キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子免疫療法用
Summary
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を確実に生成し、その分化と機能をインビトロとインビボでテストするアプローチについて説明します。
Abstract
養子免疫療法は、癌および感染症の治療のための約束を保持します。キメラ抗原受容体(CAR)で原発性ヒトT細胞を転行し、子孫ex生体内を拡張する簡単なアプローチについて説明します。CAR発現を測定するアッセイと、分化、増殖能力、細胞溶解活性を測定します。CAR T細胞におけるエフェクターサイトカイン産生および炎症性サイトカイン分泌を測定するアッセイについて説明する。当社のアプローチは、養子免疫療法の前臨床モデルのためのCAR T細胞を培養するための信頼性の高い包括的な方法を提供します。
Introduction
キメラ抗原受容体(CAL)は、T細胞を異なる腫瘍抗原に対してリダイレクトする有望なアプローチを提供する。CARは抗原標的に結合する合成受容体である。正確な構成は可変ですが、CAL には通常 3 つの異なるドメインが含まれています。細胞外ドメインは、標的抗原への結合を指示し、典型的には、細胞外ヒンジを介してCARに連結された単一鎖抗体断片から構成される。第2のドメインは、一般的にT細胞受容体(TCR)複合体のCD3度鎖に由来し、CAR関与に続いてT細胞活性化を促進する。第3の共刺激ドメインは、T細胞機能、生着、代謝、および持続性を増強するために含まれる。B細胞急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)および多発性骨髄腫を含む種々の造血悪性腫瘍におけるCAR T細胞療法の成功は、このアプローチの治療上の約束を強調する1、2、3、4、5、6である。最近の食品医薬品局(FDA)の2つのCD19特異的CAR T細胞療法の承認は、小児および若年成人ALLのためのチザゲンレクリューセルおよびびまん性大細胞リンパ腫のためのアクシキャブタジーンシロロイセルであり、CAR T細胞療法の翻訳上のメリットを強化する。
CAR Tベースのアプローチは、末梢血からのT細胞の単離、活性化、遺伝子組換え、および拡張ex生体内を含む。分化はCAR T細胞の有効性を調節する重要なパラメータである。したがって、ex vivo培養中にT細胞分化を制限することは、注入された生成物が生着、拡大、および持続する能力を高め、養子移送2、7、8、9に続く長期免疫サーベイランスを提供する。T細胞は、ナイーブT細胞(Tn)、中央メモリ(Tcm)、エフェクターメモリ(Tem)、エフェクター分化(Tte)および幹細胞メモリ(Tscm)を含むいくつかの異なるサブセットで構成されています。エフェクター分化T細胞は強力な細胞溶解能を有する;しかし、彼らは短命であり、貧しい10、11、12を生み出します。対照的に、ナイーブT細胞およびTcmを含むあまり分化していない表現型を有するT細胞は、養子細胞移動13、14、15、16、18に続く優れた生着および増殖能力を示す。前製造された製品で収集されたT細胞の組成は、患者間で変化し得るし、CAR T細胞の治療可能性と相関する。開始アフェレシス産物におけるナイーブ様免疫フェノータイプを有するT細胞の割合は、生着および臨床応答19の両方と非常に相関している。
培養持続時間は、養子転法のために調製されたCAR T細胞における分化に影響を及ぼす重要なパラメータである。我々は最近、略培養パラダイム20を用いて優れた品質のCAR T細胞を生成するアプローチを開発した。我々のアプローチを用いて、限られた培養が優れたエフェクター機能を有するCAR T細胞を生じ、白血病の異種移植片モデルにおける養子移入に続く持続性を生み出すことを示した。ここでは、CART19細胞(CD3級および4-1BBシグナル伝達ドメインに付着した抗CD19 scFvを発現するように設計された自己T細胞)を確実に生成するアプローチを提示し、採用転写前のCAR Tの生理活性および有効性に関する洞察を提供するアッセイの詳細な説明を含む。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ex vivo培養を通じて様々な間隔で採取したCAR T細胞の機能と有効性を測定するアプローチについて説明します。当社の方法は、増殖能力とインビトロでのエフェクター機能を評価するように設計されたアッセイに関する包括的な洞察を提供します。3日目から9日目に採取したCAR T細胞を用いたCARおよび白血病の異種移植片モデルを介したCARおよび詳細異種移植モデルを介してCAR T細胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ペンシルベニア大学(マイケル・C・ミローン)やセント・ボールドリック財団奨学生賞(サバ・ガセミ)との研究アライアンスを通じて、ノバルティス・ファーマシューティカルズが提供する資金を通じて一部支援されました。
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
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