Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59950

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att detektera 5-hydroximetylcytosin i celler och hjärnvävnader, utnyttjar immunofluorescensfärgning och DNA-punktblot-metoder.

Abstract

Flera DNA-modifieringar har identifierats i däggdjurs arvsmassan. Av detta har 5-metylcytosin och 5-hydroximetylcytosinmedierade epigenetiska mekanismer studerats intensivt. 5-hydroximetylcytosin visar dynamiska egenskaper under embryonal och postnatal utveckling av hjärnan, spelar en reglerande funktion i genuttryck, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar. Här beskriver vi de detaljerade metoder inklusive immunofluorescensteknik färgning och DNA dot-blot att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i odlade celler och hjärnan vävnader av mus.

Introduction

Epigenetiska modifikationer, inklusive DNA-modifiering, histonmodifiering och RNA-modifiering, har visat sig spela viktiga funktioner i olika biologiska processer och sjukdomar1,2,3, 4 , ,5 , 6 , 7. under lång tid har DNA-metylering (dvs. 5-metylcytosin (5-MC)) visats som en mycket stabil epigenetisk markör och kan inte modifieras ytterligare i genomet. Nyligen, det har visat sig att 5-MC kan oxideras till 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) av tet (tio-eleven translokationer) familj proteiner inklusive TET1, TET2, och TET38,9. Ytterligare studier visar att 5-HMC kan fungera som en stabil markör och spela biologiska roller genom att reglera genuttryck4,10,11,12.

De nuvarande bevisen tyder på att 5-HMC är mycket berikat i neuronala vävnader/celler i förhållande till andra typer av vävnader hos däggdjur, och uppvisar dynamiska egenskaper under neuronala utveckling13,14. I neuronala systemet, 5-hmC medierade epigenetiska modifieringar spelar en viktig roll i regleringen av neurala stamceller, neuronala aktivitet, inlärning och minne, och är involverad i flera neurologiska sjukdomar inklusive Rett syndrom, autism, Alzheimers sjukdom, Huntingtons sjukdom, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Det finns flera metoder för att upptäcka 5-HMC i celler och vävnader14,21,22,23,24. Här beskriver vi två metoder för att upptäcka förekomsten av 5-hmC och kvantifiera den globala nivån av 5-hmC: färgning av immunofluorescensteknik och DNA dot-blot. Dessa två metoder är bekväma och känsliga, och har framgångsrikt använts i tidigare studier25,26,27,28,29,30. De viktigaste stegen i dessa två metoder är DNA-denaturering. För immunofluorescenfärgning av 5-hmC krävs förbehandling av prover med 1 M HCl. För 5-hmC dot-blot utförs DNA-denaturering med NaOH-lösning. Dessa två metoder tillsammans med nästa generations sekvensering är mycket användbara verktyg för att undersöka funktionen av 5-hmC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök har godkänts av den Djuretiska kommittén vid Zhejiang-universitetet.

1. kulturen hos vuxna neurala stamceller och nervceller

  1. Isolera vuxna neurala stamceller från framhjärnan hos en vuxen (8-10 vecka gammal) C57/BL6 manlig mus som beskrivs tidigare31,32.
  2. Kultur vuxna neurala stamceller i DMEM/F-12 medium innehållande 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 tillägg, 1% antibiotika-antimykotisk, och 2 mM L-glutamin i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c. Inducera differentiering av vuxna neurala stamceller med 1 μm retinoinsyra syra och 5 μm Forskolin för 48 h som beskrivs tidigare31,32.
  3. Isolera nervceller från den embryonala dag 17 (E17) hippocampi av mus och kultur med neurobasal medium innehållande av 0,25% L-glutamin, 0,125% GlutaMax och 2% B27 tillägg i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c som tidigare beskrivits33.

2. transcardial perfusion av musen

  1. Bered 10% kloralhydrat, 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en dag före experimentet och förvara vid 4 ° c.
  2. Anesthetize en vuxen man eller kvinna C57 BL/6J mus med 10% kloral hydrat (50 mg/kg, i.p.), och se till att djuret är djupt sövda genom att kontrollera kroppens reaktion. Fäst varje lem med klibbigt tejp på en plastskiva (i en face-up position).
  3. Skär huden och sedan muskeln med kirurgi sax. Öppna brösthålan med en kirurgisk sax. Exponera hjärtat och skär av en liten del av det högra förmaket med en fin kirurgisk sax.
  4. Parfymera musen med en 10 mL engångssteriliserad spruta från vänster kammare med kallt PBS (cirka 30 mL per vuxen mus).
  5. Parfymera musen med 4% PFA (cirka 30 mL i 10 min per vuxen mus) tills den är stel.
  6. Öppna skalle av musen med benpinps. Ta bort hjärnan och Lägg i 5 mL 4% PFA i ett 15 mL centrifugerör för efterfixering vid 4 ° c.
    Anmärkning: Rengör det kirurgiska området efter operationen är avslutad.
  7. Minst 24 h senare, överför hjärn proven till en 30% sackaroslösning för fullständig uttorkning vid 4 ° c.

3. hjärn snittning

  1. Bädda in hjärnan proverna i optimal skärtemperatur förening (OCT) i en liten behållare, och kyla ner vid-20 ° c i minst 1 h.
  2. Avsnitt hjärn prov med en tjocklek av 20-40 μm med en kryostatmikrotom.
  3. Samla sektioner i PBS och förvara vid 4 ° c.

4. färgning av immunofluorescensteknik

  1. Plocka upp avsnitten med riktade hjärnregioner och sätta dem i en 24-brunn tallrik med PBS. För odlade celler på en täckslip, gå direkt till steg 4,2.
  2. Tvätta med PBS på skakapparaten i rumstemperatur under 10 min. Upprepa detta två gånger till.
  3. Ta bort PBS och behandla med förvärmd 1 M HCl i 30 min vid 37 ° c.
    Anmärkning: Bered 1 M HCl genom att tillsätta 1 mL saltsyra (36-38%) 10 mL vatten i en kemisk huva. Värm 1 M HCl i inkubatorn vid 37 ° c.
  4. Tvätta proverna med PBS i 5 min. Upprepa detta två gånger till.
  5. Blockera prover med PBS som innehåller 3% normalt get serum och 0,1% Triton X-100 för 1 h på skakapparaten i rumstemperatur.
  6. Inkubera sektioner med specifika primära antikroppar över natten vid 4 ° c i skakapparaten.
    Anmärkning: Använd följande primära antikroppar: Polyklonala kaninantikroppar anti-5-hydroxymetylcytosin (1:5000), mus monoklonal antikropp anti-NeuN (1:500).
  7. Ta ut proverna, och ytterligare Inkubera i rumstemperatur under 1 h.
  8. Tvätta proverna med PBS i 10 min. Upprepa detta två gånger till.
  9. Inkubera med sekundära antikroppar som motsvarar de primära antikropparna vid rumstemperatur under 1 h i skakapparaten. Täck plattan med aluminium.
    Anmärkning: Använd följande sekundära antikroppar: Alexa fluor 488 Goat anti-kanin IgG (1:500), Alexa fluor 568 get anti-mus IgG (1:500). Motfärgning kärnor med 4 ′ -6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  10. Tvätta proverna med PBS i 10 minuter på skakapparaten. Upprepa detta två gånger till.
  11. Montera hjärn sektioner på bilderna, tillsätt rätt mängd AntiFade monteringsmedel (ca 100-150 μL), och täck med Premium täckglas. Tätning med nagellack.
  12. Ta bilder med ett vanligt eller konfokalfluorescensmikroskop.

5. genomisk DNA-isolering

  1. Euthanize en vuxen C57 BL/6J mus (man eller kvinna) genom cervikal dislokation och ta bort hjärnan.
  2. Dissekera Hippocampus, cortex och lillhjärnan vävnader på en ikyld maträtt. Slipa vävnader med en vävnadslipmaskin i 1 mL DNA-lysbuffert och överför till rent microcentrifugerör. Tillsätt 250 μg proteinas K per 600 μl lyseringsbuffert. För cell pellets, direkt lägga till lysis buffert, proteinas K, och blanda grundligt.
    Anmärkning: Förbered DNA-lysis buffert: 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5. Tvätta och autoklav vävnaden kvarnen innan experimentet.
  3. Den andra dagen, tillsätt ca 50 μg RNase A per prov för minst 12 h vid 37 ° c.
  4. Tillsätt en lika stor mängd fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1) och blanda helt.
  5. Centrifugera vid 20 817 x g i 15 min, och ta bort supernatanten i ett nytt microcentrifugerör.
  6. Tillsätt 600 μL kloroform till supernatanten för att fälla ut DNA och blanda noggrant.
  7. Centrifugera vid 20 817 x g i 15 min, och ta bort supernatanten i ett nytt rör.
  8. Tillsätt 500 μL isopropanol till supernatanten och blanda noggrant.
  9. Centrifugera vid 20 817 x g i 15 min, och ta bort supernatanten helt.
  10. Tvätta nederbörden med 1 mL 70% etanol, Centrifugera vid 20 817 x g i 1 min, och ta bort supernatanten helt. Upprepa en gång.
  11. Torka av DNA-pelleten helt.
  12. Lös upp DNA-pelleten med Tris-HCl buffert (pH 8,5) till rätt koncentration.

6. DNA dot blot

  1. Förbered lösningarna: 2 M NaOH, Tris-HCl buffert (pH 8,5), 6x saltlösning natriumcitrat (SSC).
  2. Gör provblandningen som tabell 1.
  3. Denature DNA-prover vid 100 ° c i 10 min, och kyla ner på isen.
  4. Skär rätt storlek på nylonmembranet (t. ex. Hybond-N +) och skölj med 6x SSC.
  5. Sätt membranet på dot-blot-apparat och Anslut till vakuumpumpen. Spot 6 μL blandning per prick på membranet.
  6. Hybridisera i 30 min vid 80 ° c, och blockera prov membranet med fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning (TBS) för 1 h.
  7. Inkubera med primär antikropp vid 4 ° c över natten.
    Anmärkning: följande primära antikropp: polyklonala kanin anti-5-hydroxymetylcytosin (1:5000).
  8. På den andra dagen, inkubera provet membran vid rumstemperatur för 1 h. Tvätta med TBS för 10 min. Upprepa denna tvätt två gånger.
  9. Inkubera membranet med anti-kanin sekundär antikropp (1:5000) i 30 min vid rumstemperatur.
  10. Tvätta med TBS i 10 min. Upprepa denna tvätt två gånger till.
  11. Visualisera kemiluminiscenssignalerna och kvantifiera signalintensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att avslöja distributionen av 5-hmC i hippocampus vuxna möss, utförde vi immunofluorescens med antikroppar mot neuronala celler (NeuN) och 5-hmC. I hippocampus, 5-hmC Co-lokaliserade väl med neuronala cell markör NeuN (figur 1a-H), tyder på en anrikning av 5-HMC i nervceller.

För att bestämma dynamiken i 5-hmC under neuronala utveckling, en dot-blot utfördes först med DNA-prover isolerade från prolifererande och differentierade vuxna neurala stamceller (NSCs). Resultaten från dot-blot visade att den globala nivån på 5-hmC ökade markant under differentieringen av NSC (figur 2A-B). Vidare visade dot-blot resultat att nivån på 5-hmC i nervceller var signifikant högre än för NSCs (figur 2C-D), vilket tyder på en dynamisk 5-HMC modifiering under neuronala utveckling.

Figure 1
Figur 1: färgningen av immunofluorescensfärgning av 5-hmC i hippocampus hos vuxna möss. 5-hmC Co-lokaliserade väl med neuronala cell markör NeuN. Skalstapel = 100 μm (A-D); 50 μm (E-F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: DNA dot-blot detektion av 5-hmC i vuxna neurala stamceller och nervceller. (A) 5-HMC dot-blot av nscs under proliferation (PROLI) och differentiering (diffe) villkor. (C) 5-HMC dot-blot av nscs och primära nervceller. Färgning av metylenblått (B, D) som indikerar lika belastning av GENOMISKT DNA vid varje koncentrationi a respektiveC. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

200 ng/dot 400 ng/dot 1 000 ng/dot
Dna 470 ng 940 ng 2 350 ng
2 M NaOH 2,81 μL 2,81 μL 2,81 μL
Tris-HCl buffert, pH 7,5 Gör volymen upp till 14,06 μL

Tabell 1: beredning av prover för dot-blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetiska modifikationer spelar viktiga roller under hjärnans utveckling, mognad och funktion. Som en stabil markör för DNA-modifiering, dynamisk 5-hmC svarar på beteendemässig anpassning, neuronala aktivitet, och är positivt korrelerad med genuttryck; Sålunda, det är involverat i hjärnans normala funktion och neurologiska störning4. För att utforska dess funktion i celler och vävnader, är det nödvändigt att upptäcka förekomsten av 5-hmC och jämföra nivån före och efter behandling. Här har vi visat två praktiska metoder för att upptäcka 5-hmC i celler och vävnader, som kan utföras med gemensam utrustning i labbet.

Den viktigaste reagens för att upptäcka 5-hmC med immunofluorescensen färgning och DNA dot-blot är 5-hmC antikropp. Den 5-hmC-antikropp som används i metoden har visat sig ha hög känslighet och är mycket specifik. För 5-hmC färgning, det kräver DNA-denaturering med HCl. Korrekt behandling av vävnader och celler med HCl är avgörande för fullständig DNA-denaturering och påverkar resultaten. DNA dot-blot är en känslig metod för att kvantifiera mängden 5-hmC, och är mycket bekvämare än masspektroskopi. För en lyckad prickfläck krävs exakt spridning av DNA-prover på membranet. Ytterligare, metylenblått färgning hjälper till att avgöra om DNA-prover var lika laddade. Notera, de metoder som beskrivs här upptäcka den globala nivån av 5-hmC i flera typer av celler och vävnader. För att mäta mängden 5-hmC i förhållande till andra baser och särskilja dess fördelningsfunktion i arvsmassan krävs LC-MS/MS och nästa generations sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

XL stöddes delvis av den nationella nyckeln R & D program i Kina (2017YFE0196600), och National Natural Science Foundation i Kina (Grant nos. 31771395, 31571518). Q.S. stöddes av Kinas nationella centrala forsknings-och utvecklingsprogram (2017YFC1001703) och det centrala forsknings-och utvecklingsprogrammet i Zhejiang-provinsen (2017C03009). W.X. stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (LY18H020002) och Science Technology-avdelningen i Zhejiang-provinsen (2017C37057).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
Epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Normal goat serum Vector Laboratories Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
Proteinase K VVR 39450-01-6
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Tags

Neurovetenskap DNA demetylering 5-hydroxymetylcytosin immunofluorescensfärgning dot-blot mus hjärna neurala stamceller neuron
Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu,More

Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter