Summary
Ортотопические метастатическая метастатическая метастатическая меланома печени человека были созданы с использованием хирургических методов ортотопической имплантации с помощью зубчатых опухолевых кусков и методов инъекций иглы с культивируемыми линиями клеток меланомы увеальной меланомы человека.
Abstract
В последние десятилетия, подкожно имплантированных пациента полученных ксенотрансплантатопухоли опухолей или культивируемых человеческих клеточных линий были все чаще признается в качестве более репрезентативной модели для изучения рака человека в иммунодефицитных мышей, чем традиционные установленные человеческие клетки линии в пробирке. Недавно, ортотопически имплантированных пациента полученных опухоли ксенотрансплантата (PDX) модели у мышей были разработаны, чтобы лучше реплицировать особенности опухолей пациента. Печень ортопедической ксенотранспланта мыши модель, как ожидается, будет полезной платформой исследований рака, обеспечивая понимание биологии опухоли и медикаментозной терапии. Тем не менее, имплантация ортотопической опухоли печени, как правило, сложна. Здесь мы описываем наши протоколы для ортотопической имплантации пациентов полученных опухолей увеальной меланомы печени. Мы культивировали метастатические метастатические линии клеток меланомы печени человека в иммунодефицитных мышей. Протоколы могут привести к последовательно высоким техническим успехам с использованием либо хирургической техники имплантации ортотопической с кусками опухоли увеальной меланомы, полученной пациентом, либо методом инъекций иглы с культивируемой линией клеток человека. Мы также описываем протоколы для КТ сканирования для обнаружения внутренних опухолей печени и для методов повторной имплантации с использованием криоконсервированных опухолей для достижения повторного трансплантации. Вместе эти протоколы обеспечивают лучшую платформу для печени ортотопические опухолевые мыши модели печени метастатической увеальной меланомы в трансляционных исследований.
Introduction
Увеальная меланома является наиболее распространенной внутриглазной злокачественной опухолью среди взрослых в западном мире. В течение последних 50 лет заболеваемость увеальной меланомой (5,1 случая на миллион) оставалась стабильной в Соединенных Штатах1,2. Увеальная меланома возникает из меланоцитов в радужной оболочке, цилиарном теле или сосудистом, и это чрезвычайно смертельное заболевание, когда развивается метастаз. Смертность пациентов с метастазами в увеальной меланомы составила 80% в 1 год и 92% в течение 2 лет после первоначальной диагностики метастаз. Время между диагностикой метастазах и смертью, как правило, короткое, менее 6 месяцев, без учета терапии3,4. Рак распространяется через кровь и имеет тенденцию к преимущественно метастазировать в печень (89-93%)4,5. Эффективная модель мыши срочно необходима для дальнейшего исследования печени метастатической увеальной меланомы. Для трансляционных исследований существует явный спрос на создание локализованной метастатической модели метастатических меланомы увеальной меланомы.
Пациент полученных опухоли ксенотрансплантат (PDX) мыши модели, как ожидается, обеспечить индивидуальные стратегии медицины. Эти модели могут быть прогностическими клинических исходов, быть полезными для доклинической оценки препарата, и быть использованы для биологических исследований опухолей6. Представитель МОДЕЛИ PDX являются эктопически опухолевых ксенотрансплантата мышей, которые имеют опухоль в подкожных участках. Большинство исследователей могут сделать операцию для подкожной имплантации без специальной практики7,8. Они также могут контролировать подкожные опухоли легко. Хотя подкожные модели PDX стали популярными на этапе исследования, они имеют некоторые препятствия в переходе к практическому использованию. Подкожная имплантация заставляет пациента полученных опухолей привить в другой микросреде от происхождения опухоли, так что это приводит к поглощению неудачи и медленного роста опухоли 9,10,11, 12,13,14. Ортотопические прививок могут быть более идеальным и рациональным подходом для модели PDX, потому что он использует тот же орган, что и оригинальная опухоль15,16.
Недавно мы разработали протоколы для хирургической ортотопической имплантации методы пациента полученных печени метастатической увеальной меланомы опухолей и методы инъекций иглы с культивируемой человеческой печени метастатической увеальной меланомы клеточной линии в NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) мыши17,18. Протоколы приводят к стабильно высоким техническим показателям успеха. Мы также разработали методы КТ-сканирования, которые полезны для обнаружения внутренних опухолей печени, и мы разработали повторную имплантацию криоконсервированных опухолей на платформе PDX. Мы обнаружили, что модели опухоли опухоли увеальной меланомы поддерживают характеристики первоначальной опухоли печени пациента, включая их гистопатологические и молекулярные особенности. Вместе эти методы обеспечивают лучшую платформу для моделей опухолей опухоли печени ортотопические для увеальной меланомы в трансляционных исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пациенты, зачисленные в исследование, должны предоставить письменное согласие, позволяющее использовать отбрасываемые хирургические образцы для исследовательских целей и генетических исследований, согласно утвержденному Институциональным обзором Протоколом. Этот протокол был выполнен в строгом соответствии с рекомендациями, сошедшей в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения, и одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC).
1. Коллекция свежих опухолевых тканей пациента
- Получение опухолевой ткани, полученной пациентом, после операции или биопсии иглы в больничной операционной.
- Поместите опухолевую ткань в контейнер емкостью 100 мл, содержащий сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) на льду.
- Перенесите ткань в стерильный капюшон (уровень биобезопасности 2) в лаборатории.
- Приступайке к шагу 2 как можно скорее.
ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям безопасности исключить пациентов с известными инфекциями ВИЧ или гепатита В или С.
2. Обработка свежих опухолевых тканей, полученных пациентом
- Поместите ткань в трубку 50 мл, содержащую фосфат-буферный солен (PBS) на льду. Для мытья ткани, добавить PBS в трубку и выбросить PBS из трубки в два раза.
- Перенесите ткань в чашку Петри, содержащую PBS на льду.
- Используя стерильные щипцы и ножницы, удалите некротические части ткани. Держите ткань влажной и холодной во время шагов от 2,3 до 2,5. Для образцов биопсии иглы пройдите шаг 2.3 и 2.5 и не режете образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некротические ткани часто распадаются легко при прикосновении. - Нарежьте ткань на 1 мм3 кубиками для хирургической имплантации печени.
- Остальную часть ткани нарезать кубиками в чашке Петри.
- Перенесите их в 1,7 мм микротрубку с 4% формалином для гистологического анализа и в другую трубку для геномного и протеомного анализа.
- Поместите микротрубки в банку с жидким азотом с жидким азотом. Перенесите трубки в морозильную камеру -80 градусов для постоянного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время между удалением образца у пациента и обработкой тканей не должно превышать 30 мин.
3. Хирургическая имплантация печени с опухолевыми тканями, полученными пациентом
- Спрей все объекты, поступающие в капот для хирургии с 70 % этилового спирта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это включает в себя хирургические инструменты, грелки и анестезии машины. - Измерьте вес ватного тампона и листа ткани.
- Обезливить мышь с 3-5% изофруран испаритель, поместив его в индукционной камере.
- После того, как мышь полностью обезврежена, поместите ее в положение на спине на грелку. Поместите изофларан конус на музу мыши, чтобы вдохнуть 1,5-3% изофларан для поддержания анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна быть на грелке в течение всей процедуры. Отсутствие отопления может вызвать переохлаждение. - Подтвердите правильную анестезию без реакции, когда нога мыши колота ультратонкими щипками.
- Вводят бупренорфин (0,6 мг/кг) подкожно на фланге с помощью 27 G иглы на микро шприц перед операцией.
- Нанесите 70% этилового спирта на брюшную полость и распределите мех вверх и вниз. После распространения меха, подтвердить более легкую визуализацию кожи ниже левой подковылевой области для более легкого разреза. Не сбрить мех с живота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мех будет скрывать разрез сайт после операции и предотвратить мышь от царапин разреза после операции. Тем не менее, вы можете побрить мех, чтобы предотвратить заражение разреза сайта в соответствии с институциональными стандартами. - Нанесите йод и дайте ему впитаться в кожу.
- Поместите стерильную хирургическую драпировку с отверстием 2 см на мышь.
- Поднимите брюшную кожу с изогнутыми ультратонкими щипками и сделать 1 см поперечный левый разрез подковыловой кожи с изогнутыми ножницами.
- Вставьте кончик изогнутых ножниц под кожу разреза и слегка откройте их, чтобы отделить перитонеум от кожи. Убирать ножницы от разреза с закрытыми лезвиями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие и закрытие ножниц внутри мыши может привести к повреждению и кровотечения. - Найдите печень под перитонеум. Подтвердите темно-красноватый цвет через перитонеум.
- С изогнутыми ножницами, сделать 1 см поперечного разреза в перитонеуме. Если перитонеальная артерия кровоточит от переднего края, немедленно остановить кровотечение с каутерии.
- Захватите жировую ткань с помощью изогнутых ультратонких щипцы с одной стороны, вставьте край ватного тампона под левую доли печени и свернуть тампон вниз с другой стороны, чтобы вывести печень.
ПРИМЕЧАНИЕ: Захват жировой ткани важно сохранить жировой ткани от прилипания к ватным тампоном. - Экстерьер печени на ватный тампон и поместить печень на нетканый абсорбирующим листом ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань лист играет две основные роли в стабилизации печени и поглощения кровоизлияния. - Сделайте разрез шириной 5 мм и глубиной, используя стерильное лезвие скальпеля No 11, чтобы сформировать карман в паренхиме, мягко нажимая место разреза ватным тампоном.
- Вставьте лезвие параллельно с поверхностью печени и вырезать горизонтально.
- Нажмите разрез сайта с ватным тампоном, чтобы остановить любое кровоизлияние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите лезвие вертикальным, иначе вы прорветесь через печень и травмируете крупные сосуды в середине печени.
- Roll ватный тампон вверх, чтобы открыть разрез и имплантировать 1 мм3 куба опухолевой ткани в карман с изогнутыми ультратонкими щипками. Убирайте щипцы во время прокатки ватный тампон в обратном вращении и нажатия вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нажатие на место разреза с ватным тампоном при уходе щипцы помогает предотвратить перемещение опухоли в кармане. - Аккуратно снимите ватный тампон с места разреза после имплантации. Приступайке к шагу 3.19 как можно скорее.
- Положите абсорбируемый гемостат на место разреза.
- Подтвердите гемостаз. Если кровотечение продолжается, добавьте больше hemostat на месте разреза.
- Очистите печень от листа ткани с щипками (желательно тупым-конец) и положить печень обратно в брюшной полости.
- Шов перитонеума с двойной лигатурой с использованием 5-0 поглощаемых шов.
- Шовная кожа с тройной лигатурой с использованием 5-0 поглощаемого шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тройная лигатура помогает предотвратить хирургическое отделение разреза. - Наблюдайте за мышью до полного пробуждения и поставьте ее обратно в клетку.
- Измерьте вес ватного тампона и листа ткани с кровью для кровотечения объема во время хирургии. Сравните их с их первоначальными весами перед операцией. Уменьшите кровотечение во время операции до менее чем 10% циркулирующего объема крови в мыши.
4. Сбор и обработка культурных печени человека метастатические Увеальной меланомы клеточной линии
- Подготовьте культивированные клетки.
- Собирайте ячейки и вычисляйте номер ячейки с помощью счетчика ячеек.
- Подготовьте соответствующее количество клеточной подвески для 10,0 х 106 ячеек в трубке 15 мл.
- Спин трубки на 300 х г в течение 5 минут в центрифуге при комнатной температуре.
- Удалите супернатант в трубке 15 мл. Оставьте клетку гранулы в нижней части трубки.
- Добавьте 50 кЛ rpMI 1640 средних в трубку 1,7 мл.
- Вырежьте кончик кончика 200 л с ножницами, чтобы увеличить наконечник открытия.
- Добавьте 60 зл и подвальной мембранной матрицы с помощью пипетки с наконечником разреза в трубку 1,7 мл, которая имеет RPMI.
- Смешайте RPMI и матрицу в трубке 1,7 мл. Вортекс его.
- Добавьте 110 л смеси в клеточную гранулу в трубке 15 мл. Перенесите подвеску клетки в новую трубку 1,7 мл.
- Держите трубку на льду перед инъекцией иглы.
5. Хирургическая имплантация иглы культовой метастатической увеальной меланомы клеточной линии в печень
- Следуйте вышеуказанному протоколу со ступеней 3.1 до 3.15.
- Соберите клеточную подвеску с помощью микросиринга с помощью иглы 27 G.
- Вставьте иглу вдоль поверхности печени и продвигайте кончик иглы на 5 мм глубже.
- Введите в печень 20 л клеточной суспензии.
- Каутеризизировать точку вставки печени, чтобы предотвратить вводили клетки от утечки. Подтвердите гемостаз.
- Следуйте вышеуказанному протоколу со ступеней 3.21 до 3.24.
6. Компьютерная томография
- Поместите мышь в удерживатель в бодрствуя состоянии.
- Протрите хвост стерильной спиртовой площадкой для дезинфекции и вазодилатации.
- Введите 100 л контрастного вещества КТ через хвостовую вену с иглой 27 G на шприц 1 мл.
- Подождите 4 ч после инъекции, прежде чем принимать КТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет 4 ч, пока агент не берется печени Kupffer клеток. - Через четыре часа после инъекции, анестезирует опухолевую мышь с 3-5% испаряется изофруран, поместив его в индукционную камеру.
- После того, как мышь полностью анестезируется, поместите его в подверженное положение на CT. Поместите изофларан конус на музу мыши, чтобы вдохнуть 1,5-3% изофлюран для поддержания анестезии.
- Подтвердите правильную анестезию без реакции, когда нога мыши колота ультратонкими щипками.
- Сделать компьютерную томографию в течение 15 минут.
- Убедитесь, что мышь, пока она полностью проснулся после КТ и положить его обратно в клетку.
- Оцените наличие опухоли и измерьте размер опухоли на КТ-изображениях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрастный агент усиливает нормальную печеночную паренхиму так, что легко распознать неувеличенную опухоль. Не истолковывать желчный пузырь и желудок как опухоль.
7. Сбор урожая и обработки тканей
- Эвтаназия мышей с использованием CO2 следуют вывихшей шейки матки, поместив указательный палец и большой палец за череп омичей и потянув тело у основания хвоста. Приступайке к шагу 7.2 как можно скорее.
- Поместите мышь в положение на спине и опрыскивать живот с 70% этилового спирта.
- Используйте стерильные щипцы и стерильные ножницы, чтобы сделать 3-см поперечного разреза ниже процесса сифоида, чтобы разоблачить органы брюшной полости.
- Вырезать опухолевой ткани и выполнить шаги 2,1 до 2,2.
- Остальную опухоль нарезать кубиками 2 мм в чашке Петри.
- Перенесите их в криогенную трубку с криоминоином для повторной имплантации после криоконсервации.
- Положите трубки в криогенный замораживающий контейнер, наполненный изопропанолом.
- Перенесите контейнер в морозильную камеру -80 градусов для временного хранения. Не кладите криотубс с криоминимом непосредственно в резервуар с жидким азотом. Заморозить их медленно со скоростью охлаждения -1 кс / мин, чтобы сохранить ткани опухоли.
- На следующий день перенесите трубки в резервуар с жидким азотом для постоянного хранения.
8. Повторная имплантация
- Храните трубки замороженные в жидком азоте банку с жидким азотом до готовности к имплантации ткани. Свести к минимуму воздействие ткани на комнатную температуру для поддержания жизнеспособности и повышения шансов на прививок.
- Оттепель криоконсервированная трубка в водяной бане 37 градусов.
- Выполните шаги 2.2-2.4.
- Имплантация оттаяла опухоль в мышей, как описано в шагах 3.1-3.24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хирургическая ортотопическая имплантация с помощью метода кармана печени может пересадить метастатическую опухоль увеальной меланомы печени человека в печень мыши с высоким показателем успеха 80% в течение шести месяцев. Опухоль ксенотрансплантата прививается в печени как одиночная опухоль без узлов дочери(Рисунок 1 и Рисунок 3A). Хирургическая техника инъекций ортотопических инъекций в печень с помощью микроиглы успешно привили культивированные человеческие клетки метастатической увеальной меланомы в печени во всех случаях(Рисунок 2 и Рисунок 3B). Тем не менее, некоторые случаи были распространения вокруг основной опухоли. Контрастный агент обнаруживает опухоли в печени на КТ, в том числе небольшие опухоли размером 1 мм(рисунок 3B). Повторная имплантация криоконсервированных опухолей успешно установила их в печени мыши с высокими показателями успеха. Повторно имплантированные опухоли ксенотрансплантата после криоконсервации сохраняют характеристики оригинальных опухолей пациента и предкриоконсервированных опухолей.
Рисунок 1: Пациент полученных опухоли ксенотрансплантат мыши модели хирургической ортотопической имплантации печени. Мышь усыпили через 6 месяцев после имплантации опухоли. Пигментированная черная опухоль (черная стрелка) - это увеальная меланома. Опухоль прививается в левую дочку печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Печень ортотопические человеческой клеточной линии полученных опухоли ксенотрансплантат мыши модели с использованием метода инъекции иглы. Мышь усыпили через 8 недель после инъекции опухоли. Пигментированная черная опухоль (черная стрелка) - это увеальная меланома. Опухоль прививается в левую дочку печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: КТ изображения опухолей печени в левой доле печени. Опухоли печени обнаруживаются на повышенной КТ. Нормальная ткань печени усиливается контрастным агентом. Белые стрелки указывают на желудок рядом с печенью. (A) Опухоль (черная стрелка), которая ранее была показана на рисунке 1. Хирургическая ортотопическая имплантация образует одиночную опухоль. (B) Опухоли (черная стрелка), показанные ранее на рисунке 2. Метод инъекции иглы образует кластер из многих мелких опухолей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Технические советы для метода кармана печени. (A-C) Левая доли (белые стрелы) печени может быть выставлена из живота с помощью ватного тампона (черная стрелка) через разрез 1 см. Ретрактор не требуется для расширения разреза. (D) Хлопок тампон нажимает на разрез мягко. Он получает гемостаз после делать разрез скальпелем (зеленая стрелка). (E) Хлопок тампон катится вверх (изогнутая красная стрелка). Это поднимает печеночной паренхимы, чтобы открыть разрез. Опухоль желтая стрелка) вставляется в карман печени через разрез ультратонкими щипцы (голубая стрелка). (F) Хлопок тампон катится вниз (изогнутая красная стрелка), чтобы предотвратить вставленную опухоль в кармане от резервного копирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Современные ортотопические модели ксенотрансплантата трудоемкие, трудоемкие и дорогостоящие в создании. Ортотопические опухоли ксенотрансплантат мыши модели для рака печени были созданы более двух десятилетий назад19,20,21. Тем не менее, эта техника является сложной и требует использования специального оборудования, таких как микро-иглы держатель и 6-0 до 8-0 тонкие швы под микроскопом. Опухоли и нормальной ткани печени должны быть зашиты тщательно, чтобы шов не повредить хрупкой ткани печени. Обычные методы приводят к осложнениям, таким как гематома и некроз22. Недавно, модифицированная техника была разработана для решения этих проблем23. Этот модифицированный метод использует абсорбируемые гемостатические материалы вместо шва, чтобы покрыть опухоль на поверхности печени. Однако, этот модифицированный метод не полностью покрывает опухоль в печени паренхимы. Часть опухоли подвергается воздействию снаружи. Мы разработали хирургическую ортотопическую имплантацию метод -печеночный карман метод- для размещения опухоли полностью внутри паренхимы18. Наш метод делает карман в печени, чтобы обеспечить естественную среду для опухолей. Метод кармана печени проще, чем обычная техника, что позволяет нам закончить имплантацию в печень в течение нескольких минут с начала операции. Этот метод приводит к образованию одиночной опухоли в печени и не вызывает метастазы, по крайней мере до тех пор, как мы наблюдали мышей, в то время как инъекции иглы одной клеточной суспензии, как правило, распространяются как внутрипеченочные метастазы17. Одиночная опухоль является более целесообразным для оценки роста опухоли и было бы полезно для оценки эффективности в испытании препарата.
По сравнению с оригинальным методом кармана печени18, мы изменили наши методы для повышения методов имплантации. Во-первых, ретрактор не был использован во время операции, чтобы свести к минимуму размер разреза. Когда разрез меньше, мы можем сократить время шитья в хирургии. С разрезом 1 см в животе, мы можем легко вывести левую долбу снаружи с ватным тампоном(рисунок 4A-C). Во-вторых, ватный тампон играет три важные роли, остановив гемостаз после принятия карман печени, открыв карман печени, чтобы иметь возможность вставить кусок опухоли и сохраняя кусок опухоли в кармане, не толкая опухоль назад (Рисунок 4D- F). Средний объем кровотечения составил примерно менее 10% циркулирующего объема крови у мышей. Меньшее кровотечение обеспечило большую уверенность в хирургии. В-третьих, лист ткани полезен для фиксации доли печени вне живота. Доли печени прилипает к листу и, таким образом, предотвращает сползание доли обратно в брюшную полосу(рисунок 4C). Можно легко вырезать поверхность печени скальпелем и ввести иглу на поверхность печени. В результате хрупкая ткань печени не повревынесенна.
Мы представляем есть два совета по устранению неполадок для этого метода. Во-первых, когда используется небольшой участок разреза, иногда левая доли не видна. В этой ситуации левая доли, скорее всего, прилипает к диафрагме. Вставьте притупленные щипчи между левой долей и диафрагмой, чтобы снять долбу. Во-вторых, когда кусок опухоли помещается в карман печени с щипками, опухоль может прилипнуть к щипчу и отступить с ним. Нажмите разрез с ватным тампоном, отступая щипцы. Это хорошо работает, чтобы предотвратить вывих опухоли из кармана.
Опухоли ксенотрансплантата окружены мышечной тканью, даже если они ортотопически имплантированы. Стромальные клетки человека в опухолях, полученных пациентом, неизбежно заменяются стромальными клетками мыши. В идеале, модель мыши лучше обеспечить человека стромальной ткани вокруг опухолей. Химерная гуманизированная печень мыши или гуманизированные модели иммунной мыши было бы полезно изучить прививок увеальной меланомы и оценить, является ли метаболизм наркотиков таким же, как человека печени или человека иммунной среды24,25.
Ортотопические опухоли печени ксенотрансплантат мыши модели требуют проверки опухоли создания с визуализации исследований. Коммерчески доступный контрастный агент КТ, разработанный для изображений печени мыши, позволяет обнаруживать внутренние опухоли печени в живом состоянии на КТ. Контрастный агент специально повышает нормальную печень на КТ. Легко различить неувеличенный участок опухоли26. Агент обнаруживает крошечные опухоли менее 1 мм (дочь конкреций) вокруг основных опухолей на КТ. Агент может быть терпимо мыши, и позволяет контролировать опухоли печени периодически. Агент будет использоваться для оценки эффективности противораковых препаратов против печени локализованных опухолей ксенотрансплантата.
Как правило, рекомендуется поддерживать модели PDX на относительно низком количестве прохода (менее 10), чтобы сохранить генетическую и гистологическую целостность первоначальной опухоли, полученной из пациента27,28,29. Большинство исследователей воздерживаются от нескольких проходов моделей PDX, чтобы уменьшить количество проходов и животных. После того, как пациент полученных опухолей временно сохраняются в морозильной камере, мы можем контролировать модели PDX на более низкий номер прохода, не тратя мышей. Это называется биобанковской стратегией. Биобанк рака является рациональным подходом для поддержания характеристик опухоли и уменьшить количество мышей28,30. Создание надлежащего биобанковского метода может скорректировать поставку моделей PDX для удовлетворения плана лечения пациента или мыши наркотиков эффективность испытания в будущем. Мы добились повторной имплантации криоконсервированных опухолей для рака биобанкинга. Мы надеемся, что этот успех облегчает использование платформы PDX в ближайшем будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны М. Охаре, К. Сайто и М. Тераи за обзор рукописи. Авторы признают критический отзыв для редакционной и английской помощи этой рукописи д-р Р. Сато в Фокс Чейз онкологический центр. Работа, описанная в настоящем номере, была поддержана Исследовательским фондом Бонни Кролл, Исследовательским фондом Марка Вайнцирля, Исследовательским фондом меланомы глаз при Университете Томаса Джефферсона, Общественным фондом Осаки и Грантовым номером JP 18K15596 в городе Осака Университет. Исследования в лаборатории доктора А. Аплина были поддержаны грантом NIH R01 GM067893. Этот проект был также профинансирован Дина Преобразующей науки премии, Томас Джефферсон университета Программная инициатива премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1x, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 mL TB syringe with 27 G needle | BD | 309623 | |
| 1.7 mL tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27 G needle | BD | 780301 | |
| 27 G needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µL micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µL micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μL tip |
References
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
