Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الاساسيه/شل السقالات الطباعة للهندسة الانسجه من الهياكل أنبوبي

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/59951
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2, 1, 1, 1,3
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor

Summary

المقدمة هنا هي بسيطه للاستخدام ، والاساسيه/شل ، وثلاثه الابعاد القرصنة البيولوجية اعداد لتصنيع خطوه واحده من السقالات جوفاء ، ومناسبه للهندسة الانسجه من الاوعيه الدموية والهياكل الانبوبيه الأخرى.

Abstract

الطباعة ثلاثية الابعاد (3D) من خيوط الاساسيه/قذيفة يسمح التصنيع المباشر للهياكل القناة مع قذيفة مستقره التي هي عبر ربط في واجهه مع النواة السائلة. يتم أزاله هذا الأخير بعد الطباعة ، تاركا وراءه أنبوب أجوف. ان دمج تقنيه التصنيع المضافة (مثل الأحبار الموصوفة هنا بالحبر الحيوي المصنوع خصيصا ، والذي يحاكي هيكليا وبيولوجيا المصفوفة الاصليه [ECM]) هو خطوه هامه نحو هندسه الانسجه المتقدمة. ومع ذلك ، فان التصنيع الدقيق للهياكل المحددة جيدا يتطلب استراتيجيات تصنيع مصممه خصيصا للمواد المستخدمة. ولذلك ، فانه من المعقول ان تبدا مع إنشاء التي هي قابله للتخصيص ، بسيطه للاستخدام ، ومتوافقة مع مجموعه واسعه من المواد والتطبيقات. هذا العمل يقدم سهله لتصنيع فوهه الاساسيه/قذيفة مع luer-التوافق لاستكشاف الاساسيه/شل الطباعة من الهياكل الخشبية ، اختبارها مع صياغة المواد سقالة محدده بشكل جيد ، الجينات القائمة.

Introduction

ويمكن القول ان الهدف النهائي من هندسه الانسجه (TE) هو إنتاج الانسجه الوظيفية أو الأعضاء في المختبر ، والتي يمكن استخدامها لتجديد أو استبدال الأجزاء المصابة أو المريضة من جسم الإنسان1،2،3. تركز البحوث الحالية في هندسه الانسجه (TE) علي الجوانب الفردية للميدان (مواد السقالات ، وإجراءات التصنيع ، ومصادر الخلايا ، وما إلى ذلك). 4،5، فضلا عن تطوير نماذج بسيطه في المختبر من الانسجه والأعضاء التي تحاكي الجوانب الاساسيه لنظراءهم في الجسم الحيوي. هذه النماذج مفيده بالفعل للعديد من التطبيقات ، مثل فحص المخدرات ودراسات السمية ، وخاصه في الحالات التي تفشل فيها ثقافات الخلايا ثنائيه الابعاد التقليدية في محاكاة الاستجابات الديناميكية للانسجه الاصليه6،7، 8و9. وعاده ما يتم بناء نماذج ثلاثية الابعاد في المختبر عن طريق الجمع بين الخلايا10، العظة الفيزيائية الكيميائية11، والجزيئات النشطة بيولوجيا12،13 علي السقالات ، والتي يتم الحصول عليها من الانسجه المكررة أو التي شيدت من نوفو من المواد البيولوجية أو الحيوية14،15،16،17،18.

من الاهميه بمكان ان السقالات تلخص البنية المجهرية المعقدة ثلاثية الابعاد والهيكل الهرمي للانسجه الاصليه لتمكين وظائف الانسجه المهندسة ، ممثله في انسجه الجسم الحيوي19. علي الرغم من التقدم التكنولوجي الكبير في TE ، لا يزال تطوير ثوابت الانسجه الاصطناعية ذات الصلة الفسيولوجية تحديا. الانسجه السميكة (> 200 μm في سماكه) هي إشكاليه خاصه ، وذلك بسبب القيود مثل الأكسجين وانتشار المواد الغذائية20. وقد أحرز تقدم نحو الانسجه أكبر التراكيب; ومع ذلك ، يجب تلخيص القرب العالي المطلوب من الخلايا إلى الاوعيه الدموية من أجل نقل الأكسجين والمواد المغذية وتعزيز أزاله النفايات. الاوعيه الدموية من الانسجه (أو بدلا من ذلك ، وتصنيع شبكات الوعائية ثلاثية الابعاد مترابطة داخل الانسجه يبني) يلعب دورا حاسما في الحفاظ علي سلامه الخلية وتعزيز وظائف في المختبر الانسجه المهندسة ، وهو أكثر صعوبة نماذج في تجارب طويلة21,22. وعلاوة علي ذلك ، فان القرار المطلوب والسلامة الهيكلية والتوافق الإحيائي المتزامن لم يتحقق بعد23.

وقد اقترح العديد من نهج TE في محاولة لبناء هياكل شبيهه بالاوعيه الدموية وتسهيل الاوعيه في المختبر. وتشمل بعض الامثله الخلايا البطانية البذر (أيضا شارك في استزراع مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الليفية) التي تجمع الذاتي لتوليد شبكات الاوعيه الدقيقة24، واستخدام خلايا السلف الوعائية والعجانات التي تعزز الخلية البطانية النمو21،25، وتسليم عوامل النمو الوعائية التي تحفز الاوعيه الدموية20،26، وذلك باستخدام الخلية ورقه التكنولوجيا التي تسمح للسيطرة علي طبقات الوعائية20، وتصنيع هياكل سقالة عاليه المسام التي تعزز تولد الاوعيه27. وتركز النهج المذكورة علي الحث علي تولد الاوعيه الدموية ، الذي يتطلب عموما كميات كبيره من عوامل النمو الاضافيه (مثل VEGF) والوقت اللازم لتشكيلها. ومع ذلك ، فان أكبر العيوب هي استنساخها المحدودة والسيطرة المكانية المقيدة علي زخرفه الاوعيه الدموية ، مما يؤدي عاده إلى توزيع وعائي عشوائي داخل بناء الانسجه الذي لا يسهل بالضرورة التروية.

التصنيع المضافة (AM ، مثل بيورينتينج 3D) تشارك بشكل متزايد في تصنيع يبني 3D باستخدام المواد البيولوجية أو الحيوية لخلق السقالات مناسبه ل TE. ويجري استخدام وتطوير العديد من نهج AM بالتوازي (مثل الطرق المستندة إلى الحبر النفاث والنتوءات المجهرية ، وأنواع مختلفه من تقنيات التصوير الحجري) لإنتاج السقالات التي تحاكي الانسجه الاصليه في هندستها المعمارية والكيمياء الحيوية والأداء الوظيفي . التقنيات الفردية تظهر بعض المزايا والعيوب28، وهذا هو السبب في التعديلات المختلفة التي يجري استكشافها (علي سبيل المثال ، زخرفه الصغرى ، والاوعيه المستحثة ، وما إلى ذلك) لزيادة المدى إلى الاوعيه الدموية الكبيرة والمعقدة ومستقره يمكن ان تكون الشبكات ملفقه22،29،30.

ومن بين هذه العمليات ، فان التشكيل البيولوجي النتوء هو الأسلوب الأكثر استخداما ، وخاصه بسبب المجموعة الواسعة من المواد المتوافقة (بشكل عام الخلية الصديقة للعملية28،31،32) وكذلك براعة استثنائيه في شروط الطلبات (علي سبيل المثال ، الطباعة المضمنة والذبيحة23،33، تصنيع الهياكل المجوفة34،35، الخ). وتشمل التحديات الرئيسية التي تشغل الدراسات الحالية نقل من الهياكل 2D إلى 3D ، وتشكيل شبكه كثيفه من أنابيب جوفاء مع دقه المكانية عاليه ، والسلامة الميكانيكية الشاملة والإخلاص الشكل اثناء تدفق السوائل في ثقافة الخلية الشروط30.

النهج الأكثر مباشره للانسجه القابلة للاستخدام هو تلفيق شبكه مترابطة من القناات داخل البناء. ومن المتوقع ان يؤدي إنشاء هذه القناات القابلة للاستخدام داخل سقالة نسيجيه إلى حل العديد من المشاكل المذكورة أنفا ، لأنها تسمح علي الفور بنشر المواد الغذائية والأكسجين مع أزاله النفايات. ولذلك ، يتم تجنب تشكيل المحتملة للمناطق نخريه داخل البناء36. قد تكون هذه القناات بالاضافه إلى ذلك المصنفة مع الخلايا البطانية (ECs) وتكون بمثابه الاوعيه الدموية الاصطناعية في نماذج الانسجه 3D37. في المعني الاولي ، يمكن ان تتكون السفينة من قناه جوفاء ، طبقه لينه من ECs ، وقذيفة قاسيه. في الاونه الاخيره ، النتوء 3d من اثنين من المواد المختلفة في الاساسيه/شل الأزياء باستخدام الابر المحورية لقذف وقد اكتسبت الكثير من الفائدة38،39،40،41، كما انه يسمح لتلفيق أنابيب جوفاء.

علي غرار التقليدية ميكروبثق 3D الطباعة ، يتم تنفيذ الطباعة الاساسيه/شل مع فوهه المشارك المحوري (علي سبيل المثال، اثنين من الابر مع أقطار مختلفه محاذاة علي نفس المحور بطريقه ، بحيث الابره أوسع يرفق واحد أضيق). التالي ، يمكن ان يكون مقذوف اثنين من المواد في وقت واحد ، مع واحده كخيوط المركزية أو "الداخلية" الاساسيه والثانية كما "الخارجي" قذيفة41. حتى الآن ، تم استخدام البيولوجية المحورية المشتركة لافتعال هياكل مع الصلبة42، الاساسيه/شل43، وخيوط جوفاء40،44؛ ومع ذلك ، لم يتم تحسين المواد المستخدمة لكل من سلامه الخلية المثلي والمتانة الميكانيكية للثوابت المطبوعة. وكما ذكرنا ، فان هذه التقنية توفر امكانيه الجمع بين الحيوي والخواص الميكانيكية المختلفة ، التي يدعم فيها الأكثر صلابة واحده أكثر ليونة. والاهم من ذلك ، إذا كانت ماده السقالة (مثل الجينات ، الكربوكسيل ميثيل السليلوز) مقذوفة كقذيفة ، في حين يتم الاستغناء عن النواة المكونة من عامل الربط المتقاطع (مثل كلوريد الكالسيوم) من الشعيرات الشعرية الداخلية ثم شطفها بعد الطباعة ، فهي من الممكن افتعال أنبوب أجوف مستمر في خطوه واحده45.

مع هذا في الاعتبار ، تم تطوير طريقه بسيطه وقابله للتكرار خطوه واحده لبناء السقالات المحددة جيدا والقابلة للاستخدام للهندسة هياكل الاوعيه الدموية والانسجه الانبوبيه الأخرى. ولتطوير تكنولوجيا فعاله من حيث التكلفة ، ينبغي ان يكون التصنيع بشكل مثالي عمليه أحاديه الخطوة. ولذلك ، تم تكييف النواة/شل الاعداد ودمجها في بيوركانتر 3D. يتكون التصميم الأساسي من فوهه مركزيه مصنوعة من المعدن لتجنب التشوه اثناء الحقن ، والتي يتم فيها وضع فوهه ثانيه من قطر أكبر. وتسمح هذه الفوهة المحورية المشتركة بالسحب المشترك للتدفقين والربط المباشر بين قناه هيدروجيل المقذوفة. وهذا يمكن تلفيق مباشره من خيوط جوفاء متعددة الطبقات ، في حين اللاحقة عبر ربط مع تركيزات اعلي من كلوريد الكالسيوم (CaCl2) ضمان استقرار أكثر دواما من الخارج.

وعلي هذا النحو ، يسمح هذا الأسلوب للطباعة المتزامنة من السقالات والقناات الدقيقة ، والتي الشعيرات هيدروجيل جوفاء بمثابه سقالة لدعم السلامة الميكانيكية للثوابت 3D والعمل في وقت واحد كما المدمج في القناات المجهرية لتقديم المغذيات لنمو الخلايا. يوفر هذا البروتوكول اجراء مفصلا للاستراتيجية الاساسيه/شل 3D بيورينتينج استنادا إلى استخدام فوهه المشتركة التي صنعت خصيصا في الهياكل هيدروجيل 3D مع المدمج في القناات ملفقه عن طريق التحكم عبر ربط لإنتاج خيوط جوفاء ، التي لا تزال قابله للاستخدام اثناء ثقافة الخلية.

تم تكوين مجموعه الطباعة ثلاثية الابعاد المستخدمة في هذا العمل كما سبق وصفه من قبل بانوفيتش و فيهار46 ويمكن تقسيمها إلى ثلاثه مكونات رئيسيه: a) ثلاثه محاور CNC الميكانيكية مجموعه المتابعة مع 50 μm دقه تحديد المواقع في الاتجاات س ، ص ، و Z ؛ B) اثنين من البثق ، تكييفها للتخلص منها ، 5 مل luer--قفل المحاقن ، مع 1.2 μl القرار فوكسل ؛ و C) التحكم في الكترونيات والبرمجيات.

لتسهيل الطباعة الاساسيه/شل ، تم تطوير فوهه المناسبة التي يمكن تركيبها علي واحد من بثق (الطارد الاوليه ، والطباعة الاساسيه) ومتوافق مع G27 الابر نهاية حاده. كما ان لديها التوافق luer قفل للتواصل مع الطارد الثاني (طباعه قذيفة). تم تلفيق النماذج الاولي من خلال إدخال ابره G27 غير حاده (القطر الداخلي = 210 μm ، القطر الخارجي = 410 μm) في ابره مجموعه ال 21 (القطر الداخلي = 510 μm ، القطر الخارجي = 820 μm) أو الطرف المخروطي G20 (القطر الداخلي = 600 μm) ، ثم ادراج ن الثانوية العقيدة أفقيا لتوريد المواد قذيفة. ومع ذلك ، نظرا لانحناء طفيف من رمح ابره ، فانه ليس من الممكن لإنتاج طرف فوهه مع المحاذاة المتمركزة بين الابر الداخلية والخارجية.

لحل هذه المشكلة ، تم تصميم فوهه جديده التي حققت المعايير التالية: 1) يمكن تصنيعها باستخدام مطحنه CNC 3-محور ، 2) يمكن ان تكون مصنوعة من مواد مختلفه (عاليه الأداء البلاستيك ، مثل نظره خاطفه أو المعادن) ، 3) لديها luer-قفل التوافق لتطبيق المواد قذيفة ، و 4) هو متوافق لG27 ابره حاده نهاية ويحمل في مكان في موقعين لمحاذاة غيض مع المحور المركزي. ويرد في الشكل 1 رسمتخطيطي لنموذج الفوهة.

Protocol

1-اعداد الهلام المائي وحلول الربط المتبادل

  1. لفتره وجيزة ، من خلال خلط بقوة ، وحل ALG ومساحيق CMC في المياه فائقه النقاء للحصول علي إجمالي 3 wt ٪ ALG و 3 wt ٪ حل CMC.
    ملاحظه: في هذا العمل ، يتم استخدام المحاقن 5 مل للطباعة. التالي ، يتم تعديل الكمية النهائية من المواد إلى هذا الحجم. ومع ذلك ، بالنسبة لخراطيش البثق الأخرى واحجام العينات المطبوعة ، ينبغي قياس كميه المواد المعدة وفقا لذلك.
  2. أضافه 1.5 wt% ألياف النانو السليلوز إلى خليط ALG-CMC لتعزيز الميكانيكية اضافيه للوصول إلى اللزوجة المطلوبة ، ومناسبه للطباعة.
  3. اجتت التعليق هيدروجيل حتى متجانسة باستخدام خلاط العلوي.
    ملاحظه: لا ينبغي ان تكون ألياف أو فقاعات موجودة في هيدروجيل.
  4. اعداد 10 مل من 100 مم كلوريد الكالسيوم (CaCl2) الحل في المياه النقية جدا ، والذي يستخدم كحل الاساسيه عبر ربط للطباعة.
  5. اعداد 10 مل من 5 بالوزن .% CaCl2 محلول في المياه النقية جدا ، والذي يستخدم كحل ثانوي عبر ربط في مرحله ما بعد تجهيز السقالات.
    ملاحظه: عموما ، جميع تركيبات هيدروجيل ، والتي هي مناسبه للربط الكيميائي الفوري عبر ربط ، تسمح لتصنيع خطوه واحده من أنابيب جوفاء ويمكن استخدامها مع هذا النوع من الاساسيه/شل اعداد. ويلزم تحسين أليات الطباعة والربط المتقاطع وفقا لذلك. اللزوجة من هيدروجيل سوف تختلف تبعا للتكوين المطلوب. ومع ذلك ، فانه يمكن تعديلها مع تركيزات البوليمر وأضافه عوامل سماكه (علي سبيل المثال ، ألياف النانو). اللزوجة المثالية للطباعة ثلاثية الابعاد من الهياكل المستقرة عاليه بما يكفي لخيوط مقذوف للاحتفاظ شكله ولسقالة لعقد الوزن الخاصة به قبل الربط بين.

2. الاساسيه/شل الطباعة من السقالات القابلة للاستخدام

  1. قبل الطباعة ، تعقيم بيوركانتر عن طريق رش 70 ٪ الايثانول تماما وتعريضه للاشعه فوق البنفسجية لمده 1 ساعة.
  2. تشغيل البرامج البيولوجية وتشغيل البرنامج المسيطر ، والذي ياتي في حزمه مع الطابعة 3D.
  3. قم باجراء التوجيه عن طريق الضغط علي أيقونه الصفحة الرئيسية .
  4. استخدام ملف أوامر شريط الاداات | استيراد G-رمز، استيراد السقالة التي تم إنشاؤها g-رمز.
  5. نقل هيدروجيل إلى حقنه معقمه 5 مل ووضعها في واحده من يتصاعد الطارد من الطابعة 3D. عن طريق قفل تركيبه وأنبوب قصير ، توصيله إلى الجانب تركيبه المدخلات من فوهه الاساسيه/قذيفة.
  6. نقل الحل عبر ربط (100 mM CaCl2) إلى حقنه معقمه 5 مل آخر مع المرفقة G27 ابره حاده نهاية وادراجه في اعلي حامل ابره من النواة/قذيفة فوهه. الابره الداخلية يجب ان تبرز قليلا (~ 1 مم) من النواة الخارجية/قذيفة فوهه. اضبط المحاذاة يدويا. ادراج حقنه الثانية في جبل البثق.
  7. لادراج المحاقن بشكل صحيح في الحوامل (الاعداد الظاهر في الشكل 2) ، يمكنك التحكم يدويا في كل من يتصاعد النتوء بالنقر علي A و B والسهمين للأعلى وللاسفل .
  8. قبل بدء الطباعة ، بشكل منفصل البثق هيدروجيل والحل عبر ربط لمسح جميع فقاعات الهواء الزائدة في النواة/قذيفة فوهه وضمان تدفق هيدروجيل مستمر.
  9. باستخدام Z واعلي وأسفل الأسهم ، يدويا ضبط المسافة بين فوهه والطباعة الركيزة. فمن المستحسن استخدام شقه ، والزجاج الطباعة الركيزة ، والتي لديها التصاق جيده. يجب ان لا تكون فوهه البثق في اتصال مع الركيزة للسماح للتدفق دون انقطاع من هيدروجيل. المسافة المثلي بين فوهه والركيزة (ارتفاع طبقه) هو عاده نفس عرض قطر فوهه الخارجي ، ولكن يتم تعديله علي المواد المستخدمة والمعلمات الطباعة الفردية. ضبط ارتفاع الطباعة بدءا وفقا للاحتياجات الفردية.
  10. اضغط علي زر التشغيل لبدء عمليه الطباعة.
    ملاحظه: من المستحسن ان تشمل طباعه تنوره (الشكل 3) المحيطة سقالة لضمان زرع خيوط جوفاء متجانسة قبل الطباعة من سقالة الفعلية يبدا. لتحقيق تدفق الأمثل هيدروجيل مع النية لطباعه السقالات الأمثل ، وتختلف تكوين صياغة ، عبر ربط تكوين الحل ، والمعلمات الطباعة (اي ، سرعه الطباعة ، والضغط البثق ، ودرجه حرارة الطباعة ، والمسافة بين الركيزة وفوهه البثق ، وما إلى ذلك).
  11. بعد الطباعة ، وأزاله بعناية الركيزة مع سقالة المطبوعة وتصب الثانوية عبر ربط الحل (5 wt. ٪ CaCl2) علي السقالة بأكملها لضمان الربط عبر السقالة بأكملها. احتضان لمده دقيقه واحده في درجه حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظه: تاكد من ان السقالة بأكملها مغمورة في الحل عبر الربط. هذه الخطوة حاسمه لتحقيق القوه المطلوبة خصائص السقالة ولكن سوف تختلف اعتمادا علي المواد وطريقه الربط عبر المستخدمة.
  12. باستخدام مشرط قطع المواد تنوره الزائدة يدويا.
  13. تعقيم السقالات تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه. اقلب السقالة بعناية وكرر عمليه التعقيم.
  14. فصل بعناية سقالة من الركيزة عن طريق سحب بلطف علي جانبيه. ان السقالة يلتصق بقوة إلى الركيزة, يفصل هو ب يدخل حافه حاده بين هم.
  15. نقل سقالة إلى وسائل الاعلام خليه عديمه اللون ثقافة (DMEM تستكمل مع 5 wt. ٪ ، 100 U/mL البنسلين و 1 ملغ/مل ستربتومايسين) ، واحتضانها في 37 درجه مئوية في جو يحتوي علي 5 wt .% CO2 لمده 24 ساعة علي الأقل.

3. اعداد الخلايا البطانية وحل الفحص الحي/الميت

  1. لزراعه الخلايا ، واعداد المتقدمة DMEM ثقافة الخلية المتوسطة مع الفينول الأحمر المضافة وتكمله مع 5 wt. ٪ من الطراز الثاني و 2 مم L-الجلوتامين. أضافه 100 U/mL البنسلين و 1 ملغ/مل ستربتومايسين.
  2. بدء الخلية البشرية الوريد الحبل السري (huvec) خط ومرورها وفقا لبروتوكولات huvec زراعه كما هو موضح47.
    ملاحظه: من المستحسن ان ثقافة الخلايا في وسائل الاعلام الثقافة الخلية مع أضافه الفينول الأحمر لتصور بسيط اثناء حقن الخلايا في السقالات البيضاء الشفافة كما هو موضح أدناه.
  3. لجرد الخلايا ، ماصه 100 μL من الخلايا المعلقة في وسائل الاعلام الثقافة الخلية ووصمه عار لهم مع 900 μL من 0.1 wt. ٪ التريكان الحل الأزرق.
  4. استخدم عداد الخلايا التلقائي أو مقياس الشكل اليدوي للعد والحصول علي العدد المقدر للخلايا المعلقة.
  5. لفحص الحية/الميتة ، واعداد حل من 4 ملم Calcein-AM و 2 ملليمتر بروبيديوم يوديد في العقيمة تلفزيوني.
    ملاحظه: يجب اعداد الحل الحي/الميت مباشره قبل اجراء الفحص.

4. نقل الخلايا إلى السقالات

  1. أزاله السقالات من وسائل الاعلام الثقافة الخلية ونقلها إلى طبق كبير بما فيه الكفاية الزجاج بيتري.
  2. مباشره قبل حقن الخلايا في السقالات ، وانفصال HUVECs من قوارير باستخدام العلاج بواسطة 0.25 wt .% التربسين.
    1. لفتره وجيزة ، والتخلص من وسائل الاعلام الثقافة الخلية واحتضان الخلايا مع 0.25 wt. ٪ التربسين (~ 2 مل) لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية.
    2. بعد الحضانة أضافه ~ 3 مل من وسائل الاعلام الثقافة الخلية إلى الخلايا التريسينزيد ونقل جميع الخلايا المنفصلة إلى أنبوب الطرد المركزي.
    3. الطرد المركزي الخلايا في 200 x g ل 5 دقيقه والتخلص من supernatant.
    4. أعاده تعليق الخلايا في وسائط ثقافة الخلايا الجديدة.
  3. عد الخلايا كما هو موضح سابقا. ضبط تركيز الخلية الإجمالي وفقا للاحتياجات الفردية. في هذا العمل ، يتم استخدام تركيز البداية من 340,000 خلايا/مل.
  4. أعاده تعليق الخلايا في حقنه معقمه مع ابره G27 المرفقة حاده.
  5. العثور علي نقطه دخول والبدء في حقن الخلايا بعناية في السقالات. وينبغي ان يكون تدفق تعليق الخلية من خلال سقالة شفافة مرئية. تاكد من ان السقالة بأكملها تملا بتعليق الخلية.
  6. تحت دمج السقالات في وسائل الاعلام الثقافة الخلية واحتضانها في 37 درجه مئوية في جو يحتوي علي 5 wt .% CO2 لمده تصل إلى 10 أيام.
  7. تجديد وسائل الاعلام الثقافة الخلية وفقا للاحتياجات التجريبية.

5. الفحص الحي/الميت والتصوير الخلوي

  1. بعد الحضانة ، شطف السقالات مع تلفزيوني.
  2. مع ابره حاده نهاية ، حقن بعناية المحلول الحي/الميت الذي تم اعداده مسبقا (4 ملم calcein-AM و 2 ملليمتر بروبيديوم يوديد في تلفزيوني) في السقالات واحتضان لهم في تلفزيوني لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية. تاكد من ان الحل يتدفق من خلال طول السقالة بأكملها.
  3. شطف السقالات مع تلفزيوني.
  4. نقل السقالات بعناية إلى شريحة زجاجيه.
  5. مراقبه الخلايا المصبوغة مباشره في السقالات تحت المجهر مضان.
    ملاحظه: خلايا قابله للحياة إنتاج الفلورية الخضراء والخلايا الميتة تنبعث منها ضوء فلوري الأحمر.

Representative Results

وكان الهدف من هذا العمل هو تطوير سهله لتصنيع فوهه الاساسيه/قذيفة مع التوافق luer للطباعة الاساسيه/شل الهياكل الخشبية. الاضافه إلى ذلك ، تم وصف بروتوكول طباعه بخطوه واحده مباشر وقابل للتكرار ، وهو بسيط لتعديل واستيعاب مجموعه واسعه من المواد واليات الكيميائية المختلفة التي تربط بين الربط لبناء السقالات المحددة جيدا والقابلة للاستخدام هندسه الاوعيه الدموية وغيرها من هياكل الانسجه أنبوبي.

الاساسيه/شل فوهه
تتكون الفوهة من ابره G27 الحاده (لطباعه الخيوط المحورية الداخلية) وجسم الفوهة ، الذي يحمل الابره في مكانها ويخلق فوهه خارجيه لخيوط القشرة مع منفذ اتصال لإدخال المواد. ويرد الرسم التخطيطي في الشكل 1. اثنين من المحاقن 5 مل ، والتي يتم وضعها في بثق الفردية وتوفير المواد الاساسيه وقذيفة. أنابيب يربط الجسم فوهه مع حقنه ، وتوفير المواد قذيفة.

ويرد في الشكل 2التجميع الكامل لفوهه القلب/القذيفة ومجموعه المحاقن. تم تصنيع أول نموذج وظيفي للجسم فوهه بواسطة CNC طحن كتله من بليكسيمثيلن (بوم). تم اختبار التوافق والختم بين العنصر ، ابره G27 والأنابيب عن طريق تثبيت في Vitaprint. لم يلاحظ اي تسرب للمادة قذيفة في فوهه ، الموصل قفل ، أو بين الجسم والابره. الجسم فوهه يناسب باحكام مع محور ابره (موصل luer) ، وضمان حركه متزامنة من فوهه كامله مع الطارد.

بناء سقالة
النهج الأكثر مباشره لافتعال السقالات هو عن طريق إيداع طبقه المواد بطبقه حيث يتم تغيير اتجاه الطباعة كل طبقه متتالية ، وعاده في زاوية من 90 درجه مئوية. ونظرا للخصائص المرنة والمطاطية للهلام المائي ، فان الاحتفاظ بشكل الإخلاص للهياكل المطبوعة لا يزال يشكل تحديا. الغرض الرئيسي من هذا القسم البروتوكول هو 3D الطباعة من السقالات الاساسيه/شل قابله للاستخدام باستخدام اثنين من البوليمرات ، والتي أظهرت سابقا نتائج واعده لبناء سقالة (ALG و CMC) مع أضافه ألياف النانو السليلوز (NFC) لزيادة الاستقرار الميكانيكية. كلا ALG و CMC هي مشحونة سلبا ، البوليمرات الخطية القابلة للذوبان في الماء48 وكلاهما يحتوي علي مجموعات الكربوكسيل ، والتي يمكن ان تكون مرتبطة مع أضافه cations ثنائي التكافؤ. Ca2 + جزيئات شكل السندات الايونيه مع مجموعتين وظيفية في وقت واحد ، وتشكيل اتصالات بين سلاسل البوليمر ، وزيادة صلابة هلام.

طباعه السقالات القابلة للاستخدام
والهدف من هذه العملية هو 3D-طباعه بسيطه الهياكل سقالة خشبيه ، والتي تمتد علي عده طبقات والحفاظ علي الإخلاص شكلها ، فضلا عن perfusabilityها للاستخدام حتى تصبح مرتبطة تماما عبر. وهذا يتطلب حتى أفلام من الاساسيه وقذيفة دون التحويلات أو تراجع الحركات ، والتي يمكن ان يقطع تدفق. لذلك ، نموذجي CAD النمذجة وطرق التقطيع هي اقل ملاءمة. في هذا العمل ، يتم استخدام رمز g-المصممة يدويا ، وتم تطوير مولد رمز g-المستندة إلى بيثون لاعداد g-رمز سريع.

وقد تم تنظيم السقالات في شكل شبكه خشبيه وبنيت علي سطح زجاجي مسطح. تم تنفيذ التلفيق طبقه تلو الأخرى ، وإيداع خطوط العبور من كل طبقه المتعاقبة في زاوية 90 درجه إلى السابقة. بالاضافه إلى ذلك ، كان كل طبقه التالية أضيق 2 ٪ في الاتجاات س وص ، وضمان دعم خيوط مستمرة من قبل الطبقات السابقة. المسافة بين الشعيرات (حجم ماكرومسام) يمكن تصميمها بدقه في رمز g بالأخذ بعين الاعتبار القطر الخارجي لخيوط مقذوف (0.8 مم) والمسافة بين خطوط الشبكة (3 مم).

وكان مطلوبا من السقالات الوفاء بمعايير الادراج الرئيسية لمواصله النظر فيها. أولا ، كانت السقالات التي لديها 4 طبقات علي الأقل في الارتفاع مطلوبه للاحتفاظ بسلامتها الهيكلية وهندستها (علي سبيل المثال ، حجم ماكرومسام) اثناء الطباعة ، لتكون مؤهله لمزيد من التطوير. ثانيا ، السقالات بحاجه إلى البقاء قابله للاستخدام (القناات الدقيقة مستقره) حتى بعد احتضانه لمده 7 أيام في وسائل الاعلام الثقافة الخلية في 37 درجه مئوية. في فترات زمنيه مناسبه (1 ، 2 ، 5 ، 7 أيام) تم إخراج السقالات من وسائل الاعلام الثقافية واختبارها لمعرفه ما إذا كانت لا تزال قابله للاستخدام. في الشكل 4A، يعرض المقطع العرضي لسقالة المطبوعة والمجهزة حديثا قناه مجوفه مرئية بوضوح داخل الخيوط. في الشكل 4B، فمن الواضح انه حتى بعد 72 h حضانة في وسائل الاعلام الثقافة الخلية في 37 درجه مئوية ، وخيوط يحتفظ بنيه جوفاء من خلال طول سقالة كامله.

عده صيغ كان قابل للطباعة, يبقي هيكليا ثابته, يحفظ ال يطبع هندسه, ويبقي [برسلبل]; ومع ذلك ، تم اختيار واحد لمزيد من الاختبار (اي ، 3 wt .% ALG + 3 wt .% CMC + 1.5 wt .% NFC), الذي سمح بطباعه السقالات القابلة للاستخدام مع ما يصل إلى 10 طبقات. يتم عرض عمليه الطباعة مع فوهه مخصصه في الشكل 5A. الاساسيه/شل الطباعة كان من الممكن مع تركيبات اقل لزج. ومع ذلك ، لم تسمح الهلام مع تركيزات اعلي تدفق مستمر من خلال فوهه. للربط الأساسي عبر ربط (المواد الاساسيه ، تسليمها اثناء الطباعة) 100 مم CaCl2 وقد استخدمت ، والتي استقرت بشكل كاف في تشكيل مستمر من خيوط جوفاء ، دون التسبب في تصلب هلام داخل فوهه. بعد الطباعة ، وكانت غارقه السقالات في 5 بالوزن .% CaCl2 حل لربط تماما هيدروجيل لدقه الشكل علي المدى الطويل. يتم تصوير عينه سقالة منتهية في الشكل 5B. خلال التحسين ، واستخدمت عمليه صياغة صبغه اصطناعية في الحل الأساسي ، للسماح التقييم البصري وفحص نوعيه خيوط مقذوف. لم يستعمل الصبغ كان للتصنيع من السقالات نهائيه, اي كان أعدت لخليه بذر وزراعه.

الفحص الحي/الميت
بعد الحضانة ، تم استخدام فحص حي/ميت لتصور ECs والتمييز بين المعيشة (الخضراء) والخلايا الميتة (الحمراء) داخل سقالة حضن. هذا يخدم غرضين رئيسيين: A) لتحديد ما إذا كانت السقالات توفر بيئة متوافقة مع الحيوية لتعزيز النمو والتصاق دون إظهار اثار ضاره علي الخلية ، و B) لتصور السلامة الهيكلية للهياكل أنبوبي والخاصة بهم نظام القناة الداخلية بمزيد من التفصيل.

وترد نتائج الفحص الحي/الميت في الشكل 6. في وجود استراسيس داخل الخلايا ، يتم تحويل غشاء البلازما نفاذيه Calcein-AM إلى Calcein ، ينبعث منها ضوء الفلورية الخضراء في الخلايا الحية. من ناحية أخرى ، يتم تصور الخلايا ابوتوتيك عن طريق غشاء بروبيديوم يوديد ، والتي فلوسيس باللون الأحمر عندما يدرج في الحلزون المزدوج الحمض النووي. تم الجمع بين الصور الحية/الميتة وصور الحقول الساطعة لسقالات للمساعدة في تصور الخلايا داخل القناات المجوفة. تم حقن محلول تلطيخ ، والفحص الذي اجري مباشره في السقالات المطبوعة 3D بعد حضانة سقالة الخلية ل 48 h.

وتجدر الاشاره إلى انه تم استخدام كثافة البذر صغيره نسبيا من ECs (340,000 خلايا/مل) ، كما خدم هذه الدراسة فقط كدليل علي مفهوم للطباعة الاساسيه/شل السقالات القابلة للاستخدام. الاستنتاج مهمة أكثر من ال [ليف/ميت] فحص ان [أفن بعد] 48 [ه], ما من خلايا ميتة (حمراء) كان لاحظت, يبرهن ان لا السقالة ماده, ولا انحلال منتجاته يبدي تاثيرات سامه. وعلاوة علي ذلك ، فان ECs في الواقع التمسك وتبقي تعلق داخل السقالات ويبدو ان تشكل اجلمرتر موزعه بالتساوي عندما تزرع داخل القناات. وهذا يوحي بان طريقه التصنيع الموصوفة وتركيبه السقالة توفر اطارا مناسبا للبناء في الانسجه المجرية ، ذات الصلة ، الانبوبيه. والي جانب محاكاة التفاعلات بين الخلية والخلية والاتصالات الخلوية الضيقة في جميع الابعاد المكانية الثلاثة ، تتطلب هندسه الانسجه المعقدة أيضا التعرض المستمر للخلايا إلى الوسط الطازج للحفاظ علي صلاحيتها. وهذا بدوره يمكن ان يتحقق من خلال شبكه قناه كثيفه تحت الانصهار المستمر ، الأمر الذي يستدعي المزيد من التحقيق في العمل في المستقبل ، وسوف تتطلب تحسين المواد والنمو المعلمات لتسهيل الهندسة النسيجية طويلة الأجل من الاوعيه الدموية.

Figure 1
الشكل 1: الاساسيه/شل فوهه النموذج. (ا) يتم عرض التصميم العام والمكونات الرئيسية للنموذج الاولي لجسم الفوهة. يتم الانتهاء من فوهه عن طريق إدخال ابره حاده نهاية G27 من خلال الأعلى. أصحاب ابره الأعلى والأسفل شل وأعاده محاذاة الابره مع محور فوهه ، وضمان ان الطرف يمتد من فوهه من خلال المركز.  لتوصيل فوهه مع "قذيفة" المواد مقذوف من حقنه الثانوية ، يتم إرفاق الأنابيب مع موصل luer-قفل إلى المدخلات الجانبية. من هنا ، يتم توجيه المواد إلى فوهه من خلال قناه ضيقه. تصنيع القناة المذكورة يتطلب الحفر في موقعين ، وإنتاج الثقوب التي تحتاج إلى ان توج بعد التصنيع). (B) هو مبين عن قرب من فوهه مع ابره G27 المدرجة ، وتمتد من فوهه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التشكيل النهائي للب/شل. (ا) يظهر هو فوهه الاساسيه/قذيفة المكتملة مع المحاقن المرفقة بشكل صحيح التي تحتوي علي هيدروجيل (الحق) ، وبناء "قذيفة" والحل عبر ربط (اليسار) مقذوف باسم "النواة". (ب) المبين هو التركيب الأساسي/القذيفة المثبتة في نظام Vitaprint مع اثنين من البثق. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: G-رمز من سقالة أنبوبي. هنا تظهر لقطه من برنامج الطابعة ، وعلي وجه التحديد معاينه المسار (a) والخام g-رمز الطبقة الاولي (B). الرمز g هو مجموعه من التعليمات مع إحداثيات الهدف في الاتجاات المكانية المطلقة (X ، Y ، Z) ، فضلا عن البثق (A ، B) في اتجاات نسبيه. يحدد الأمر G نوع التعليمات ، بينما يمثل G1 الحركة الخطية نحو إحداثيات الهدف و G92 يحدد موضع البداية الاولي. الاضافه إلى ذلك ، يتم تحديد معدل تغذيه الأوامر التالية مع التعليم F في مم/دقيقه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: المقطع العرضي لخصله السقالة ذات التصميم الداخلي المجوف. (ا) المبين هو الشريحة المتقاطعة من السقالة المطبوعة حديثا والمجهزة بعد معالجتها. (ب) المعروض هو شريحة مقطعيه من السقالة بعد احتضانها في وسائل الاعلام الثقافة الخلية ل 72 h. في حين ان شكل فوهه يعرف قذف أنبوب مع جولة الصليب المقطع ، وخيوط يبدو ان الأرض إلى حد ما علي ترسب. ومع ذلك ، تبقي القناة الداخلية سليمه وتحتفظ بشكلها اثناء الاحتضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الاساسيه/شل الطباعة من السقالات. هنا ، يتم عرض تلفيق (ا) من السقالات الانبوبيه المجوفة ثلاثية الطبقات وشكلها النهائي (ب). لتحسين التصور ، تم تلطيخ الحل عبر ربط في النواة مع صبغه حمراء. وتظهر التركيبة استقرارا ميكانيكيا كافيا للاحتفاظ باستقرار السقالة ، حتى وان كانت الهياكل الأكثر سماكه (حتى 10 طبقات ، والبيانات غير المعروضة) ملفقه. وكانت الابعاد الخارجية للهيكل النهائي حوالي 27 مم × 27 مم × 3.5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الفحص الحي/الميت الذي يجري مباشره في السقالات. تم حقن تعليق HUVECs في قناه سقالة الداخلية ، حضنت ل 48 h ، وتعامل مع صبغ الحية/الميتة. HUVECs قابله للحياة تنبعث منها ضوء الفلورية الخضراء ، والتي تمثل في البقع الساطعة من الصورة. الخلايا الميتة تنبعث ضوء الفلورية الخضراء; ومع ذلك ، لا شيء مرئية في سقالة المرصودة. ويدل توزيع الخلايا أيضا علي الشكل والاحتفاظ بقدرات القناات الفوقية. إلى حد صغير ، والحية/الميت حل الفحص الملون أيضا المواد السقالات ، وإنتاج الضوء الفلوري تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تصميم فوهه
باستخدام فوهه الاساسيه/قذيفة المتقدمة ، ودمجها في نظام Vitaprint ثنائي الطارد ، والسقالات جوفاء ، أنبوبي ملفقه في عمليه خطوه واحده. لتحقيق سمك حتى من جدار الأنبوب من خلال معظم السقالات المعدة ، تحتاج الابره إلى وضعها مركزيا علي محور حلقه البثق الخارجي. الابر مقياس قياسي في كثير من الأحيان تظهر طفيف ، ولكن الانحراف كبيره خارج المحور. وهكذا ، تم تصميم الجسم فوهه لعقد الابره في مكانين ، مره واحده في الجزء العلوي (تحديد محور) ومره واحده قبل النهائي الاساسيه/قذيفة غرفه (إصلاح قني نفسها) ، وتصحيح المحاذاة المحورية. تزداد دقه المحاذاة المحورية مع المسافة بين نقطه التثبيت. هناك ، ومع ذلك ، مقايضه بين طول الابره والمتاحة حجم الغرفة فوهه. لتحسين الأداء الوظيفي لمجموعه اضافيه ، يمكن تنفيذ بعض التعديلات من فوهه: A) جبل فوهه مع تحسين الاستقرار ، B) فوات اضافيه لمجموعه أوسع من التوافق ابره ، C) اليه تعديل دقيق لابره تحديد المواقع فوهه ، و D) دمج المدخلات الاضافيه والاجهزه ميكروفلويديك لاعداد المواد ذبابه.

هيدروجيل الأمثل
لتحديد نسبه ALG: CMC الأمثل ، تم تقييم العديد من التكرارات المادية. عموما ، كانت الطباعة الاساسيه/شل مع تركيزات فوق 3 wt .% من كلا المكونات أصبح من المستحيل ، لأنه لم يسمح لتدفق هيدروجيل مستمر أو ادي إلى انسداد فوهه. وعلي وجه التحديد ، زاد تركيز ALG فوق 3 wt .% من اللزوجة بشكل مفرط وأديت إلى انسداد الفوهة ، بينما ابطات تركيزات ALG والتركيزات العليا لل CMC (> 3 بالوزن في المائة) مرات الربط المتداخلة التالي فشلت في توفير ما يكفي من الدعم الهيكلي لسقالة. الاساسيه/شل الطباعة كان من الممكن مع تركيبات اقل لزج. ومع ذلك ، يجب ان تكون اللزوجة هلام مقذوف كافيه للحفاظ علي الإخلاص الشكل علي المدى الطويل. وفي النهاية ، ثبت ان نسبه 1:1 ALG: CMC هي الخيار الأنسب الذي يؤكد دراسة سابقه أجراها Maver et al.49. أضافه NFC تحسنت بشكل ملحوظ الطباعة والصلابة الهيكلية من السقالات المطبوعة الاساسيه/شل ولكن لم يكن لها تاثير كبير علي خصائص الربط بين المواد.

التطبيقات المخصصة ، الأمثل لأنواع خلايا معينه والمجموعات التجريبية سوف تتطلب مواد سقالات مصممه بشكل جيد ، والتي سوف تختلف في التكوين واليات الربط المتبادل. وتستند الطريقة الموصوفة في هذا العمل علي محلول البوليمر الجينات-السليلوز مختلطة ، والتي هي عبر مرتبطة بشكل أيوني باستخدام Ca2 + أيونات. الجينات نفسها هو البوليمر الخطي من كتل (1, 4)-المرتبطة β-د-ماننورنات (م) و α-l-غولورنات (ز) المخلفات التي يمكن ان تكون متقاطعة بشكل أيوني بواسطة تطبيق Ca2 + وغيرها من الكاتيونات ثنائي التكافؤ مثل Sr2 +, Br2 +, Mg 2 +. ومع ذلك ، فان الأيون الأكثر استخداما للربط بين الجينات يبقي Ca2 + في شكل cacl2. كما يمكن استخدام Ca2 + في شكل caso4 أو caco3؛ ومع ذلك ، فان ذوبان منخفضه من CaSO4 نسبه إلى cacl2 يعني بطء gelation. Caco3 غله إبطا الأوقات دبق التي يمكن ان تؤدي إلى خصائص ميكانيكيه ضعيفه وغير متناسقة.

وقت أطول دبق تنتج عاده بناء أكثر تجانسا ، ومع ذلك ، بعض التطبيقات ، مثل الاساسيه/قذيفة الطباعة يتطلب معدلات دبق سريع50. مغ2 + الأيونات أيضا للحث علي gelation; ومع ذلك ، الكفاءة عبر ربط حوالي 5x-10x اقل ، بالمقارنة مع Ca2 +، مع مرات الربط بين 2-3 h. الاضافه إلى ذلك ، أيونات المغنيسيوم هي أكثر انتقائية نحو وحدات guluronic ، التالي فان الربط المتقاطع يعتمد أكثر علي التركيب الكيميائي لل ALG51. في هذه الحالة ، معدل دبق السريع ضروري لضمان تشكيل قناه جوفاء مستمرة قبل الهيكل جوفاء يمكن ان تنهار. Cacl2 غله أسرع معدل دبق ، وهو أمر حاسم لترسب مباشره من خيوط جوفاء. 100 مم CaCl2 وقد استخدمت ، والتي استقرت بشكل كاف في تشكيل مستمر من خيوط جوفاء دون التسبب في تصلب هلام داخل فوهه.

الطباعة ومرحله ما بعد تجهيز السقالات
وينبغي النظر في الخطوات التالية خلال هذا الجزء من العملية ، بما في ذلك 1) ضمان ان جميع الحلول والمواد بما في ذلك البيولوجية 3D يتم تعقيمها بشكل صحيح قبل الطباعة. 2) عند اعداد هيدروجيل ، تجانس المواد أمر حاسم للطباعة المستمرة. وينبغي تجنب إدخال الشوائب أو فقاعات الهواء ، لأنها يمكن ان تسد فوهه و/أو تعطيل قذف. 3) يجب ان تكون متصلا بشكل صحيح المحاقن إلى فوهه الاساسيه/قذيفة عن طريق اليه القفل luer وادراجها بشكل صحيح في يتصاعد الطارد كما راينا في الشكل 2A، B. 4) قبل طباعه بنيه معقده ، فمن المستحسن ان قبل بثق جزء صغير من هلام والحل عبر ربط لمسح فقاعات الهواء الزائدة في النواة/قذيفة فوهه وضمان تدفق هيدروجيل مستمر. ويمكن دمج هذا مباشره في رمز g لتحسين التكرار. 5) ومن المفيد لأضافه تنوره المحيطة سقالة لضمان زرع خيوط جوفاء متجانسة قبل ان تبدا طباعه سقالة نفسها.

بالاضافه إلى ذلك ، 6) لتحسين التصاق بين خيوط الطباعة والركيزة ، فمن المستحسن استخدام سطح مستو مع التصاق جيده (اي ، شريحة زجاجيه أو طبق بيتري). 7) يجب ان لا تكون فوهه البثق في اتصال مباشر مع الركيزة للسماح للتدفق دون انقطاع من هيدروجيل. المسافة الاوليه سوف تؤثر بقوة علي جوده الطباعة ، ولكن سمك خيوط مقذوف هو تقريب جيد من الاعداد الاولي. 8) وينبغي تعديل ارتفاع الطباعة بدءا في رمز g-وفقا للاحتياجات الفردية. بعد الأمثل المعلمات الطباعة ، يجب ان يتم استيراد السقالة g-رمز إلى كوكب التصنيع باستخدام الحاسب الألى البرمجيات وعمليه الطباعة بدات كما هو موضح في البروتوكول. 9) للسيطرة علي وتحسين تدفق هيدروجيل مع نية لطباعه السقالات الأمثل ، وينبغي ان تكون مختلفه تكوين صياغة والمعلمات الطباعة (اي ، سرعه الطباعة ، والضغط البثق ، ودرجه حرارة الطباعة ، والمسافة بين الركيزة و فوهه البثق ، ارتفاع الطبقة ، حجم سقالة ، الخ.).

بشكل عام ، وارتفاع معدلات التدفق مطلوبه لطباعه التركيبات مع اللزوجة اعلي. كما ذكر ، جميع تركيبات هيدروجيل ، والتي هي مناسبه للربط الكيميائي الفوري عبر ربط ، تسمح لتصنيع خطوه واحده من أنابيب جوفاء ويمكن استخدامها مع الاساسيه الموصوفة/قذيفة الاعداد. ويلزم تحسين أليات الطباعة والربط المتقاطع وفقا لذلك. بعد الطباعة ، وكانت جميع السقالات بعد معالجه بواسطة ربط الثانوية مع 5 wt .% CaCl2 الحل ، الذي أكد كامله عبر ربط مكون ALG-CMC وتعقيمها من كلا الجانبين تحت ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه علي الأقل. وينبغي ضمان ان تبتلع السقالة بالبالكامل بحل الربط المتبادل واحتضانها لفتره طويلة بما يكفي لإكمال عمليه الربط المتبادل. ستختلف المعالجة اللاحقة استنادا إلى اليه المواد والربط المتبادل المستخدمة ، التي ينبغي النظر فيها مسبقا. بعد مرحله ما بعد المعالجة ، يجب أزاله السقالات بعناية من الركيزة ، ونقلها إلى وسائل الاعلام الثقافة الخلية ، وحضنت في جو تسيطر عليه علي الأقل 24 ساعة قبل بذر الخلايا. وباستخدام متوسط عديم اللون تحسين رؤية تعليق الخلية اثناء الحقن في السقالات.

الفحص الحي/الميت
يجب ان يتم اعداد الحل الحي/الميت مباشره قبل اجراء الفحص والاحتفاظ بها في الظلام قبل اجراء الفحص ، كما انه يحتوي علي الاصباغ الفلورية التي هي عرضه لتبيض. بعد وقت الحضانة المطلوب ، يجب التخلص من وسائل الاعلام الثقافة الخلية بعناية المحيطة السقالات وشطفها مع تلفزيوني. ومن الناحية المثالية ، يجب استخدام نقطه الدخول نفسها لبذر الخلايا متبوعا بالفحص الحي/الميت الذي يتم حقنه في السقالات.

اهميه النتائج
وقد استخدمت كل من ALG و CMC بالفعل لتعزيز تولد الاوعيه في المختبر. استنادا إلى ميزات ECM-المحاكاة الفيزيائية ، والربط المادي ، والتوافق الحيوي ، وقد تم استخدام ALG عاده كعنصر للتسليم والإفراج عن عوامل النمو الوعائية التي تسيطر عليها (علي سبيل المثال ، bFGF ، HGF ، VEGF164 ، و Ang-1 * علي التوالي)52 ,53,54. وعلاوة علي ذلك ، بالاشتراك مع الجيلاتين ، وقد استخدمت CMC أيضا لتغليف الاوعيه الدموية الغشائية بسبب قدراتها عبر ربط بسرعة في ظل الظروف الفسيولوجية55. تمت أضافه NFC لزيادة الاستقرار الميكانيكي والإخلاص شكل السقالات. وينبغي التاكيد علي ان الهدف لم يكن تعزيز الاوعيه الدموية ولكن لإثبات امكانيه إنتاج السقالات المجوفة القابلة للاستخدام ، والجوفاء ALG-CMC ، المطبوعة في الأزياء الاساسيه/شل ، والتي تسهل أيضا التعلق وانتشار (السيد (هوفياس وكان اختيار استخدام خليط ALG-CMC يستند إلى النتائج الشائعة الاستخدام ، والتي يمكن الوصول اليها بسهوله ، والمواد الاساسيه المتوافقة مع الحيوية التي يمكن ان تمكن الاساسيه/شل الطباعة من قنوات جوفاء. قد تكون العديد من المواد الأخرى خيارات أكثر قابليه للاستمرار لتعزيز تولد الاوعيه. ومع ذلك ، بعض غير مناسبه للطباعة الاساسيه/شل ، لأنها لا تسهل gelation السريع/الربط المتبادل ، وهو أمر حاسم في هذا النهج.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود أصحاب البلاغ ان ينووا بالدعم المالي الذي تلقاه هذا المشروع من وكاله البحوث السلوفينية (أرقام المنح: P3-0036 ، و I0-0029) ، ووزارة العلوم والتعليم والرياضة (رقم المنحة: 5442-1/2018/59).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية ، الإصدار 151 ، الاساسيه/شل ، محوري ، بيورينتينغ ، الهندسة الحيوية ، هندسه الانسجه ، CMC ، الجينات ، أنبوبي ، الانسجه ، الهندسة ، الاوعيه الدموية
الاساسيه/شل السقالات الطباعة للهندسة الانسجه من الهياكل أنبوبي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milojević, M., Vihar, B.,… More

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter