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Cancer Research

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

정형외과 성 인간 간 전이성 포도막 흑색종 이종이식 마우스 모델은 배양된 인간 포도정 흑색종 세포주를 가진 환자 유래 종양 덩어리 및 바늘 주입 기술을 이용한 외과 정형외과 이식 기술을 사용하여 만들어졌습니다.

Abstract

최근 수십 년 동안, 피하 이식 환자 유래 이종이식 종양 또는 배양된 인간 세포주들은 기존의 확립된 인간 세포보다 면역결핍 마우스에서 인간 암을 연구하는 대표적인 모델로 점점 더 인식되고 있다. 선 체외에서. 최근, 정형병 이식 환자 유래 종양 이종이식(PDX) 모델이 마우스에서 개발되어 환자 종양의 특징을 더 잘 복제할 수 있게 되었다. 간 직교 이종이식 마우스 모델은 종양 생물학 및 약물 치료에 대한 통찰력을 제공하는 유용한 암 연구 플랫폼이 될 것으로 예상됩니다. 그러나, 간 정형종양 이식은 일반적으로 복잡하다. 여기에서 우리는 환자 유래 간 전이성 편한 흑색종 종양의 정형외 이식을 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다. 우리는 인간 간 전이성 포도막 흑색종 세포주를 면역 결핍 마우스로 배양했습니다. 프로토콜은 환자 유래 포도막 흑색종 종양의 덩어리를 가진 외과 정형 외과 이식 기술 또는 배양된 인간 세포주를 가진 바늘 주입 기술을 사용하여 일관되게 높은 기술적인 성공률 귀착될 수 있습니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하기 위하여 CT 스캐닝을 위한 프로토콜을 기술하고 재착식을 달성하기 위하여 냉동 보존한 종양을 사용하여 재이식 기술을 위해 기술합니다. 함께, 이러한 프로토콜은 번역 연구에서 간 전이성 편한 흑색종의 간 정형 종양 마우스 모델에 대한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

Introduction

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경막 흑색종은 서쪽 세계에 있는 성인 중 가장 일반적인 안구 악성 종양입니다. 과거 50 년 도중, uveal 흑색종 (백만 당 5.1 케이스)의 부각은 미국에 있는 안정되어 남아 있습니다1,2. 경막 흑색종은 홍채, 섬모 체 또는 choroid에 있는 melanocytes에서 생기고, 전이가 발전할 때 극단적으로 치명적인 질병입니다. 경막 흑색종 전이를 가진 환자의 사망률은 전이의 초기 진단 후에 2 년에 1 년에 80%이고 92%이었습니다. 전이와 죽음의 진단 사이 시간은 일반적으로 짧은, 미만 6 개월, 치료에 관하여 없이3,4. 암은 혈액을 통해 퍼지고 간 (89-93 %)4,5. 효과적인 마우스 모형은 간 전이성 경추 흑색종의 추가 조사를 위해 긴급하게 필요합니다. 번역 연구를 위해, 간 국소화한 전이성 전이성 흑색종 마우스 모형을 생성하는 명확한 수요가 있습니다.

환자 유래 종양 이종이식(PDX) 마우스 모델은 개별화된 의학 전략을 제공할 것으로 예상된다. 이러한 모델은 임상 결과를 예측하고, 전임상 약물 평가에 유용할 수 있으며, 종양의 생물학적 연구에 사용될 수 있다6. 대표적인 PDX 모형은 피하 사이트에 종양이 있는 ectopically 종양 이식이 친이종 마우스입니다. 대부분의 연구자들은 특별한 연습없이 피하 이식 에 대한 수술을 할 수 있습니다7,8. 그(것)들은 또한 피하 종양을 쉽게 감시할 수 있습니다. 피하 PDX 모델은 연구 단계에서 인기를 얻었지만 실용화로 전환하는 데 몇 가지 장애물이 있습니다. 피하 이식은 환자 유래 종양이 종양 기원으로부터 다른 미세 환경으로 이식되도록 강제하여 생착 실패 및 느린 종양 성장9,10,11, 12,13,14. 직교 생착은 원래 종양15,16과동일한 장기를 사용하기 때문에 PDX 모델에 대해 보다 이상적이고 합리적인 접근법일 수 있다.

최근에는 환자 유래 간 전이성 흑색종 종양 및 바늘 주사 기법을 NOD에서 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포주로 외과 정형외과 이식 기법을 개발했습니다. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스17,18. 이 프로토콜은 지속적으로 높은 기술적 성공률을 초래합니다. 우리는 또한 내부 간 종양을 검출하는 데 유용한 CT 스캐닝 기술을 확립하고 PDX 플랫폼에서 냉동 보존 종양의 재이식을 개발했습니다. 우리는 경막 흑색종 종양 이종이식 모형이 그들의 조직 병리학및 분자 특징을 포함하여 본래 환자 간 종양의 특성을 유지한다는 것을 것을을 발견했습니다. 함께, 이 기술은 번역 연구에서 경막 흑색종을 위한 간 정형종양 모형을 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

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Protocol

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연구 결과에 등록된 환자는 기관 검토 위원회 승인한 프로토콜에 따라 연구 목적 및 유전 연구를 위해 버려진 외과 견본의 사용을 허용하는 서면 동의를 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 국립 보건원의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었으며 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 신선한 환자 파생 종양 조직의 집합

  1. 병원 수술실에서 수술 또는 바늘 생검에서 환자 유래 종양 조직을 가져옵니다.
  2. 종양 조직을 행크스의 균형 잡힌 염액(HBSS) 용액을 함유한 100 mL 용기에 얼음 위에 넣습니다.
  3. 실험실에서 멸균 후드 (생체 안전 수준 2)로 조직을 옮김.
  4. 가능한 한 빨리 2 단계로 진행하십시오.
    참고: 안전상의 이유로 알려진 HIV 또는 B형 간염 또는 C 감염 환자를 제외하십시오.

2. 신선한 환자 유래 종양 조직의 처리

  1. 인산염 완충 식염수 (PBS)를 함유 한 50 mL 튜브에 얼음에 조직을 넣습니다. 티슈세척을 위해 튜브에 PBS를 넣고 튜브에서 PBS를 두 번 버립니다.
  2. 얼음에 PBS를 포함하는 페트리 접시에 조직을 전송합니다.
  3. 멸균 집게와 가위를 사용하여 조직의 괴사 부분을 제거하십시오. 2.3~2.5단계 동안 조직을 촉촉하고 차갑게 유지하십시오. 바늘 생검 견본을 위해, 단계 2.3 및 2.5를 건너뛰고, 견본을 절단하지 않습니다.
    참고: 괴사 조직은 종종 만질 때 쉽게 분해됩니다.
  4. 수술 간 이식을 위해 조직을 1mm3 큐브로 자릅니다.
  5. 나머지 티슈를 페트리 접시에 2mm 큐브로 자른다.
  6. 조직학적 분석을 위해 4% 포르말린을 가진 1.7 mm 마이크로튜브로 옮기고 게놈 및 프로테오믹 분석을 위한 다른 튜브로 옮김을 옮김.
  7. 액체 질소가있는 액체 질소 항아리에 마이크로 튜브를 넣습니다. 영구 보관을 위해 튜브를 -80°C 냉동고로 옮김.
    참고: 환자와 조직 처리에서 샘플 제거 사이의 시간은 30 분 초과해서는 안됩니다.

3. 환자 유래 종양 조직을 가진 외과 간 이식

  1. 70 % 에틸 알코올로 수술을 위해 후드에 들어오는 모든 물체를 스프레이하십시오.
    참고: 여기에는 수술 기구, 난방 패드 및 마취 기계가 포함됩니다.
  2. 면봉과 패브릭 시트의 무게를 측정합니다.
  3. 유도 챔버에 배치하여 3-5 % 이소플루란 기화기로 마우스를 마취.
  4. 마우스가 완전히 마취되면 가열 패드에 척추 위치에 놓습니다. 이소플루란 콘을 마우스 주전자에 놓고 마취 유지를 위해 1.5-3% 이소플루란을 흡입합니다.
    참고: 마우스는 전체 절차 동안 가열 패드에 있어야합니다. 가열부족은 저체온증을 유발할 수 있습니다.
  5. 마우스의 발이 초미세 집게로 찔려 있을 때 반응없이 적절한 마취를 확인하십시오.
  6. buprenorphine주입 (0.6 mg/kg) 수술 전에 마이크로 주사기에 27 G 바늘을 사용하여 측면에 피하.
  7. 복부에 70 % 에틸 알코올을 바르고 모피를 위쪽과 아래쪽으로 퍼뜨리게하십시오. 모피를 퍼낸 후 왼쪽 아래 의 피부의 쉽게 시각화를 확인하여 쉽게 잘라냅니다. 복부에서 털을 면도하지 마십시오.
    참고: 모피는 수술 후 절개 부위를 숨기고 절개 후 수술부위를 긁는 것을 방지합니다. 그러나, 당신은 기관 기준에 따라 절개 부위의 감염을 방지하기 위해 모피를 면도 할 수 있습니다.
  8. 요오드를 바르고 피부에 흡수시키세요.
  9. 마우스에 2cm 구멍이 있는 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.
  10. 구부러진 초미세 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 곡면 가위로 1cm 가로 왼쪽 하부 피부 절개를 합니다.
  11. 절개 피부 아래에 구부러진 가위 끝을 삽입하고 약간 열어 피부에서 각피를 분리합니다. 절개에서 가위를 닫은 블레이드로 철회하십시오.
    참고: 마우스 내부의 가위를 열고 닫으면 손상과 출혈이 발생할 수 있습니다.
  12. 각막 아래에 간을 찾습니다. 회막을 통해 진한 붉은 색을 확인합니다.
  13. 구부러진 가위를 사용하면 각막에서 1cm 가로 절개를합니다. 후막 동맥이 절삭날에서 출혈하면 즉시 소작으로 출혈을 멈추십시오.
  14. 한 손으로 구부러진 초미세 집게를 사용하여 지방 조직을 잡고 왼쪽 간 엽 아래에 면봉의 가장자리를 삽입하고 다른 손으로 면봉을 아래쪽으로 굴려 간을 꺼내십시오.
    참고: 지방 조직을 잡는 것은 면봉에 붙어지방 조직을 유지하는 것이 중요합니다.
  15. 면봉에 간을 외부화하고 부직포 흡수 성 직물 시트에 간을 놓습니다.
    참고: 패브릭 시트는 간을 안정시키고 출혈을 흡수하는 데 두 가지 중요한 역할을합니다.
  16. 멸균 No. 11 메스 블레이드를 사용하여 폭5mm를 절개하고 면봉으로 절개 부위를 부드럽게 누르면서 실감에 포켓을 형성합니다.
    1. 간 표면과 병렬로 블레이드를 삽입하고 수평으로 잘라.
    2. 면봉으로 절개 부위를 눌러 출혈을 막습니다.
      참고: 그렇지 않으면 당신은 간을 통해 휴식과 간 중간에 큰 혈관을 손상됩니다, 수직 블레이드를 유지하지 마십시오.
  17. 면봉을 위쪽으로 굴려 절개 부위를 열고 1mm3 큐브의 종양 조직을 구부러진 초미세 집게로 주머니에 이식합니다. 면봉을 역회전으로 롤링하고 아래로 누를 때 집게를 철회합니다.
    참고: 집게를 철회하는 동안 면봉으로 절개 부위를 누르면 주머니 내부의 종양 변위를 방지하는 데 도움이됩니다.
  18. 이식 후 면봉을 절개 부위에서 부드럽게 제거하십시오. 가능한 한 빨리 3.19 단계로 진행하십시오.
  19. 절개 부위에 흡수성 지혈을 넣습니다.
  20. 지혈을 확인합니다. 출혈이 계속되면 절개 부위에 더 많은 지혈을 추가하십시오.
  21. 패브릭 시트에서 간을 집게 (바람직하게는 무딘 끝)로 껍질을 벗기고 간을 복강으로 다시 넣습니다.
  22. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 이중 합자를 가진 봉합사 복막.
  23. 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 삼중 합자를 가진 봉합사 피부.
    참고: 삼중 합자는 외과 절개 dehiscence를 방지하는 것을 돕습니다.
  24. 완전히 깨어날 때까지 마우스를 관찰하고 케이지에 다시 넣습니다.
  25. 수술 중 출혈 량에 대한 혈액으로 면봉과 직물 시트의 무게를 측정합니다. 수술 전에 원래의 무게와 비교. 수술 중 출혈을 마우스에서 순환 혈액 량의 10% 미만으로 줄입니다.

4. 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포주 수집 및 처리

  1. 배양 된 세포를 준비합니다.
  2. 셀 카운터를 사용하여 셀을 수집하고 셀 번호를 계산합니다.
  3. 15 mL 튜브에서 10.0 x 106 세포에 대해 적절한 양의 세포 현탁액을 준비합니다.
  4. 실온에서 원심분리기에서 튜브를 300 x g에서 5분 간 돌이십시오.
  5. 15 mL 튜브에서 상류를 제거합니다. 튜브의 바닥에 세포 펠릿을 둡니다.
  6. 1.7 mL 튜브에 RPMI 1640 배지 50 μL을 추가합니다.
  7. 팁 개구부를 확대하기 위해 가위로 200 μL 팁의 끝을 잘라냅니다.
  8. RPMI가 있는 1.7 mL 튜브에 절단 팁이 있는 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스 60 μL을 추가합니다.
  9. 1.7 mL 튜브에 RPMI와 매트릭스를 혼합합니다. 소용돌이.
  10. 혼합물의 110 μL을 15 mL 튜브의 세포 펠릿에 넣습니다. 셀 현탁액을 새로운 1.7 mL 튜브로 옮김을 옮김.
  11. 바늘 주입 전에 얼음에 튜브를 유지합니다.

5. 간으로 배양 인간 간 전이성 편한 흑색종 세포라인의 외과 바늘 이식

  1. 3.1단계부터 3.15단계까지 위의 프로토콜을 따르십시오.
  2. 27G 바늘로 마이크로 시링제로 세포 현탁액을 수집합니다.
  3. 간 표면을 따라 바늘을 삽입하고 바늘의 끝을 5mm 더 깊게 진행합니다.
  4. 간으로 세포 현탁액의 20 μL를 주입하십시오.
  5. 주사된 세포가 새는 것을 방지하기 위해 간 삽입 지점을 소작합니다. 지혈을 확인합니다.
  6. 3.21단계부터 3.24단계까지 위의 프로토콜을 따르십시오.

6. CT 스캔

  1. 깨어 있는 상태에서 절제에 마우스를 놓습니다.
  2. 소독 및 혈관 확장을 위해 멸균 알코올 패드로 꼬리를 닦으하십시오.
  3. 1 mL 주사기에 27 G 바늘로 꼬리 정맥을 통해 CT 조영제의 100 μL을 주입합니다.
  4. CT 스캔을 복용하기 전에 주입 후 4 시간 동안 기다립니다.
    참고: 그것은 걸립니다 4 에이전트간 Kupffer 세포에 의해 채택 될 때까지 시간.
  5. 주사 후 4 시간 후, 유도 챔버에 배치하여 3-5 % 기화 이소플루란으로 종양 베어링 마우스를 마취.
  6. 마우스가 완전히 마취되면, CT에 경향이 위치에 배치. 마취의 유지 보수를 위해 1.5-3 % 이소플루란을 흡입마우스의 주전자에 이소플루란 콘을 배치합니다.
  7. 마우스의 발이 초미세 집게로 찔려 있을 때 반응없이 적절한 마취를 확인하십시오.
  8. CT 스캔을 15분 동안 복용하십시오.
  9. CT 스캔 후 완전히 깨어날 때까지 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
  10. 종양의 존재를 평가하고 CT 이미지상에서 종양 크기를 측정한다.
    참고: 조영제는 정상 간 실치질을 강화하여 강화되지 않은 종양을 쉽게 인식할 수 있도록 합니다. 담낭과 위를 종양으로 잘못 해석하지 마십시오.

7. 수확 및 가공 조직

  1. CO2를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 검지 손가락과 엄지손가락을 두개골 뒤에 놓고 꼬리의 기저부로 몸을 당겨 자궁 경부 탈구를 하였다. 가능한 한 빨리 7.2 단계로 진행하십시오.
  2. 마우스를 척추 위치에 놓고 70 % 에틸 알코올로 복부를 스프레이하십시오.
  3. 멸균 집게와 멸균 가위를 사용하여 xiphoid 공정 아래 3cm 가로 절개를 만들어 복부 장기를 노출시십시오.
  4. 종양 조직을 소비하고 2.1 ~ 2.2 단계를 수행합니다.
  5. 페트리 접시에 종양의 나머지 부분을 2mm 큐브로 잘라.
  6. 냉동 보존 후 재이식을 위해 저온 매체가있는 극저온 튜브로 옮김.
  7. 이소프로판올로 채워진 극저온 냉동 용기에 튜브를 넣습니다.
  8. 임시 보관을 위해 용기를 -80°C 냉동고로 옮김. 저온 중간체가있는 저온 튜브를 액체 질소 탱크에 직접 넣지 마십시오. 종양 조직을 보존하기 위해 -1 °C / min의 냉각 속도로 천천히 얼립니다.
  9. 다음 날, 영구 저장을 위해 액체 질소 탱크에 튜브를 전송합니다.

8. 재이식

  1. 튜브를 액체 질소 항아리에 액체 질소로 냉동 보관하여 조직을 이식할 준비가 될 때까지 보관하십시오. 실온에 대한 조직의 노출을 최소화하여 생존력을 유지하고 생착 가능성을 높입니다.
  2. 37°C 수조에서 냉동 보존 튜브를 해동합니다.
  3. 2.2-2.4 단계를 수행합니다.
  4. 단계 3.1-3.24에 기재된 바와 같이 해동된 종양을 마우스내로 이식한다.

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Representative Results

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간 포켓 방법을 이용한 외과정형이식은 인간 간 전이성 흑색종 종양을 마우스 간으로 이식하여 6개월 이내에 80%의 높은 성공률을 기록할 수 있다. 이종이식 종양은 딸 작은혹이없는 독방 종양으로서 간에서 생착합니다(그림 1그림 3A). 마이크로니들을 이용하여 간으로 의한 외과적 정형외과 주사 기법은 모든 경우에 간에서 성공적으로 배양된 인간 간 전이성 흑색종 세포를 이식하였다(도2도 3B). 그러나, 몇몇 케이스는 주요 종양의 주위에 보급이 있었습니다. 조영제는 1mm 크기의 작은 종양을 포함하여 CT에 간에서 종양을 검출합니다(그림 3B). 저온 보존 종양의 재이식은 성공률이 높은 마우스 간에서 성공적으로 확립되었습니다. 동결 보존 후 재이식 이식 종양은 원래 환자 종양 및 사전 냉동 보존 종양의 특성을 유지합니다.

Figure 1
도 1: 외과적 정형외과 간 이식에 의한 환자 유래 종양 이종이식 마우스 모델. 마우스는 종양 이식 후 6개월 후에 안락사시켰다. 색소침착된 흑종양(검정색 화살)은 흑색종이다. 종양은 간 좌엽에 생착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 바늘 주입 방법을 이용한 간 직교 인간 세포주 유래 종양 이종이식 마우스 모델. 마우스는 종양 주사 후 8주 후에 안락사시켰다. 색소침착된 흑종양(검정색 화살)은 흑색종이다. 종양은 간 좌엽에 생착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 간 좌엽에서 간 종양의 CT 이미지. 간 종양은 향상된 CT에 검출됩니다. 정상 간 조직은 조영제에 의해 강화됩니다. 흰색 화살표는 간 옆에 있는 위를 나타냅니다. (A) 앞서 도 1에나타난 종양(검은색 화살표). 외과 정형 외과 이식은 고독한 종양을 형성합니다. (B) 앞서 도 2에나타난 종양(검은색 화살표). 바늘 주입 방법은 많은 작은 종양의 클러스터를 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 간 포켓 방법에 대한 기술 팁. (A-C) 간장의 좌엽(흰색 화살표)은 1 cm 절개를 통해 면봉(black arrow)을 사용하여 복부 밖으로 노출될 수 있다. 절개를 넓히기 위해 리트랙터가 필요하지 않습니다. (D)면봉을 절개에 부드럽게 누릅니다. 메스 (녹색 화살표)에 의한 절개를 한 후 지혈을 얻습니다. (E)면봉이 위쪽으로 굴러 (곡선 빨간색 화살표). 이것은 절개를 열기 위하여 간 자렌치마를 들어 올립니다. 종양 노란 화살표)는 초미세 집게 (파란색 화살표)에 의해 절개를 통해 간 주머니에 삽입된다. (F)면봉은 주머니에 삽입 된 종양이 백아웃되는 것을 방지하기 위해 아래쪽으로 굴러 (곡선 빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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현재 의 직교 이종이식 모델은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 만드는 데 비용이 많이 듭니다. 간암을 위한 정형외 종양 이종이식 마우스 모델은19,20,21년 이상 전에 2 년 이상 확립되었다. 그러나 이 기술은 복잡하며 마이크로 니들 홀더 및 6-0 에서 8-0과 같은 특수 장비를 사용해야 합니다. 현미경으로 미세 봉합사. 종양과 정상적인 간 조직은 봉합사가 깨지기 쉬운 간 조직을 손상시키지 않도록 신중하게 바느질해야합니다. 종래의 기술은 혈종 및괴사(22)와같은 합병증을 유발한다. 최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해 수정된 기술이개발되었다(23) 이 수정된 기술은 간 표면에 종양을 덮기 위하여 봉합사 대신 흡수성 지혈물질을 이용합니다. 그러나,이 변형 된 방법은 간 실치내의 종양을 완전히 커버하지는 않습니다. 종양의 일부가 외부에 노출됩니다. 우리는 외과 정형 외과 이식 기술을 개발 - 간 포켓 방법 - 완전히 실치마 내부 종양을 수용18. 우리의 방법은 종양에 대한 자연 환경을 제공하기 위해 간에서 주머니를 만든다. 간 포켓 방법은 기존의 기술보다 간단합니다, 우리가 수술의 시작에서 몇 분 이내에 간으로 이식을 완료 할 수 있도록. 이 방법은 간에서 고독한 종양의 형성을 초래하고 전이를 유발하지 않으며, 적어도 우리가 마우스를 관찰한 한, 단일 세포 현탁액의 바늘 주입은 간내전이(17)로서전파되는 경향이 있다. 독방 종양은 종양 성장을 평가하기에 더 적합하며 약물 시험에서 효능을 평가하는 데 유용할 것입니다.

원래 간 포켓 방법(18)에비해, 우리는 이식의 기술을 향상시키기 위해 우리의 방법을 수정했습니다. 첫째, 절개 크기를 최소화하기 위해 수술 중에 리트랙터를 사용하지 않았습니다. 절개가 작으면 수술시 봉제 시간을 단축할 수 있습니다. 복부에 1cm 절개를 하면 면봉으로 왼쪽 엽을 쉽게 외부로 가져올 수 있습니다(그림 4A-C). 둘째, 면봉은 간 주머니를 만든 후 지혈을 멈추고, 종양 덩어리를 삽입할 수 있도록 간 주머니를 열고 종양을 뒤로 밀지 않고 주머니에 종양 덩어리를 유지함으로써 세 가지 중요한 역할을합니다(도 4D- F)를참조하십시오. 평균 출혈 량은 마우스에서 순환 혈액 량의 약 10 % 미만이었다. 출혈이 적어 수술에 큰 자신감을 주어주게 되었습니다. 셋째, 직물 시트는 복부 외부의 간 엽을 고정하는 데 유용합니다. 간 엽은 시트에 달라 붙어 따라서 로브가 복부로 다시 미끄러지는 것을 방지합니다(그림 4C). 하나는 쉽게 메스와 간 표면을 잘라 간 표면에 바늘을 주입 할 수 있습니다. 결과적으로 연약한 간 조직은 손상되지 않습니다.

이 방법에 대한 두 가지 문제 해결 팁이 있습니다. 첫째, 작은 절개 부위를 사용할 때 때로는 왼쪽 엽이 보이지 않습니다. 이 상황에서, 왼쪽 엽은 다이어프램에 붙어 가능성이 있다. 왼쪽 엽과 다이어프램 사이에 무딘 가장자리 집게를 삽입하여 로브를 벗깁니다. 둘째, 종양 덩어리가 집게가있는 간 주머니에 놓이면 종양이 집게에 달라 붙어 그것으로 다시 당길 수 있습니다. 집게를 후퇴하는 동안 면봉으로 절개를 누릅니다. 이것은 주머니에서 종양의 탈구를 방지하기 위해 잘 작동합니다.

이종이식 종양은 정형이식에 이식되더라도 마우스 조직으로 둘러싸여 있습니다. 환자 유래 종양에 있는 인간 기질 세포는 필연적으로 마우스 기질 세포에 의해 대체됩니다. 이상적으로, 마우스 모형은 종양의 주위에 인간적인 기질 조직을 더 잘 제공했습니다. 키메라 인간화 간 마우스 또는 인간화된 면역 마우스 모델은 경막 흑색종의 생착을 연구하고 약물 대사가 인간-간 또는 인간-면역 환경과 동일한지 여부를 평가하는 데 도움이 될 것이다24,25.

정형외 간 종양 이종이식 마우스 모델은 화상 진찰 연구 결과를 가진 종양 설치의 확인을 요구합니다. 마우스 간 CT 영상을 위해 개발된 시판되는 CT 조영제는 CT상에서 살아있는 상태에서 내부 간 종양을 검출할 수 있게 한다. 조영제는 특히 CT에 정상 간을 향상시킵니다. 종양(26)의강화되지 않은 부위를 구별하기 쉽다. 에이전트는 CT에 주요 종양의 주위에 1 mm (딸 작은혹) 보다는 더 작은 종양을 검출합니다. 에이전트는 마우스에 의해 허용될 수 있고, 간 종양을 주기적으로 감시하는 가능하게 합니다. 에이전트는 간 국소화된 이종이식 종양에 대하여 항암 약의 효험을 평가하기 위하여 이용될 것입니다.

일반적으로, PDX 모델을 원래 환자 유래종양(27,28,29)의유전적 및 조직학적 무결성을 보존하기 위해 비교적 낮은 통로 수(10 미만)로 유지하는 것이 좋습니다. 대부분의 연구자들은 통로와 동물의 수를 줄이기 위해 PDX 모델의 여러 구절을 만드는 것을 삼가. 환자 유래 종양이 냉동고에서 일시적으로 보존되면 마우스를 낭비하지 않고 더 낮은 통로 번호로 PDX 모델을 제어할 수 있습니다. 이를 바이오뱅킹 전략이라고 합니다. 암 바이오뱅크는 종양 특성을 유지하고 마우스 의 수를 감소시키는 합리적인접근법(28,30)이다. 적절한 바이오뱅킹 방법을 확립하면 향후 환자의 치료 계획 또는 마우스 약물 효능 시험을 충족시키기 위해 PDX 모델의 공급을 조정할 수 있다. 우리는 암 바이오 뱅킹을 위해 저온 보존 종양의 재 이식을 달성했습니다. 우리는 이 성공이 가까운 장래에 PDX 플랫폼 사용을 용이하게 하기를 바랍니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

원고를 검토해 주신 오하라, 케이 사이토, 테라이 에게 감사드립니다. 저자는 폭스 체이스 암 센터에서 박사 R. 사토에 의해이 원고의 편집 및 영어 지원에 대한 비판적 검토를 인정합니다. 본 명세서에 기재된 작품은 보니 크롤 연구기금, 마크 와인지엘 연구기금, 토마스 제퍼슨 대학의 안과 흑색종 연구 기금, 오사카 공동체 재단, JSPS KAKENHI 교부금 JP 18K15596에 의해 지원되었다. 대학. A. Aplin 박사의 실험실에서 연구 NIH 교부금 R01 GM067893에 의해 지원 되었다. 이 프로젝트는 또한 학장의 변형 과학 상에 의해 투자되었다, 토마스 제퍼슨 대학 프로그래밍 이니셔티브 상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

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References

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면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성
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Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

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