Summary
ここでは、細胞および脳組織中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示し、免疫蛍光染色およびDNAドットブロット法を利用する。
Abstract
哺乳類ゲノムでは複数のDNA修飾が同定されている。そのうち、5-メチルサイトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシン媒介エピジェネティックメカニズムが集中的に研究されている。5-ヒドロキシメチルシトシンは、脳の胚および出生後の発達中に動的特徴を示し、遺伝子発現の調節機能を果たし、複数の神経障害に関与している。ここでは、マウスの培養細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出する免疫蛍光染色およびDNAドットブロットを含む詳細な方法について説明する。
Introduction
DNA修飾、ヒストン修飾およびRNA修飾を含むエピジェネティック修飾は、多様な生物学的プロセスおよび疾患1、2、3において重要な機能を果たすることが示されている。4,5,6,7.長い間、DNAメチル化(すなわち、5-メチルサイトシン(5-mC))は、非常に安定なエピジェネティックマーカーと見なされており、ゲノム内で更に改変することはできません。最近では、TET1、TET2、TET38、9を含むTET(11-11転座)ファミリータンパク質により、5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に5-mCを酸化することができることが分かっています。さらなる研究は、5-hmCが安定したマーカーとして機能し、遺伝子発現4、10、11、12を調節することにより生物学的役割を果たすことができることを示しています。
本示の証拠は、5-hmCが哺乳動物の他のタイプの組織に対して神経組織/細胞において非常に濃縮され、神経発達13、14の間に動的特徴を示すことを示している。神経系では、5hmC媒介エピジェネティック修飾は、神経幹細胞、神経活動、学習および記憶を調節する上で重要な役割を果たし、レット症候群、自閉症、アルツハイマー病を含む複数の神経疾患に関与している。病気、ハンチントン病等 2,13,15,16,17,18,19,20.
細胞および組織の5-hmCを検出するためのいくつかのアプローチがあります14,21,22,23,24.ここでは、5hmCの存在を検出し、5-hmCのグローバルレベルを定量化する2つの方法について述べています:免疫蛍光染色とDNAドットブロット。これらの2つの方法は便利で敏感であり、以前の研究25、26、27、28、29、30で正常に使用されている。これら2つの方法の重要なステップは、DNAの脱彩化です。5-hmCの免疫蛍光染色のためには、1M HClを有する試料の前処理が必要である。5hmCドットブロットの場合、DNAの退化はNaOH溶液で行われます。これらの2つの方法と次世代シーケンシングは、5-hmCの機能を調るための非常に有用なツールです。
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Protocol
すべての動物の手順は浙江大学の動物倫理委員会によって承認されています。
1. 成人神経幹細胞とニューロンの培養
- 成人の前脳から成体神経幹細胞を分離する(8〜10週齢)C57/BL6雄マウスは、前述の31,32である。
- 20 ng/mL FGF-2を含むDMEM/F-12培地中の成人神経幹細胞、20ng/mL EGF、2%B27サプリメント、1%抗生物質抗マイコティック、および2mM L-グルタミンを37°Cで5%CO2インキュベーターで培養した。前述の31,32に記載されているように、1 μMレチノイン酸と5μMフォルスコリンを用いて成体神経幹細胞の分化を誘導する。
- 胚性17日目(E17)からニューロンを分離し、前述したように37°Cで5%CO2インキュベーターで0.25%L-グルタミン、0.125%グルタマックスおよび2%B27サプリメントを含有する神経基底培地を有するマウスおよび培養物を有する。
2. マウスの心筋灌流
- 実験の1日前に10%の塩素水和物、4%のパラホルムアルデヒド(PFA)およびリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を調べ、4°Cで保存する。
- 成人男性または女性のC57 BL/6Jマウスを10%の塩素水和物(50mg/kg、i.p.)で麻酔し、身体反応を確認して動物が深く麻酔されていることを確認します。プラスチック製のボード(フェイスアップ位置)に粘着テープで各手足を固定します。
- 皮膚を切り、その後、手術はさみで筋肉を切る。外科はさみで胸腔を開きます。心臓を露出し、細かい外科用ハサミで右心房の小さな部分を切り取ります。
- 冷たいPBS(成人マウスあたり約30 mL)で左心室から10 mLの使い捨て滅菌注射器でマウスを透過します。
- 4%のPFA(成人マウス1匹につき約30mL)でマウスを固くなるまで透過する。
- 骨鉗子でマウスの頭蓋骨を開きます。脳を取り出し、4°Cでポスト固定のための15 mL遠心管で4%PFAの5 mLに入れます。
注:手術が終わったら外科領域をきれいにしてください。 - 少なくとも24時間後、脳サンプルを30%のショ糖溶液に移し、4°Cで完全な脱水を行う。
3. 脳の切除
- 脳サンプルを最適な切断温度化合物(OCT)に小さな容器に埋め込み、-20°Cで少なくとも1時間冷やします。
- セクション脳は、クライオスタットマイクロトームを使用して20〜40μmの厚さでサンプルを採取する。
- PBSにセクションを収集し、4 °Cで保存します。
4. 免疫蛍光染色
- 標的となる脳領域を持つセクションをピックアップし、PBSと24ウェルプレートに入れます。カバースリップ上の培養セルの場合は、手順 4.2 に直接移動します。
- 室温でPBSで10分間洗い、もう2回繰り返します。
- PBSを取り出し、37°Cで30分間予熱した1 M HClで治療する。
注:塩酸を1mL添加して1M HClを調製(36-38%)化学フードの水の10 mLに。インキュベーターで予熱1M HClを37°Cで予熱する。 - PBSで5分間洗浄し、これをもう2回繰り返します。
- 室温でシェーカーに3%の正常なヤギの血清および0.1%のトリトンX-100を含むPBSを含むブロックサンプル。
- シェーカー上の4°Cで一晩、特異的な一次抗体を持つ切片をインキュベートする。
注:以下の一次抗体を使用する:ポリクローナルウサギ抗体抗5−ヒドロキシメチルシトシン(1:5,000)、マウスモノクローナル抗体抗体NeuN(1:500)。 - サンプルを取り出し、さらに室温で1時間インキュベートします。
- PBSで10分間洗浄し、これをもう2回繰り返します。
- シェーカー上で1時間室温で一次抗体に対応する二次抗体をインキュベートする。プレートをアルミで覆います。
注:次の二次抗体を使用する:アレクサフルー488ヤギの抗ウサギIgG(1:500)、アレクサフルーラ568ヤギの抗マウスIgG(1:500)。4'--6-ダイアミディーノ-2-フェニリンドール(DAPI)で核をカウンターステインします。 - サンプルをPBSで10分間シェーカーで洗います。もう一度繰り返します。
- スライドに脳のセクションを取り付け、適切な量のアンチフェード取り付け媒体(約100〜150 μL)を追加し、プレミアムカバーガラスでカバーします。マニキュアでシール。
- 通常または共焦点蛍光顕微鏡で画像を撮影します。
5. ゲノムDNA分離
- 子宮頸部脱臼により成人C57 BL/6Jマウス(雄または女性)を安楽死させ、脳を取り除く。
- 海馬、皮質、小脳組織を氷冷皿で解剖する。1 mLのDNAリシスバッファーで組織粉砕機で組織を粉砕し、きれいなマイクロ遠心管に移します。600 μL のリシス バッファーあたり 250 μg のプロテイン数 K を追加します。細胞ペレットの場合は、リシスバッファー、プロテポネサーゼKを直接追加し、十分に混合します。
注:DNAリシスバッファーを調製: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM トリス-HCl, pH 8.5.実験の前にティッシュグラインダーを洗浄し、オートクレーブします。 - 2日目には、37°Cで少なくとも12時間の試料当たりRNase Aの約50μgを添加する。
- フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を同量に加え、完全に混ぜます。
- 20,817 x gで15分間遠心分離機を使用し、上清を新しいマイクロ遠心管に取り除きます。
- 上清に600μLのクロロホルムを加えてDNAを沈殿させ、十分に混ぜます。
- 20,817 x gで15分間遠心分離機を使用し、上清を別の新しいチューブに取り除きます。
- 上清に500μLのイソプロパノールを加え、十分に混ぜます。
- 遠心分離機を20,817 x gで15分間、上清を完全に取り除きます。
- 70%エタノールの1mLで沈殿物を洗浄し、遠心分離機を20,817 x gで1分間洗浄し、上清を完全に除去する。1 回繰り返します。
- DNAペレットを完全に乾燥させます。
- トリス-HClバッファー(pH 8.5)でDNAペレットを適切な濃度に溶解します。
6. DNAドットブロット
- 溶液を準備する:2 M NaOH、トリス-HClバッファー(pH 8.5)、6x生理食塩水クレート(SSC)。
- サンプルの混合物を表 1にします。
- DNAサンプルを100°Cで10分間変性し、氷上で冷却します。
- ナイロン膜の適切なサイズ(例えば、ハイボンド-N+)をカットし、6x SSCですすいでください。
- ドットブロット装置に膜を置き、真空ポンプに接続します。膜上のドットあたりの混合物のスポット6 μL。
- 80°Cで30分間ハイブリダイズし、トリスバッファー生理生理生理(TBS)で無脂肪牛乳でサンプル膜を1時間ブロックします。
- 一次抗体を一晩4°Cでインキュベートする。
注:以下の一次抗体:ポリクローナルウサギ抗5−ヒドロキシメチルシトシン(1:5,000)。 - 2日目は、試料膜を室温で1時間インキュベートし、TBSで10分間洗い流します。
- 抗ウサギ二次抗体(1:5,000)で膜を室温で30分間インキュベートします。
- TBSで10分間洗い、この洗い直しをもう2回繰り返します。
- 化学発光信号を可視化し、信号強度を定量します。
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Representative Results
成体マウスの海馬における5hmCの分布を明らかにするために、神経細胞(NeuN)および5-hmCに対する抗体を用いて免疫蛍光を行った。海馬では、5-hmCがニューロン細胞マーカーNeuN(図1A-H)とうまく共局在し、ニューロン中の5-hmCの濃縮を示唆した。
神経発達中の5hmCのダイナミクスを決定するために、ドットブロットは、増殖および分化した成人神経幹細胞(NSC)から単離されたDNAサンプルを用いて最初に行われた。ドットブロットの結果は、NSC(図2A-B)の分化中に5-hmCのグローバルレベルが有意に増加したことを示した。また、ドットブロットの結果は、ニューロン中の5hmCのレベルがNSC(図2C-D)よりも有意に高いことを示し、ニューロン発達中の動的な5-hmC修飾を示唆した。
図1:成体マウスの海馬における5-hmCの免疫蛍光染色5-hmCは神経細胞マーカーNeuNとうまく共局在した。スケールバー = 100 μm (A-D);50 μm (E-F)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成体神経幹細胞およびニューロンにおける5-hmCのDNAドットブロット検出(A)増殖(Proli)および分化(Diffe)条件下でのNSCの5-hmCドットブロット。(C)NsCおよび一次ニューロンの5-hmCドットブロット。メチレンブルー染色(B,D)は、それぞれ(A)および(C)における各濃度におけるゲノムDNAの等しい負荷を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 200 ng/ドット | 400 ng/ドット | 1,000 ng/ドット | |
| Dna | 470 ng | 940 ng | 2,350 ng |
| 2 M ナオ | 2.81 μL | 2.81 μL | 2.81 μL |
| トリス-HCl バッファ、pH 7.5 | 体積を最大 14.06 μL にする |
表1:ドットブロットのサンプルの調製
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Discussion
エピジェネティック修飾は、脳の発達、成熟、および機能の間に重要な役割を果たします。DNA修飾の安定したマーカーとして、動的5-hmCは行動適応、神経活性に応答し、遺伝子発現と正の相関関係がある。したがって、脳および神経障害4の正常な機能に関与している。細胞や組織におけるその機能を探索するには、5-hmCの存在を検出し、治療前と治療後のレベルを比較する必要があります。ここでは、細胞や組織の5hmCを検出する2つの便利な方法を示しました。
免疫蛍光染色およびDNAドットブロットを用いて5-hmCを検出する主な試薬は、5-hmC抗体である。この方法で使用される5-hmC抗体は、高感度であることが証明されており、非常に特異的である。5hmC染色では、HClを用いてDNAの脱彩が必要です。HClを用いて組織および細胞を適切に治療することは、完全なDNAの不飽和のために重要であり、結果に影響を与えます。DNAドットブロットは、5-hmCの量を定量する敏感な方法であり、質量分析よりもはるかに便利です。ドットブロットを成功させるためには、DNAサンプルを膜に正確に広げる必要があります。さらに、メチレンブルー染色は、DNAサンプルが均等にロードされたかどうかを判断するのに役立ちます。なお、ここで説明する方法は、複数のタイプの細胞および組織における5-hmCのグローバルレベルを検出する。他の塩基に対する5hmCの量を測定し、ゲノム中の分布特徴を区別するには、LC-MS/MSと次世代シーケンシングが必要です。
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Disclosures
競合する金銭的利益は存在しません。
Acknowledgments
XLは、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFE0196600)と中国国家自然科学財団(助成第31771395号、31571518)によって一部支援されました。Q.S.は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFC1001703)と浙江省の主要研究開発プログラム(2017C03009)の支援を受けました。W.X.は浙江省自然科学財団(LY18H020002)と浙江省科学技術部(2017C37057)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
| Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
| Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
| Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
References
- Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
- Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
- Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
- Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
- Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
- Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
- Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
- Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
- Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
- Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
- Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
- Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
- Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
- Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
- Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
- Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
- Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
- Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
- Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
- Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
- Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
- Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
