームを提供します。

Introduction

うびよ黒色腫は、西洋世界の成人の間で最も一般的な眼内悪性腫瘍である。過去50年間、米国1、2では、ウベル黒色腫(100万人当たり5.1例)の発生率が安定している。うまん性黒色腫は虹彩、毛様体、または甲状腺のメラノサイトから生じ、転移を発症すると非常に致死性の疾患である。うびろ黒色腫転移患者の死亡率は、転移の初期診断後2年で1年で80%、2年で92%であった。転移と死亡の診断の間の時間は、典型的には、治療3、4に関係なく、6ヶ月未満の短い。癌は血液を介して広がり、肝臓に支配的に転移する傾向がある(89-93%)4、5。肝転移性うveal黒色腫のさらなる調査には、効果的なマウスモデルが緊急に必要である。翻訳研究のために、肝局在性転移性うveanomaマウスモデルを生成する明確な需要がある。

患者由来腫瘍異種移植片(PDX)マウスモデルは、個別化医療戦略を提供することが期待される。これらのモデルは、臨床結果の予測であり得る、 前臨床薬物評価に有用であり、腫瘍6の生物学的研究に使用される。代表的なPDXモデルは、皮下部位に腫瘍を有する子宮外腫瘍移植異種移植マウスである。ほとんどの研究者は、特別な練習7、8なしで皮下移植のための手術を行うことができます。彼らはまた、皮下腫瘍を容易に監視することができます。皮下PDXモデルは研究段階で普及しましたが、実用化に向けていくつかのハードルがあります。皮下移植は、患者由来の腫瘍を腫瘍起源とは異なる微小環境で生着させ、生着障害および遅い腫瘍増殖9、10、11につながるようにする。 12、13、14.直交移植は、元の腫瘍15、16と同じ器官を使用するので、PDXモデルにとってより理想的で合理的なアプローチであり得る。

最近では、培養ヒト肝臓転移性ブドウ色黒色腫細胞株をNODで培養した患者由来肝転移性ブドウ色腫腫瘍の外科的オルトトピック移植技術と針注射技術のプロトコルを開発した。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウス17,18.プロトコルは、一貫して高い技術的成功率をもたらす。また、内部肝腫瘍の検出に役立つCT走査技術を確立し、PDXプラットフォームで凍結保存腫瘍の再移植を開発しました。我々は、ウVEAL黒色腫腫瘍異種移植片モデルが、組織病理学的および分子的特徴を含む元の患者肝腫瘍の特徴を維持することを見出した。これらの技術は、翻訳研究における子宮頸黒色腫の肝直芽腫瘍モデルのためのより良いプラットフォームを提供する。

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Protocol

研究に登録された患者は、機関審査委員会承認のプロトコルによると、研究目的および遺伝学的研究のために廃棄された外科サンプルの使用を可能にする書面による同意を提供すべきである。このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に厳密に従って行われ、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 新鮮な患者由来腫瘍組織の収集

  1. 病院の手術室で手術または針生検から患者由来の腫瘍組織を得る。
  2. ハンクスのバランスのとれた塩溶液(HBSS)溶液を氷の上に入れた100mLの容器に腫瘍組織を入れます。
  3. 実験室で組織を無菌フード(バイオセーフティレベル2)に移す。
  4. できるだけ早くステップ 2 に進みます。
    注:安全上の理由から、既知のHIVまたはB型肝炎またはC型肝炎感染の患者を除外する。

2. 新鮮な患者由来腫瘍組織の処理

  1. 氷上にリン酸緩衝生理食塩糸(PBS)を含む50mLチューブに組織を入れます。組織を洗浄するには、チューブにPBSを加え、チューブからPBSを2回捨てます。
  2. 氷上のPBSを含むペトリ皿に組織を移します。
  3. 滅菌鉗子とはさみを使用して、組織の壊死部分を取り除きます。ステップ2.3~2.5の間、ティッシュを湿らせて冷たく保ちます。針生検サンプルの場合は、ステップ2.3および2.5をスキップし、サンプルをカットしないでください。
    注:壊死組織は触れると分解しやすいことが多い。
  4. 外科的肝臓移植のために組織を1mm3立方体に切断する。
  5. 残りのティッシュをペトリ皿の2mmの立方体に切ります。
  6. 組織学的分析用に4%ホルマリンを備えた1.7mmマイクロチューブと、ゲノムおよびプロテオミクス解析用の別のチューブに転送します。
  7. 液体窒素入りの液体窒素瓶にマイクロチューブを入れます。チューブを-80°Cの冷凍庫に移して永久保存します。
    注:患者からのサンプル除去と組織処理の間の時間は30分を超えてはならない。

3. 患者由来腫瘍組織による外科的肝臓移植

  1. 70%エチルアルコールで手術のためにフードに入ってくるすべてのオブジェクトをスプレーします。
    注:これには外科用器具、暖房パッドおよび麻酔機械が含まれる。
  2. 綿棒と布シートの重量を測定します。
  3. 誘導室に入れて3~5%のイソフルラン気化器でマウスを麻酔します。
  4. マウスが完全に麻酔されたら、加熱パッド上の位置に置きます。マウスのスネアウトにアイソフルランコーンを置き、麻酔の維持のために1.5~3%のアイソフルランを吸入します。
    注:マウスは、手順全体の間に加熱パッド上にある必要があります。暖房の欠如は低体温症を引き起こす可能性があります。
  5. マウスの足が超微細鉗子で刺されたとき、反応なしで適切な麻酔を確認します。
  6. 外科手術前にマイクロシリンジに27G針を使用して、脇腹にブプレノルフィン(0.6 mg/kg)を皮下注射する。
  7. 腹部に70%エチルアルコールを適用し、毛皮を上下に広げます。毛皮を広げた後、より簡単にカットするために、左肋下領域の下の皮膚のより容易な可視化を確認します。腹部から毛皮を剃らないでください。
    注:毛皮は、手術後に切開部位を隠し、マウスが切開後の手術を引っ掻くのを防ぎます。しかし、機関の基準に従って切開部位の感染を防ぐために毛皮を剃ることができます。
  8. ヨウ素を塗布し、皮膚に吸収させます。
  9. マウスに2cmの穴を開けた滅菌手術用ドレープを置きます。
  10. 湾曲した超微細鉗子で腹部の皮膚を持ち上げ、湾曲したはさみで1cmの横肋下皮膚切開を行います。
  11. 切開の皮膚の下に湾曲したはさみの先端を挿入し、少し開いて腹腹を皮膚から分離します。閉じた刃で切開部からはさみを引き込みます。
    注:マウスの内側のはさみを開閉すると、損傷や出血を引き起こす可能性があります。
  12. 腹腹腹の下に肝臓を見つける.腹腹を通して濃い赤みがかった色を確認します。
  13. 湾曲したはさみで、腹腹蓋に1cmの横方向の切開を行います。腹動脈が最先端から出血した場合は、直ちに焼灼法で出血を止める。
  14. 片手で湾曲した超微細鉗子を使用して脂肪組織をつかみ、左肝葉の下に綿棒の端を挿入し、もう一方の手で綿棒を下方に転がして肝臓を引き出します。
    注:脂肪組織をつかむことは、脂肪組織が綿棒に付着しないようにすることが重要です。
  15. 綿棒の上に肝臓を外装し、不織布の上に肝臓を置きます。
    注:ファブリックシートは、肝臓を安定させ、出血を吸収する上で2つの重要な役割を果たしています。
  16. 滅菌No.11メスブレードを使用して幅と深さ5mmの切開を行い、綿棒で切開部位を柔らかく押しながら、毛様腫にポケットを形成します。
    1. ブレードを肝臓の表面と平行に挿入し、水平に切断します。
    2. 綿棒で切開部位を押して出血を止める。
      注:ブレードを垂直に保つな、そうでなければ肝臓を突破し、肝臓の真ん中に大きな血管を傷つける。
  17. 綿棒を上方に転がして切開部位を開き、1mm3立方体の腫瘍組織を湾曲した超微細鉗子でポケットに埋め込む。綿棒を逆回転で転がしながら鉗子を引き込み、押し下げる。
    注:鉗子を引き込みながら綿棒で切開部位を押し下げると、ポケットの中の腫瘍の変位を防ぐのに役立ちます。
  18. 着床後、綿棒を切開部位からそっと取り出します。できるだけ早くステップ 3.19 に進みます。
  19. 切開部位に吸収可能な止端を置きます。
  20. 止血を確認します。出血が続く場合は、切開部位に止血剤を追加します。
  21. 鉗子(好ましくは鈍い終わり)で生地のシートから肝臓を剥がし、肝臓を腹腔に戻す。
  22. 5-0吸収性縫合糸を使用した二重合字の縫合腹系。
  23. 5-0吸収性縫合糸を用いたトリプル合字付き縫合皮膚。
    注:三重合字は外科的切開の解力の変形を防ぐのに役立つ。
  24. 完全に目が覚めるまでマウスを観察し、ケージに戻します。
  25. 手術中の出血量に対して、綿棒と生地シートの重量を血液で測定します。手術前の元の体重と比較してください。手術中の出血をマウスの循環血液量の10%未満に減らす。

4. 培養ヒト肝臓転移性ブドウ球色黒色腫細胞株の収集と処理

  1. 培養細胞を調製する。
  2. セルを収集し、セル カウンタを使用してセル番号を計算します。
  3. 15 mLチューブ内の10.0 x 106細胞に対して適量の細胞懸濁液を調製します。
  4. 室温で遠心分離機で300 x gでチューブを5分間回転させます。
  5. 15 mLチューブの上清を取り除き、セルペレットはチューブの底に置いておきます。
  6. 50 μL の RPMI 1640 培地を 1.7 mL チューブに追加します。
  7. 200°L先端の先端をはさみで切り、先端の開口部を拡大します。
  8. RPMIを持つ1.7 mLチューブに、カット先端のピペットを使用して60°Lの基底膜マトリックスを追加します。
  9. 1.7 mLチューブにRPMIとマトリックスを混ぜます。ボルテックスだ
  10. 混合物の110 μLを15 mLチューブ内のセルペレットに加えます。セル懸濁液を新しい1.7 mLチューブに移します。
  11. 針注射の前にチューブを氷の上に置いておきなさい。

5. 培養ヒト肝臓転移性ブドウ球色黒色腫細胞株の肝臓への外科的針注入

  1. 手順 3.1 から 3.15 までの上記のプロトコルに従います。
  2. 27 G針でマイクロシリンジで細胞懸濁液を回収します。
  3. 肝臓の表面に沿って針を挿入し、針の先端を5mm深く進めます。
  4. 肝臓に20μLの細胞懸濁液を注入する。
  5. 肝臓の挿入点を焼灼して、注射された細胞が漏れるのを防ぎます。止血を確認します。
  6. 手順 3.21 から 3.24 までの上記のプロトコルに従います。

6. CTスキャン

  1. マウスを目覚め状態の拘束器に入れ、
  2. 消毒と血管拡張のための無菌アルコールパッドで尾を拭きます。
  3. 1 mLの注射器に27G針で尾静脈を通してCT造影剤の100μLを注入する。
  4. CTスキャンを行う前に、注射後4時間待ちます。
    注:薬剤が肝臓クッファー細胞によって取り込まれるまで4時間かかります。
  5. 注射の4時間後、3~5%の気化したアイソフルランを誘導室に入れて腫瘍軸受マウスを麻酔する。
  6. マウスが完全に麻酔されたら、CT上の傾向のある位置に置き、マウスのスーンにアイソフルランコーンを置き、麻酔の維持のために1.5〜3%のアイソフルランを吸入します。
  7. マウスの足が超微細鉗子で刺されたとき、反応なしで適切な麻酔を確認します。
  8. CTスキャンを15分間行います。
  9. CTスキャン後に完全に覚醒するまでマウスがケージに戻したことを確認します。
  10. 腫瘍の存在を評価し、CT画像上の腫瘍サイズを測定する。
    注:造影剤は、正常な肝性毛腫を増強し、非増強腫瘍を認識しやすいようにする。胆嚢と胃を腫瘍と誤解しないでください。

7. 組織の収穫と処理

  1. CO2を使用してマウスを安楽死させ、その後、人差し指と親指を頭蓋骨の後ろに置き、尾の基部で体を引っ張ることによって、子宮頸部脱臼を行う。できるだけ早く手順 7.2 に進みます。
  2. マウスを脊椎の位置に置き、70%エチルアルコールで腹部をスプレーします。
  3. 滅菌鉗子と滅菌ハサミを使用して、腹部器官を露出させるために、xiphoidプロセスの下に3cmの横方向の切開を行います。
  4. 腫瘍組織を取り出し、工程2.1~2.2を行う。
  5. 残りの腫瘍をペトリ皿の2mmの立方体に切ります。
  6. 凍結保存後の再移植のために極低温チューブに移す。
  7. イソプロパノールで満たされた極低温凍結容器にチューブを入れます。
  8. 容器を-80°Cの冷凍庫に移して一時保管します。凍結培地を含む凍結管を液体窒素タンクに直接入れないでください。腫瘍組織を保存するために-1°C/分の冷却速度でゆっくりと凍結します。
  9. 翌日、チューブを液体窒素タンクに移し、永久保存します。

8. 再注入

  1. 液体窒素で凍ったチューブを液体窒素で固留め、組織を移植する準備ができるまで保管してください。生存率を維持し、生着の可能性を高めるために、室温への組織の暴露を最小限に抑えます。
  2. 37°水浴で凍結保存チューブを解凍します。
  3. 手順 2.2 ~ 2.4 を実行します。
  4. ステップ3.1~3.24に記載されているように、解凍した腫瘍をマウスに移植します。

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Representative Results

肝臓ポケット法を用いた外科的オルトトピック移植は、ヒト肝臓転移性うveveal黒色腫腫瘍を6ヶ月以内に80%の高い成功率でマウス肝臓に移植することができる。異種移植片腫瘍は、娘結節のない孤独な腫瘍として肝臓に生着する(図1および図3A)。マイクロニードルを用いた肝臓への外科的オルトトピック注射技術は、全症例において肝臓におけるヒト肝転移性ブドウ色黒色腫細胞の移植に成功した(図2および図3B)。しかし、いくつかの症例は、主な腫瘍の周りに広がっていた。造影剤は、1mmサイズの小さな腫瘍を含むCT上の肝臓の腫瘍を検出する(図3B)。凍結保存腫瘍の再移植は、成功率の高いマウス肝臓に正常に確立した。凍結保存後に再移植された異種移植片腫瘍は、元の患者腫瘍および凍結保存前腫瘍の特徴を保持する。

Figure 1
図1:外科的オルソトピック肝移植による患者由来腫瘍異種移植片マウスモデルマウスは腫瘍移植後6ヶ月後に安楽死させた。色素性黒色腫瘍(黒い矢印)は、ウVEAL黒色腫である。腫瘍は肝臓の左葉に生着する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:針注射法を用いた肝直交細胞株由来腫瘍異種移植片マウスモデルマウスは腫瘍注射の8週間後に安楽死させた。色素性黒色腫瘍(黒い矢印)は、ウVEAL黒色腫である。腫瘍は肝臓の左葉に生着する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:肝臓の左葉における肝腫瘍のCT像肝腫瘍は増強CT上で検出される。正常肝組織は造影剤によって増強される。白い矢印は肝臓の隣の胃を示します。(A)以前に図 1に示した腫瘍 (黒い矢印) 。外科的正形移植は孤独な腫瘍を形成する。(B)前に図2に示した腫瘍(黒矢印)。針注射法は、多くの小さな腫瘍のクラスターを形成する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:肝臓ポケット法の技術的なヒント。(A-C)肝臓の左葉(白い矢印)は、1cmの切開を介して綿棒(黒い矢印)を使用して腹部から露出することができる。切開部を広げるためにレトラクターは必要ありません。(D) 綿棒は切開部をそっと押す。メス(緑色の矢印)による切開後に止血を得る。(E) 綿棒は上向きに転がる(曲線の赤い矢印)。これは切開を開くために肝性毛腫を持ち上げます。腫瘍黄色の矢印)は、超微細鉗子(青い矢印)によって切開を介して肝臓ポケットに挿入される。(F)綿棒は下向きに転がり(赤い矢印が曲がった)、ポケットに挿入された腫瘍が後退するのを防ぎます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

現在のオルソトピック異種移植モデルは、手間がかかり、時間がかかり、作成にコストがかかります。肝臓癌に対する直交性腫瘍異種移植片マウスモデルは、20年以上前に確立された19,20,21.しかし、この技術は複雑であり、マイクロニードルホルダーや6-0~8-0などの特殊な機器を使用する必要があります。顕微鏡の下の細かい縫合糸。腫瘍および正常な肝組織は、縫合糸が壊れやすい肝臓組織を損傷しないように注意深く縫い合わなければならない。従来の技術は、血腫および壊死22のような合併症につながる。近年、これらの問題を解決するために改変技術が開発された23.この改変技術は、肝臓表面の腫瘍をカバーするために縫合の代わりに吸収可能な止血性材料を使用する。しかしながら、この改変された方法は、肝性ばん癌内の腫瘍を完全にカバーしない。腫瘍の一部が外側にさらされる。我々は、腫瘍を全体にペンレンチマ18内に収容する肝臓ポケット法の外科的オルソトピック移植技術を開発した。私たちの方法は、腫瘍のための自然な環境を提供するために肝臓にポケットを作ります.肝臓ポケット法は従来の技術よりも簡単で、手術開始から数分以内に肝臓への移植を完了することができます。この方法は、肝臓における孤独な腫瘍の形成をもたらし、転移を引き起こさないが、少なくとも我々がマウスを観察した限り、単一細胞懸濁液の針注射は肝内転移として広がる傾向がある17。孤独な腫瘍は、腫瘍の成長を評価するためにより適切であり、薬物試験で有効性を評価するのに有用であろう。

元の肝ポケット法18と比較して、我々は移植の技術を高めるために我々の方法を変更しました。まず、切開のサイズを最小限に抑えるために手術中にリトラクターを使用しなかった。切開が小さい場合は、手術の縫製時間を短縮できます。腹部に1cmの切開で、綿棒で左葉を外に簡単に持ち込むことができます(図4A-C)。第二に、綿棒は肝臓ポケットを作った後に止め、肝臓ポケットを開いて腫瘍チャンクを挿入し、腫瘍を押し戻さずにポケットに腫瘍チャンクを保持することによって、3つの重要な役割を果たす(図4D- F) を参照してください。平均出血量は、マウスの循環血液量の約10%未満であった。出血が少なかった場合、手術に大きな自信を与えた。第三に、生地シートは腹部の外側の肝臓葉を固定するのに有用である。肝臓ローブはシートにくっつくので、ローブが腹部に滑り込むのを防ぎます(図4C)。メスで肝表面を簡単に切断し、肝臓の表面に針を注入することができます。その結果、壊れやすい肝組織は傷ついていない。

この方法のトラブルシューティングのヒントを 2 つ紹介します。まず、小さな切開部位を使用すると、左葉が見えない場合がある。この状況では、左葉が横隔膜に付着している可能性が高いです。左葉と横隔膜の間に鈍いエッジ鉗子を挿入して、ローブを剥がします。第二に、鉗子で肝臓ポケットに腫瘍チャンクを入れると、腫瘍は鉗子に付着し、それで引き戻すことができる。鉗子を後退させながら、綿棒で切開部を押します。これは、ポケットから腫瘍の脱臼を防ぐためにうまく動作します。

異種移植片腫瘍は、直交移植されてもマウス組織に囲まれている。患者由来腫瘍におけるヒト間質細胞は、必然的にマウス間質細胞に置き換えられる。理想的には、マウスモデルは腫瘍の周りにヒト間質組織を提供する方が良い。キメラヒト化肝マウスまたはヒト化免疫マウスモデルは、子宮内黒色腫の生着を研究し、薬物代謝がヒト肝臓またはヒト免疫環境同じであるかどうかを評価するのに役立つであろう24、25。

直交トピック肝腫瘍異種移植マウスモデルは、イメージング研究による腫瘍樹立の検証を必要とする。市販のCT造影剤は、マウス肝臓CT画像用に開発され、CT上のライブ状態で内部肝腫瘍の検出を可能にする。造影剤は、CT上の正常な肝臓を特異的に増強する。腫瘍26の非増強部位を区別することは容易である。薬剤はCTの主要な腫瘍の周りに1mm(娘結節)未満の小さな腫瘍を検出する。薬剤はマウスによって許容することができ、肝臓腫瘍を定期的に監視することを可能にする。この薬剤は、肝局在性異種移植片腫瘍に対する抗癌剤の有効性を評価するために使用されるであろう。

一般に、PDXモデルを比較的低い通路数(10未満)に維持し、元の患者由来腫瘍27、28、29の遺伝的および組織学的完全性を保全することが推奨される。ほとんどの研究者は、通路や動物の数を減らすためにPDXモデルの複数の通路を作ることを控えています。患者由来の腫瘍が冷凍庫に一時的に保存されると、マウスを無駄にすることなく、より低い通路数でPDXモデルを制御することができます。これをバイオバンキング戦略といいます。癌バイオバンクは、腫瘍特性を維持し、マウス28、30の数を減らすための合理的なアプローチである。適切なバイオバンキング方法を確立することで、将来的に患者の治療計画やマウス薬効試験を満たすためにPDXモデルの供給を調整することができます。がんバイオバンキング用凍結保存腫瘍の再移植を実現しました。この成功により、近い将来の PDX プラットフォームの使用が容易になることを期待しています。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

原稿を見直してくれた大原M.、さぼり、寺井M.に感謝しています。著者らは、フォックスチェイスがんセンターのR.サト博士によるこの原稿の編集と英語の援助に対する批判的なレビューを認めている。本明細書に記載された研究は、ボニー・クロール研究基金、マーク・ワイナー研究基金、トーマス・ジェファーソン大学眼黒色腫研究基金、大阪コミュニティ財団、JSPS KAKENHI補助金番号JP 18K15596(大阪市)大学。A.アプリン博士の研究室での研究は、NIH助成金R01 GM067893によってサポートされました。このプロジェクトは、学部長の変革科学賞、トーマス・ジェファーソン大学プログラム・イニシアティブ賞によっても資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4, (3), 145-151 (2018).
  2. Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
  3. Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98, (3), 383-389 (1991).
  4. Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123, (12), 1639-1643 (2005).
  5. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119, (5), 670-676 (2001).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4, (11), 1670-1680 (2009).
  8. Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16, (8), 2352-2362 (2010).
  9. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3, (3), 413-422 (1993).
  10. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1, (3), 471-475 (2010).
  11. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14, (20), 6456-6468 (2008).
  12. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3989-3998 (2007).
  13. Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3, (5-6), 469-482 (2009).
  14. Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
  15. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, (8), 451-452 (2015).
  16. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85, (2), 217-221 (2009).
  17. Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186, (1), 43-56 (2016).
  18. Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15, (1), 145 (2017).
  19. Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, (20), 9345-9349 (1991).
  20. Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6, (6), 2556-2561 (2000).
  21. Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72, (10), 2683-2691 (2012).
  22. Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
  23. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25, (79), e50544 (2013).
  24. Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46, (4), 1186-1190 (2014).
  25. Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
  26. Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6, (9), e25692 (2011).
  27. Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14, (5), 574-583 (2012).
  28. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12, (15), 4652-4661 (2006).
  29. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  30. Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6, (5), 14495 (2015).
免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成
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Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

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