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Neuroscience

La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Children's Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine, Zhejiang University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.

Abstract

Se han identificado múltiples modificaciones del ADN en el genoma de los mamíferos. De eso, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina-mediada mecanismos epigenéticos se han estudiado intensamente. 5-hidroximetilcitosina muestra características dinámicas durante el desarrollo embrionario y postnatal del cerebro, desempeña una función reguladora en la expresión génica, y participa en múltiples trastornos neurológicos. Aquí, describimos los métodos detallados incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la mancha de puntos de ADN para detectar 5-hidroximetilcitosina en células cultivadas y tejidos cerebrales de ratón.

Introduction

Se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas, incluidas la modificación del ADN, la modificación de la histona y la modificación del ARN, desempeñan funciones esenciales en diversos procesos biológicos y enfermedades1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Durante mucho tiempo, la metilación del ADN (es decir, 5-metilcitosina (5-mC)) se ha visto como un marcador epigenético altamente estable y no puede modificarse más en el genoma. Recientemente, se ha encontrado que 5-mC podría ser oxidado a 5-hidroximetilcitosina(5-hmC) por TET (diez-once translocaciones) proteínas de la familia incluyendo TET1, TET2, y TET38,9. Otros estudios muestran que 5-hmC podría servir como un marcador estable y desempeñar funciones biológicas a través de la regulación de la expresión génica4,10,11,12.

Las pruebas actuales indican que 5-hmC está altamente enriquecido en tejidos/células neuronales en relación con otros tipos de tejidos en mamíferos, y exhibe características dinámicas durante el desarrollo neuronal13,14. En el sistema neuronal, las modificaciones epigenéticas mediadas por 5 hmC desempeñan un papel importante en la regulación de las células madre neuronales, la actividad neuronal, el aprendizaje y la memoria, y está implicada en múltiples trastornos neurológicos como el síndrome de Rett, el autismo, la enfermedad de Alzheimer enfermedad, enfermedad de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Existen varios enfoques para detectar 5 hmC en células y tejidos14,21,22,23,24. Aquí, describimos dos métodos para detectar la existencia de 5 hmC y cuantificar el nivel global de 5-hmC: la tinción de inmunofluorescencia y el ADN punto-blot. Estos dos métodos son convenientes y sensibles, y se han utilizado con éxito en estudios anteriores25,26,27,28,29,30. Los pasos clave de estos dos métodos son la desnaturalización del ADN. Para la tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC, se requiere el pretratamiento de muestras con 1 M HCl. Para la eliminación de puntos de 5 hmC, la desnaturalización del ADN se realiza con la solución NaOH. Estos dos métodos junto con la secuenciación de próxima generación son herramientas muy útiles para investigar la función de 5 hmC.

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Protocol

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad de Zhejiang.

1. La cultura de las células madre neuronales adultas y las neuronas

  1. Aísle las células madre neurales adultas del antecebrade de un ratón macho adulto (8-10 semanas de edad) C57/BL6 como se describió anteriormente31,32.
  2. Cultivo de células madre neurales adultas en medio DMEM/F-12 que contiene 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, y 2 mM L-glutamina en una incubadora de 5% CO2 a 37 oC. Inducir la diferenciación de las células madre neurales adultas con ácido retinoico de 1 M y forskoline de 5 M durante 48 h como se describió anteriormente31,32.
  3. Aísle las neuronas del hipocampo embrionario 17 (E17) del ratón y el cultivo con un medio neurobasal que contenga de 0,25% de L-glutamina, 0,125% glutaMax y 2% suplemento de B27 en una incubadora de 5% de CO2 a 37 oC como se describió anteriormente33.

2. Perfusión transcardial del ratón

  1. Preparar 10% hidrato cloral, 4% paraformaldehído (PFA) y solución salina tamponada fosfato (PBS) un día antes del experimento, y almacenar a 4 oC.
  2. Anestetiza un ratón c57 BL/6J macho o hembra adulto con un 10% de hidrato cloral (50 mg/kg, i.p.), y asegúrate de que el animal sea profundamente anestesiado comprobando la reacción corporal. Fije cada extremidad con cinta adhesiva en una placa de plástico (en posición boca arriba).
  3. Cortar la piel y luego el músculo con tijeras de cirugía. Abra la cavidad torácica con una tijera quirúrgica. Exponga el corazón y corte una pequeña parte de la aurícula derecha con una tijera quirúrgica fina.
  4. Perfundie el ratón con una jeringa esterilizada desechable de 10 ml del ventrículo izquierdo con PBS frío (alrededor de 30 ml por ratón adulto).
  5. Perfundie el ratón con 4% pfa (alrededor de 30 mL en 10 min por ratones adultos) hasta que esté rígido.
  6. Abra el cráneo del ratón con fórceps óseos. Retire el cerebro y colóquelo en 5 ml de PFA al 4% en un tubo centrífugo de 15 ml para la post-fijación a 4 oC.
    NOTA: Limpie el área quirúrgica una vez finalizada la cirugía.
  7. Al menos 24 h más tarde, transferir las muestras cerebrales en una solución de sacarosa del 30% para una deshidratación completa a 4 oC.

3. Seccionamiento cerebral

  1. Incruste las muestras cerebrales en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) en un recipiente pequeño, y enfríe a -20 oC durante al menos 1 h.
  2. Secciona muestras cerebrales a un espesor de 20-40 m con un microtome de criostato.
  3. Recoger secciones en PBS y almacenar a 4 oC.

4. Mancha de inmunofluorescencia

  1. Recoge las secciones con las regiones cerebrales objetivo y colócalas en una placa de 24 pocillos con PBS. Para las células cultivadas en un cubreobjetos, vaya directamente al paso 4.2.
  2. Lavar con PBS en la coctelera a temperatura ambiente durante 10 min. Repita esto dos veces más.
  3. Retire el PBS y trátelo con 1 M HCl precalentado durante 30 min a 37 oC.
    NOTA: Preparar 1 M HCl añadiendo 1 ml de ácido clorhídrico (36-38%) en 10 ml de agua en una campana química. Precalentar 1 M HCl en la incubadora a 37oC.
  4. Lave las muestras con PBS durante 5 min. Repita esto dos veces más.
  5. Bloquear las muestras con PBS que contengan 3% de suero normal de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 h en la coctelera a temperatura ambiente.
  6. Incubar secciones con anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 oC en la coctelera.
    NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000), anticuerpo monoclonal de ratón anti-NeuN (1:500).
  7. Saque las muestras e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Lave las muestras con PBS durante 10 min. Repita esto dos veces más.
  9. Incubar con anticuerpos secundarios correspondientes a los anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 1 h en la coctelera. Cubra la placa con aluminio.
    NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 cabra anticonejo IgG (1:500), Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG (1:500). Núcleos de contrastaína con 4o-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
  10. Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en la coctelera. Repite esto dos veces más.
  11. Monte las secciones del cerebro en las diapositivas, agregue la cantidad adecuada de medio de montaje antidescoloro (alrededor de 100-150 l) y cubra con vidrio de cubierta premium. Selle con esmalte de uñas.
  12. Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia regular o confocal.

5. Aislamiento genómico del ADN

  1. Eutanasia un ratón adulto C57 BL/6J (masculino o femenino) por luxación cervical y extirpa el cerebro.
  2. Disecciona los tejidos del hipocampo, la corteza y el cerebelo en un plato refrigerado por hielo. Moler los tejidos con una trituradora de tejido en 1 ml de tampón de lisis de ADN y transferirlos a un tubo de microcentrífuga limpio. Añadir 250 g de proteinasa K por 600 ml de tampón de lisis. Para los pellets celulares, agregue directamente tampón de lisis, proteinasa K, y mezcle bien.
    NOTA: Preparar tampón de lisis de ADN: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavar y autoclave la trituradora de tejido antes del experimento.
  3. El segundo día, añadir alrededor de 50 g de RNase A por muestra durante al menos 12 h a 37 oC.
  4. Añadir un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1) y mezclar completamente.
  5. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos y remover el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
  6. Añadir 600 l de cloroformo al sobrenadante para precipitar el ADN, y mezclar a fondo.
  7. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos, y retirar el sobrenadante en otro tubo nuevo.
  8. Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante, y mezclar bien.
  9. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 min, y retirar el sobrenadante por completo.
  10. Lavar la precipitación con 1 ml de 70% de etanol, centrifugar a 20.817 x g durante 1 min, y retirar el sobrenadante por completo. Repita una vez.
  11. Seque el pellet de ADN por completo.
  12. Disolver el pellet de ADN con tampón Tris-HCl (pH 8.5) a la concentración adecuada.

6. Blot de puntos de ADN

  1. Prepare las soluciones: 2 M NaOH, tampón Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato de sodio salino (SSC).
  2. Haga la mezcla de muestra como Tabla 1.
  3. Desnaturalice las muestras de ADN a 100 oC durante 10 minutos y enfríe en hielo.
  4. Corte el tamaño adecuado de la membrana de nylon (por ejemplo, Hybond-N+) y enjuague con 6x SSC.
  5. Coloque la membrana en el aparato de punto-blot y conéctela a la bomba de vacío. Detectar 6 l de mezcla por punto en la membrana.
  6. Hibrida durante 30 min a 80oC y bloquea la membrana de la muestra con leche sin grasa en solución salina tamponada (TBS) durante 1 h.
  7. Incubar con anticuerpo primario a 4oC durante la noche.
    NOTA: el siguiente anticuerpo primario: conejo policlonal anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000).
  8. En el segundo día, incubar las membranas de la muestra a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.
  9. Incubar la membrana con anticuerpo secundario anticonejo (1:5.000) durante 30 min a temperatura ambiente.
  10. Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.
  11. Visualice las señales de quimioluminiscencia y cuantifique las intensidades de la señal.

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Representative Results

Para revelar la distribución de 5 hmC en el hipocampo de ratones adultos, realizamos inmunofluorescencia con anticuerpos contra células neuronales (NeuN) y 5-hmC. En el hipocampo, 5-hmC co-localizado bien con marcador de células neuronales NeuN (Figura 1A-H), lo que sugiere un enriquecimiento de 5-hmC en las neuronas.

Para determinar la dinámica de 5 hmC durante el desarrollo neuronal, primero se realizó un punto-blot con muestras de ADN aisladas de células madre neurales adultas (NSC) que proliferan y diferencian. Los resultados de Dot-blot mostraron que el nivel global de 5 hmC aumentó significativamente durante la diferenciación de NSC(Figura 2A-B). Además, los resultados de dot-blot mostraron que el nivel de 5-hmC en las neuronas era significativamente mayor que el de los NSC(Figura 2C-D),lo que sugiere una modificación dinámica de 5 hmC durante el desarrollo neuronal.

Figure 1
Figura 1: Tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC en hipocampo de ratones adultos. 5 hmC co-localizado bien con marcador de células neuronales NeuN. Barra de escala a 100 m(A-D); 50 m(E-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Detección de punto-blot de ADN de 5-hmC en células madre neurales adultas y neuronas. (A) 5-hmC punto-blot de NSC bajo condiciones de proliferación (Proli) y diferenciación (Diffe). (C) 5-hmC punto-blot de NSCs y neuronas primarias. Tinción azul de metileno (B, D) que indica una carga igual de ADN genómico en cada concentración en (A) y (C), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

200 ng/punto 400 ng/punto 1.000 ng/punto
Adn 470 ng 940 ng 2.350 ng
2 M NaOH 2,81 l 2,81 l 2,81 l
Tampón Tris-HCl, pH 7.5 Hacer que el volumen sea de hasta 14,06 sL

Tabla 1: Preparación de muestras para punto-blot.

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Discussion

Las modificaciones epigenéticas desempeñan un papel esencial durante el desarrollo cerebral, la maduración y la función. Como marcador estable para la modificación del ADN, la dinámica de 5 hmC responde a la adaptación conductual, la actividad neuronal y está correlacionada positivamente con la expresión génica; por lo tanto, está involucrado en la función normal del cerebro y el trastorno neurológico4. Para explorar su función en células y tejidos, es necesario detectar la existencia de 5-hmC y comparar el nivel antes y después del tratamiento. Aquí, demostramos dos métodos convenientes para detectar 5 hmC en células y tejidos, que se podían realizar con equipos comunes en el laboratorio.

El reactivo clave de la detección de 5 hmC con tinción de inmunofluorescencia y el dot-blot de ADN es el anticuerpo de 5 hmC. Se ha demostrado que el anticuerpo de 5 hmC utilizado en el método tiene alta sensibilidad y es muy específico. Para la tinción de 5 hmC, requiere desnaturalización del ADN con HCl. El tratamiento adecuado de los tejidos y células con HCl es fundamental para la desnaturalización completa del ADN y afecta los resultados. El dot-blot de ADN es un método sensible para cuantificar la cantidad de 5 hmC, y es mucho más conveniente que la espectroscopia de masas. Para un punto-blot exitoso, se requiere una difusión precisa de muestras de ADN en la membrana. Además, la tinción azul de metileno ayuda a determinar si las muestras de ADN estaban igualmente cargadas. Cabe destacar que los métodos descritos aquí detectan el nivel global de 5 hmC en múltiples tipos de células y tejidos. Para medir la cantidad de 5 hmC en relación con otras bases y distinguir su función de distribución en el genoma, requiere LC-MS/MS y secuenciación de próxima generación.

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Disclosures

No existen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

XL fue apoyado en parte por el Programa Nacional De I+D clave de China (2017YFE0196600), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 31771395, 31571518). Q.S. contó con el apoyo del Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFC1001703) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Zhejiang (2017C03009). W.X. contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LY18H020002) y el Departamento de Tecnología Científica de la provincia de Zhejiang (2017C37057).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

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References

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Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

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