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Bioengineering

ट्यूबलर संरचनाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कोर/

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/59951

Summary

यहाँ प्रस्तुत एक सरल करने के लिए उपयोग, कोर / खोल, खोखले पाड़ के एक कदम निर्माण के लिए तीन आयामी bioprinting सेट अप, संवहनी और अन्य ट्यूबलर संरचनाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त है.

Abstract

कोर/शेल फिलामेंट के तीन आयामी (3 डी) मुद्रण एक स्थिर खोल के साथ चैनल संरचनाओं के प्रत्यक्ष निर्माण की अनुमति देता है जो तरल कोर के साथ इंटरफेस पर क्रॉस-लिंक किया जाता है। बाद के बाद मुद्रण हटा दिया जाता है, एक खोखले ट्यूब के पीछे छोड़. एक योज्य विनिर्माण तकनीक को एकीकृत करना (जैसे दर्जी के साथ यहाँ वर्णित [बायो]inks, जो संरचनात्मक और जैव रासायनिक रूप से देशी extracellular मैट्रिक्स की नकल [ECM]) उन्नत ऊतक इंजीनियरिंग की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है. हालांकि, अच्छी तरह से परिभाषित संरचनाओं के सटीक निर्माण के लिए उपयोग में सामग्री के लिए अनुकूलित निर्माण रणनीतियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, यह अनुकूलन योग्य है कि एक सेट अप के साथ शुरू करने के लिए समझदार है, सरल करने के लिए उपयोग, और सामग्री और अनुप्रयोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ संगत. यह काम वुडपाइल संरचनाओं के कोर/शेल प्रिंटिंग का पता लगाने के लिए लुअर-संगतता के साथ एक आसान-से-निर्माण कोर/शेल नोजल प्रस्तुत करता है, जो एक अच्छी तरह से परिभाषित, एग्जिनेट-आधारित पाड़ सामग्री तैयार करने के साथ परीक्षण किया जाता है।

Introduction

यकीनन, ऊतक इंजीनियरिंग (टीई) का अंतिम उद्देश्य इन विट्रो में कार्यात्मक ऊतकों या अंगों का उत्पादन करना है, जिसका उपयोग मानव शरीर के घायल या रोगग्रस्त भागों को पुनर्जीवित करने या बदलने के लिए किया जा सकता है1,2,3. ऊतक इंजीनियरिंग में वर्तमान अनुसंधान (टीई) क्षेत्र के व्यक्तिगत पहलुओं पर ध्यान केंद्रित किया है (स्केड़िंग सामग्री, निर्माण प्रक्रियाओं, सेल स्रोतों, आदि) 4,5, साथ ही ऊतकों और अंगों के इन विट्रो मॉडल में सरल विकास करना जो विवो समकक्षों में उनके मौलिक पहलुओं की नकल करते हैं। इस तरह के मॉडल पहले से ही कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं, जैसे दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन, विशेष रूप से मामलों में जहां पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृतियों देशी ऊतकों के गतिशील प्रतिक्रियाओं की नकल करने में विफल6,7, 8,9. इन विट्रो मॉडल में तीन आयामी आम तौर पर कोशिकाओं के संयोजन के द्वारा निर्माण कर रहे हैं10, भौतिक रासायनिक संकेत11, और जैविक रूप से सक्रिय अणुओं12,13 पाड़ पर, जो से प्राप्त कर रहे हैं जैविक या जैव संगत सामग्री 14 ,15,16,17,18से विकोलेड टीस या निर्मित डी नोवो .

यह महत्वपूर्ण है कि पाड़ जटिल 3 डी microarchitecture और देशी ऊतकों के पदानुक्रम संरचना recapitulate इंजीनियर ऊतकों की कार्यक्षमता को सक्षम करने के लिए, विवो ऊतकों में के प्रतिनिधि19. टीई में महत्वपूर्ण तकनीकी प्रगति के बावजूद, शारीरिक रूप से प्रासंगिक कृत्रिम ऊतक ों का विकास एक चुनौती बनी हुई है। मोटे ऊतक ( मोटाई में 200 डिग्री मी) विशेष रूप से समस्याग्रस्त होते हैं, ऑक्सीजन और पोषक विसरण20जैसी सीमाओं के कारण। बड़े ऊतक निर्माण की दिशा में प्रगति की गई है; हालांकि, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन और अपशिष्ट हटाने को बढ़ावा देने के लिए रक्त वाहिकाओं के लिए कोशिकाओं की आवश्यक उच्च निकटता recapitulated किया जाना चाहिए। ऊतकों के संवहनीकरण (या वैकल्पिक रूप से, ऊतक निर्माण के भीतर परस्पर 3 डी संवहनी नेटवर्क का निर्माण) सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और इन विट्रो इंजीनियर ऊतकों के कार्यों को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो के लिए और अधिक कठिन है लंबे प्रयोगों में मॉडल21,22. इसके अलावा, आवश्यक संकल्प, संरचनात्मक अखंडता, और एक साथ जैव संगतता अभी तक23प्राप्त किया जाना है.

रक्त वाहिका जैसी संरचनाओं का निर्माण करने और इन विट्रो में संवहनी की सुविधा प्रदान करने के प्रयास में कई टीई दृष्टिकोण का प्रस्ताव किया गया है। कुछ उदाहरणों में शामिल हैं बोने endothelial कोशिकाओं (भी सह इस तरह के फाइब्रोब्लास्ट के रूप में अन्य कोशिकाओं के प्रकार के साथ खेती) कि स्वयं इकट्ठा microvascular नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए24, संवहनी जनक कोशिकाओं और pericytes कि endothelial सेल को बढ़ावा देने का उपयोग विकास21,25, एंजियोजेनिक विकास कारकों की डिलीवरी जो संवहनी20,26को प्रेरित करती है , सेल शीट प्रौद्योगिकी का उपयोग करके जो संवहनी लेयरिंग20पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है , और के निर्माण अत्यधिक छिद्रयुक्त पाड़ संरचनाएं जो एंजियोजेनेसिस27को बढ़ावा देती हैं . उल्लेख दृष्टिकोण एंजियोजेनेसिस प्रेरण पर ध्यान केंद्रित है, जो आम तौर पर अतिरिक्त विकास कारकों की काफी मात्रा की आवश्यकता है (जैसे, VEGF) और समय के लिए फार्म. हालांकि, सबसे बड़ी कमियां उनके सीमित reproducibility और संवहनी पैटर्न पर प्रतिबंधित स्थानिक नियंत्रण कर रहे हैं, आम तौर पर ऊतक निर्माण के भीतर एक यादृच्छिक vasculature वितरण में जिसके परिणामस्वरूप जरूरी भ्रम की सुविधा नहीं है.

Additive विनिर्माण (AM, जैसे 3 डी bioprinting) तेजी से 3 डी के निर्माण में शामिल है जैविक या bioसंगत सामग्री का उपयोग कर TE के लिए उपयुक्त पाड़ बनाने के लिए निर्माण. कई AM दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा रहा है और समानांतर में विकसित (उदा., स्याही जेट और microextrusion आधारित तरीकों, लिथोग्राफी तकनीकों के विभिन्न प्रकार) पाड़ है कि उनकी वास्तुकला में देशी ऊतकों की नकल का उत्पादन करने के लिए, जैव रसायन, और कार्यक्षमता . व्यक्तिगत तकनीक कुछ लाभ और नुकसान28प्रदर्शन , यही वजह है कि विभिन्न संशोधनों का पता लगाया जा रहा है (उदा., माइक्रो-पैटर्निंग, प्रेरित एंजियोजेनेसिस, आदि) हद तक बढ़ाने के लिए जो बड़े, जटिल, और स्थिर संवहनी नेटवर्क22,29,30गढ़े जा सकते हैं .

इनमें से, बाहर निकालना bioprinting सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है, विशेष रूप से संगत सामग्री की व्यापक रेंज के कारण (एक आम तौर पर सेल के अनुकूल प्रक्रिया28,31,32) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से असाधारण बहुमुखी प्रतिभा में अनुप्रयोगों की शर्तें (जैसे, एम्बेडेड और यज्ञ मुद्रण23,33, खोखले संरचनाओं का निर्माण34,35, आदि)। मुख्य चुनौतियों preoccupying वर्तमान अध्ययन 2 डी से 3 डी संरचनाओं के लिए स्थानांतरण, उच्च स्थानिक संकल्प के साथ खोखले ट्यूबों के एक घने नेटवर्क के गठन, और सेल संस्कृति में तरल पदार्थ प्रवाह के दौरान समग्र यांत्रिक अखंडता और आकार निष्ठा शामिल हैं शर्तें30|

perfusable ऊतक के लिए सबसे सीधा दृष्टिकोण निर्माण के भीतर चैनलों के एक जुड़े नेटवर्क का निर्माण है. एक ऊतक पाड़ के भीतर इस तरह के perfusable चैनलों के निर्माण के लिए ऊपर उल्लिखित समस्याओं के कई हल की उम्मीद है, क्योंकि यह तुरंत पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रसार के लिए अनुमति देता है, जबकि अपशिष्ट उत्पादों को हटाने. अतः निर्माण के भीतर नेक्रोटिक क्षेत्रों के संभावित निर्माण से बचा जाताहै। ऐसे चैनलों को अतिरिक्त रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी ) के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और 3 डी ऊतक मॉडल37में कृत्रिम रक्त वाहिकाओं के रूप में काम किया जा सकता है . सबसे प्रारंभिक अर्थों में, एक पोत में एक खोखले चैनल, ईसी की नरम परत, और कठोर खोल शामिल हो सकते हैं। हाल ही में, एक कोर/ खोल फैशन में दो अलग-अलग सामग्रियों के 3 डी बाहर निकालना बाहर निकालना के लिए सह-अक्षीय सुइयों का उपयोग बहुत ब्याज प्राप्त किया है38,39,40,41, के रूप में यह के निर्माण के लिए अनुमति देता है खोखले ट्यूब.

पारंपरिक microextrusion 3 डी मुद्रण के समान, कोर / खोल मुद्रण एक सह-अक्षीय नोजल के साथ किया जाता है (उदा., विभिन्न व्यास के साथ दो सुइयों एक तरह से एक ही धुरी पर गठबंधन किया है, ताकि व्यापक सुई संकरा एक encloses). इस प्रकार, दो सामग्री एक साथ extruded किया जा सकता है, केंद्रीय तंतु या "इनर" कोर के रूप में एक और एक दूसरे के रूप में "बाहरी" खोल41के साथ. आज तक, सह-अक्षीय बायोप्रिंटिंग का उपयोग ठोस42, कोर/शेल43, और खोखले किस्में40,44के साथ संरचनाओं को बनाने के लिए किया गया है ; हालांकि, इस्तेमाल सामग्री दोनों इष्टतम सेल व्यवहार्यता और मुद्रित निर्माण के यांत्रिक मजबूती के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है. जैसा कि उल्लेख किया है, तकनीक विभिन्न यांत्रिक गुणों के साथ biomaterials गठबंधन करने की संभावना प्रदान करता है, जिसमें stiffer एक नरम एक का समर्थन करता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, अगर पाड़ सामग्री (जैसे, alginate, carboxyethyl सेलूलोज़) खोल के रूप में extruded है, जबकि पार से बना कोर जोड़ने एजेंट (जैसे, कैल्शियम क्लोराइड) आंतरिक केशिका से वितरित किया जाता है तो बाद मुद्रण बाहर कुल्ला, यह है एक ही चरण में एक सतत खोखले ट्यूब बनाने के लिए संभव45.

इसे ध्यान में रखते, एक सरल और repeatable एक कदम विधि संवहनी संरचनाओं और अन्य ट्यूबलर ऊतकों की इंजीनियरिंग के लिए अच्छी तरह से परिभाषित और perfusable पाड़ का निर्माण करने के लिए विकसित किया गया था. एक लागत प्रभावी प्रौद्योगिकी विकसित करने के लिए, निर्माण आदर्श रूप से एक एकल चरण प्रक्रिया होनी चाहिए। इसलिए, एक कोर/शेल सेट-अप को अनुकूलित किया गया था और 3 डी बायोप्रिंटर में एकीकृत किया गया था। बुनियादी डिजाइन इंजेक्शन के दौरान विरूपण से बचने के लिए धातु से बना एक केंद्रीय नोजल के होते हैं, जिसके आसपास एक बड़ा व्यास का दूसरा नोजल रखा जाता है। इस तरह के एक सह-अक्षीय नोजल सेट अप दो प्रवाहों के सह-बाहर निकलने और extruded hydrogel चैनल के तत्काल पार से जोड़ने के लिए अनुमति देता है। यह बहुस्तरीय खोखले तंतुओं का प्रत्यक्ष निर्माण करने में सक्षम बनाता है, जबकि बाद में कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2)की उच्च सांद्रता के साथ क्रॉस-लिंकिंग बाहर से अधिक स्थायी स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है।

जैसे, इस विधि पाड़ और microchannels, जिसमें खोखले hydrogel फिलामेंट एक पाड़ के रूप में सेवा करने के लिए 3 डी constructs के यांत्रिक अखंडता का समर्थन और एक साथ के रूप में कार्य के समवर्ती मुद्रण के लिए अनुमति देता है में निर्मित microchannels देने के लिए कोशिका विकास के लिए पोषक तत्वों. यह प्रोटोकॉल एक कस्टम-निर्मित सह-अक्षीय नोजल के उपयोग के आधार पर कोर/शेल 3 डी बायोप्रिंटिंग रणनीति की एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है जिसमें निर्मित चैनलों के साथ हाइड्रोजेल 3 डी संरचनाओं को खोखले फिलामेंट का उत्पादन करने के लिए क्रॉस-लिंकिंग को नियंत्रित करके निर्मित किया जाता है, जो सेल संस्कृति के दौरान perfusable रहते हैं.

इस कार्य में उपयोग किया गया 3D प्रिंटिंग सेट-अप पहले के रूप में कॉन्फ़िगर किया गया है जो पहले Banovi और विहार46 द्वारा वर्णित है और इसे तीन मुख्य घटकों में विभाजित किया जा सकता है: A) एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में 50 डिग्री मीटर पोजीशनिंग सटीकता के साथ तीन-अक्ष सीएनसी यांत्रिक सेट-अप; बी) दो extruders, डिस्पोजेबल के लिए अनुकूलित, 5 एमएल luer-लॉक सिरिंजों, 1.2 $L voxel संकल्प के साथ; और सी) इलेक्ट्रॉनिक्स और सॉफ्टवेयर को नियंत्रित करने.

कोर/शेल प्रिंटिंग की सुविधा के लिए, एक उपयुक्त नोजल विकसित किया गया था जिसे एक्सट्रूडर्स में से एक पर रखा जा सकता है (प्राथमिक एक्सट्रूडर, कोर प्रिंट करना) और जी 27 कुंद-एंड सुइयों के साथ संगत है। यह भी दूसरे extruder के साथ कनेक्ट करने के लिए luer-लॉक संगतता है (खोल मुद्रण). पहले प्रोटोटाइप एक कुंद अंत G27 सुई डालने के द्वारा निर्मित किया गया (इनर व्यास ] 210 $m, बाहरी व्यास $ 410 $m) या तो एक G21 सुई में (इनर व्यास ] 510 $m, बाहरी व्यास ] 820 m) या G20 शंकु टिप (इनर व्यास ] 600 m), तो एक माध्यमिक n डालने बाद में खोल सामग्री की आपूर्ति करने के लिए edle. हालांकि, सुई शाफ्ट के मामूली झुकने के कारण, आंतरिक और बाहरी सुइयों के गाढ़ा संरेखण के साथ एक नोजल टिप का उत्पादन करना संभव नहीं है।

इस समस्या को हल करने के लिए, एक नया नोजल डिजाइन तैयार किया गया था कि निम्नलिखित मानदंडों को पूरा: 1) यह एक 3-अक्ष सीएनसी मिल का उपयोग कर निर्मित किया जा सकता है, 2) यह विभिन्न सामग्रियों से बनाया जा सकता है (उच्च प्रदर्शन प्लास्टिक, जैसे PEEK या धातुओं), 3) यह luer-लॉक संगतता है शेल सामग्री लागू करने के लिए, और 4) एक G27 कुंद अंत सुई के लिए संगत है और यह दो पदों पर जगह में रखती है केंद्रीय अक्ष के साथ टिप संरेखित करें. नोजल प्रोटोटाइप का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है।

Protocol

1. hydrogels और पार से जोड़ने समाधान की तैयारी

  1. संक्षेप में, तेजी से मिश्रण करके, अल्ट्रा शुद्ध पानी में ALG और सीएमसी पाउडर भंग कुल प्राप्त करने के लिए 3 wt% ALG और 3 wt% सीएमसी समाधान.
    नोट: इस काम में, 5 एमएल सिरिंजों मुद्रण के लिए उपयोग किया जाता है; इस प्रकार, सामग्री की अंतिम राशि है कि मात्रा में समायोजित किया जाता है. हालांकि, अन्य बाहर निकालना कारतूस और मुद्रित नमूना आकार के लिए, तैयार सामग्री की मात्रा तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए.
  2. मुद्रण के लिए उपयुक्त वांछित चिपचिपापन तक पहुँचने के लिए अतिरिक्त यांत्रिक सुदृढीकरण के लिए ALG-सीएमसी मिश्रण में 1.5 wt% सेलूलोज़ नैनोफाइबर जोड़ें।
  3. एक ओवरहेड मिक्सर का उपयोग कर सजातीय जब तक hydrogel निलंबन आंदोलन.
    नोट: कोई फाइबर या बुलबुले hydrogel में मौजूद होना चाहिए.
  4. अति-शुद्ध जल में 100 एमएल कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2)घोल तैयार की जाती है, जिसका उपयोग मुद्रण के लिए प्राथमिक क्रॉस-लिंकिंग समाधान के रूप में किया जाता है।
  5. अल्ट्रा शुद्ध पानी है, जो पाड़ के बाद प्रसंस्करण में एक माध्यमिक पार लिंकिंग समाधान के रूप में प्रयोग किया जाता है में 5 wt.% CaCl2 समाधान के 10 एमएल तैयार करें.
    नोट: आम तौर पर, सभी hydrogel योगों, जो तत्काल रासायनिक पार से जोड़ने के लिए उपयुक्त हैं, खोखले ट्यूबों के एक कदम निर्माण के लिए अनुमति देते हैं और कोर के इस प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता / मुद्रण और क्रॉस-लिंकिंग तंत्र को तदनुसार अनुकूलित किए जाने की आवश्यकता है। हाइड्रोजेल की चिपचिपापन वांछित संरचना के आधार पर अलग-अलग होगी; हालांकि, यह बहुलक सांद्रता और मोटाई एजेंटों के अलावा के साथ समायोजित किया जा सकता है (उदा., नैनोफाइबर)। स्थिर संरचनाओं के 3 डी मुद्रण के लिए आदर्श चिपचिपापन अपने आकार को बनाए रखने के लिए extruded फिलामेंट के लिए पर्याप्त उच्च है और पाड़ के लिए पार से जोड़ने से पहले अपने स्वयं के वजन पकड़.

2. perfusable पाड़ के कोर / खोल मुद्रण

  1. मुद्रण से पहले, 70% इथेनॉल अच्छी तरह से छिड़काव और यह 1 एच के लिए यूवी प्रकाश को बेनकाब द्वारा bioprinter बाँझ.
  2. bioprinter चालू करें और नियंत्रण सॉफ्टवेयर है, जो 3 डी प्रिंटर के साथ एक बंडल में आता है चलाते हैं.
  3. होम आइकन दबाकर homing प्रक्रिया निष्पादित करें।
  4. उपकरण पट्टी आदेश फ़ाइल का उपयोग करना | जी कोड आयातकरें, जनरेट किए गए पाड़ g-कोड आयात करें.
  5. एक बाँझ 5 एमएल सिरिंज के लिए hydrogel स्थानांतरण और 3 डी प्रिंटर के extruder mounts में से एक में जगह है. ल्यूर-लॉक और एक छोटी ट्यूब के माध्यम से, कोर/शेल नोजल के साइड लूर इनपुट से कनेक्ट करें।
  6. क्रॉस-लिंकिंग समाधान (100 एमएम CaCl2)को एक संलग्न G27 कुंद-एंड सुई के साथ एक बाँझ 5 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें और इसे कोर/शेल नोजल के शीर्ष सुई धारक में डालें। भीतरी सुई को बाहरी कोर/खोल नोजल से थोड़ा आगे निकलना चाहिए । संरेखण को मैन्युअल रूप से समायोजित करें. बाहर निकालना माउंट में दूसरी सिरिंज डालें.
  7. माउंटमें सीरिंज को सही ढंग से सम्मिलित करने के लिए (चित्र 2में दिखाया गया सेट-अप), मैन्युअल रूप से A और B और ऊपर और नीचे तीरों पर क्लिक करके दोनों एक्सट्रूज़न माउंट नियंत्रित करते हैं.
  8. मुद्रण शुरू होने से पहले, कोर/शेल नोजल में सभी अतिरिक्त वायु बुलबुले को साफ करने और एक सतत हाइड्रोजेल प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए अलग से हाइड्रोजेल और क्रॉस-लिंकिंग समाधान को निकाल दें।
  9. $ और ऊपर और नीचे तीर का उपयोग करना, मैन्युअल रूप से नोजल और मुद्रण सब्सट्रेट के बीच की दूरी को समायोजित करें। यह एक फ्लैट, ग्लास-प्रिंटिंग सब्सट्रेट, जो अच्छा आसंजन है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। बाहर निकालना नोजल hydrogel के निर्बाध प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट के साथ संपर्क में नहीं होना चाहिए। नोजल और सब्सट्रेट (परत ऊंचाई) के बीच इष्टतम दूरी आम तौर पर बाहरी नोजल व्यास की चौड़ाई के रूप में ही है, लेकिन यह इस्तेमाल सामग्री और व्यक्तिगत मुद्रण मापदंडों के लिए समायोजित किया जाता है। व्यक्तिगत आवश्यकताओं के अनुसार प्रारंभिक मुद्रण ऊँचाई समायोजित करें.
  10. मुद्रण प्रक्रिया प्रारंभ करने के लिए चलाएँ बटन दबाएँ।
    नोट: यह वास्तविक पाड़ शुरू होता है की छपाई से पहले एक समरूप खोखले फिलामेंट के बिछाने सुनिश्चित करने के लिए पाड़ के आसपास एक स्कर्ट के मुद्रण शामिल करने के लिए सिफारिश की है (चित्र ा0पा)। इष्टतम पाड़ मुद्रित करने के इरादे से इष्टतम hydrogel प्रवाह को प्राप्त करने के लिए, निर्माण संरचना, पार से लिंकिंग समाधान संरचना, और मुद्रण मापदंडों (यानी, मुद्रण गति, बाहर निकालना दबाव, मुद्रण तापमान, के बीच की दूरी भिन्न सब्सट्रेट और बाहर निकालना नोजल, आदि).
  11. मुद्रण के बाद, ध्यान से मुद्रित पाड़ के साथ सब्सट्रेट हटाने और पूरे पाड़ पर पार लिंक सुनिश्चित करने के लिए पूरे पाड़ पर माध्यमिक पार लिंकिंग समाधान (5 wt.% CaCl2)डालना. कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: सुनिश्चित करें कि पूरे पाड़ पार से जोड़ने समाधान में जलमग्न है. यह कदम पाड़ की वांछित शक्ति गुणों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन सामग्री और पार से जोड़ने का इस्तेमाल विधि के आधार पर अलग अलग होंगे.
  12. एक स्केलपेल का उपयोग कर मैन्युअल रूप से अतिरिक्त स्कर्ट सामग्री में कटौती।
  13. 30 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश के तहत पाड़ बंध्याकरण ध्यान से पाड़ फ्लिप और नसबंदी प्रक्रिया को दोहराने.
  14. ध्यान से धीरे यह बग़ल में खींच द्वारा सब्सट्रेट से पाड़ अलग. यदि पाड़ सब्सट्रेट करने के लिए दृढ़ता से पालन करता है, यह उन दोनों के बीच एक तेज धार डालने से अलग.
  15. एक बेरंग सेल संस्कृति मीडिया में पाड़ स्थानांतरण (DMEM 5 wt.% FBS, 100 U/mL पेनिसिलिन और 1 mg/mL streptomycin के साथ पूरक), और उन्हें एक वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 5 wt.% सीओ2 कम से कम 24 एच के लिए.

3. endothelial कोशिकाओं और जीने / मृत परख समाधान की तैयारी

  1. सेल culturing के लिए, जोड़ा phenol लाल के साथ उन्नत DMEM सेल संस्कृति माध्यम तैयार करने और 5 wt.% FBS और 2 एम एम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक. 100 U/mL पेनिसिलिन और 1 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
  2. मानव नाभि शिरा अंत:कक्षीय कोशिका (एचयूवीईसी) रेखा शुरू करें और उन्हें HUVEC culturing प्रोटोकॉल के अनुसार पारित करें जैसा किवर्णित 47.
    नोट: यह नीचे वर्णित के रूप में सफेद पारदर्शी पाड़ में कोशिकाओं के इंजेक्शन के दौरान सरल दृश्य के लिए जोड़ा phenol लाल के साथ सेल संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं संस्कृति के लिए सिफारिश की है.
  3. सेल गिनती के लिए, सेल संस्कृति मीडिया में निलंबित कोशिकाओं के pipette 100 $L और उन्हें 0.1 wt.% trypan नीले समाधान के 900 $L के साथ दाग.
  4. गिनती और निलंबन में कोशिकाओं की अनुमानित संख्या प्राप्त करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर या मैनुअल हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  5. लाइव/डेड परख के लिए, बाँझ पीबीएस में 4 एम कैलसीन-एएम और 2 एम एम प्रोपिडियम आयोडाइड का समाधान तैयार करें।
    नोट: लाइव /मृत समाधान परख आयोजित करने से पहले सीधे तैयार किया जाना चाहिए।

4. पाड़ में कोशिकाओं को स्थानांतरित करना

  1. सेल संस्कृति मीडिया से पाड़ निकालें और उन्हें एक पर्याप्त बड़े गिलास पेट्री डिश में हस्तांतरण.
  2. तुरंत पाड़ में कोशिकाओं इंजेक्शन से पहले, 0.25 wt.% trypsin द्वारा उपचार का उपयोग कर फ्लास्क से HUVECs अलग.
    1. संक्षेप में, सेल संस्कृति मीडिया को निपटाने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.25 wt.% ट्रिप्सिन ($2 एमएल) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. ऊष्मायन के बाद कोशिका संस्कृति मीडिया के 3 एमएल trypsinized कोशिकाओं को जोड़ने और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सभी अलग कोशिकाओं को स्थानांतरित.
    3. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट का निपटान करें।
    4. नए सेल कल्चर मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें.
  3. पहले बताए गए अनुसार कक्षों की गणना करें. व्यक्तिगत जरूरतों के अनुसार कुल सेल एकाग्रता समायोजित करें. इस कार्य में, 340,000 कोशिकाओं/एमएल की प्रारंभिक सांद्रता का उपयोग किया जाता है।
  4. एक संलग्न कुंद G27 सुई के साथ एक बाँझ सिरिंज में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
  5. एक प्रवेश बिंदु का पता लगाएं और ध्यान से पाड़ में कोशिकाओं इंजेक्शन शुरू करते हैं. एक पारदर्शी पाड़ के माध्यम से सेल निलंबन प्रवाह दिखाई जानी चाहिए. सुनिश्चित करें कि पूरे पाड़ सेल निलंबन के साथ भरता है.
  6. सेल संस्कृति मीडिया में पाड़ डूब और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए 5 wt.% सीओ2 युक्त वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें इनक्यूबेट।
  7. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार सेल संस्कृति मीडिया को पूरा करें।

5. लाइव / मृत परख और सेल इमेजिंग

  1. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ पाड़ कुल्ला.
  2. एक कुंद अंत सुई के साथ, ध्यान से पहले से तैयार लाइव / मृत समाधान (4 एमएम कैल्सिन-एएम और पीबीएस में 2 एमएम प्रोपिडियम आयोडाइड) को पाड़ में इंजेक्ट करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि समाधान पूरे पाड़ की लंबाई के माध्यम से बहती है.
  3. पीबीएस के साथ पाड़ कुल्ला.
  4. ध्यान से एक गिलास स्लाइड करने के लिए पाड़ हस्तांतरण।
  5. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत पाड़ में सीधे रंगे कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं हरी फ्लोरोसेंट और मृत कोशिकाओं लाल फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन का उत्पादन।

Representative Results

इस कार्य का उद्देश्य वुडपाइल संरचनाओं के कोर/शेल मुद्रण के लिए लुअर-संगतता के साथ एक आसान-से-निर्माण कोर/शेल नोजल विकसित करना था। इसके अलावा, एक सीधा और repeatable एक कदम मुद्रण प्रोटोकॉल, जो संशोधित करने के लिए सरल है और सामग्री और विभिन्न रासायनिक पार से जोड़ने तंत्र की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से परिभाषित और perfusable पाड़ का निर्माण करने के लिए वर्णित किया गया था संवहनी और अन्य ट्यूबलर ऊतक संरचनाओं की इंजीनियरिंग.

कोर/शेल नोजल
नोजल एक G27 कुंद अंत सुई से बना है (आंतरिक अक्षीय फिलामेंट मुद्रण के लिए) और नोजल शरीर, जो जगह में सुई रखती है और सामग्री इनपुट के लिए एक कनेक्शन बंदरगाह के साथ खोल फिलामेंट के लिए एक बाहरी नोजल बनाता है. एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है। दो 5 एमएल सिरिंज, जो व्यक्तिगत extruders में रखा जाता है और कोर और खोल सामग्री प्रदान करते हैं. ट्यूबिंग सिरिंज के साथ नोजल शरीर को जोड़ता है, खोल सामग्री प्रदान करता है।

कोर/शेल नोजल और सिरिंज सेट-अप की पूरी असेंबली चित्र 2में दिखाई गई है। नोजल शरीर का पहला कार्यात्मक प्रोटोटाइप सीएनसी मिलिंग द्वारा polyoxymethylene (पोम) के एक ब्लॉक द्वारा निर्मित किया गया था. संगतता और तत्व के बीच सील, एक G27 सुई और टयूबिंग Vitaprint में स्थापित करके परीक्षण किया गया था. नोजल, ल्यूर-लॉक कनेक्टर, या शरीर और सुई के बीच में खोल सामग्री का कोई रिसाव नहीं देखा गया था। नोजल शरीर सुई हब (ल्यूर कनेक्टर) के साथ कसकर फिट बैठता है, extruder के साथ पूरे नोजल के सिंक्रनाइज़ गति सुनिश्चित करने.

Scaffold इमारत
पाड़ fabricats fabricating के लिए सबसे सीधा दृष्टिकोण परत जहां मुद्रण दिशा हर लगातार परत बदल जाता है द्वारा सामग्री परत जमा करके है, आम तौर पर 90 डिग्री के कोण पर. हाइड्रोगेल्स के विस्को-लोचदार और आर्द्रताग्राही गुणों के कारण, मुद्रित संरचनाओं की आकृति निष्ठा को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इस प्रोटोकॉल अनुभाग का मुख्य उद्देश्य दो पॉलिमर का उपयोग करperfusable कोर / खोल पाड़ की 3 डी मुद्रण है, जो पहले से बढ़ के लिए सेलूलोज़ नैनोफाइबर (एनएफसी) के अलावा के साथ पाड़ निर्माण (ALG और सीएमसी) के लिए आशाजनक परिणाम दिखाया है यांत्रिक स्थिरता. दोनों ALG और सीएमसी नकारात्मक चार्ज कर रहे हैं, पानी में घुलनशील रैखिक copolymers48 और दोनों carboxyl समूहों, जो divalent cations के अलावा के साथ पार से जुड़ा जा सकता है होते हैं. Ca2 + कणों एक साथ दो कार्यात्मक समूहों के साथ आयनिक बांड फार्म, बहुलक श्रृंखला के बीच कनेक्शन बनाने, जेल कठोरता बढ़ रही है।

perfusable पाड़ का मुद्रण
इस प्रक्रिया का उद्देश्य 3 डी प्रिंट सरल woodpile पाड़ संरचनाओं, जो कई परतों पर अवधि और उनके आकार निष्ठा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से perfusability बनाए रखने के लिए जब तक पूरी तरह से पार से जुड़े होते हैं. यह भी विदेशी या वापसी आंदोलनों, जो प्रवाह में बाधा कर सकते हैं बिना कोर और खोल के coextrusion की आवश्यकता है. इसलिए, ठेठ सीएडी मॉडलिंग और टुकड़ा करने के तरीके कम उपयुक्त हैं. इस कार्य में, मैन्युअल रूप से डिज़ाइन किया गया g-कोड का उपयोग किया जाता है, और एक python-आधारित g-कोड जनरेटर तेज़ g-कोड तैयारी के लिए विकसित किया गया था।

पाड़ एक woodpile ग्रिड आकार में संरचित और एक फ्लैट कांच की सतह पर बनाया गया था. निर्माण परत-दर-परत किया गया था, पिछले एक करने के लिए 90 डिग्री एक कोण में प्रत्येक सफल परत के पार लाइनों जमा. इसके अतिरिक्त, प्रत्येक सफल परत एक्स और वाई दिशाओं में 2% संकरा था, पूर्ववर्ती परतों द्वारा निरंतर फिलामेंट समर्थन सुनिश्चित करने. तंतु (मैक्रोपोर आकार) के बीच की दूरी को एक्सट्रूड फिलामेंट (0ण्8 मिमी) के बाहरी व्यास और ग्रिडलाइनों (3 मिमी) के बीच की दूरी को ध्यान में रखते हुए जी-कोड में सटीक रूप से डिजाइन किया जा सकता है।

Scaffolds आगे विचार के लिए महत्वपूर्ण शामिल किए जाने के मानदंड को पूरा करने के लिए आवश्यक थे. सबसे पहले, ऊंचाई में कम से कम 4 परतों के साथ पाड़ को अपनी संरचनात्मक अखंडता और ज्यामिति (उदाहरण के लिए, मैक्रोपोर आकार) मुद्रण के दौरान बनाए रखने के लिए आवश्यक थे, आगे के विकास के लिए पात्र होने के लिए. दूसरा, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति मीडिया में 7 दिनों के लिए incubated किया जा रहा है के बाद भी perfusable (स्थिर microchannels) रहने की जरूरत पाड़. उचित समय अंतराल पर (1, 2, 5, और 7 दिन) पाड़ संस्कृति मीडिया से बाहर ले जाया गया और अगर वे अभी भी perfusable थे देखने के लिए परीक्षण किया गया. चित्र 4A में,एक ताजा मुद्रित और बाद संसाधित पाड़ के पार अनुभाग फिलामेंट के अंदर एक स्पष्ट रूप से दिखाई खोखले चैनल प्रदर्शित करता है. चित्र 4ख में,यह स्पष्ट है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति मीडिया में 72 एच ऊष्मायन के बाद भी, फिलामेंट पूरे पाड़ लंबाई के माध्यम से खोखले संरचना को बरकरार रखता है।

कई योगों मुद्रण योग्य थे, संरचनात्मक रूप से स्थिर बने रहे, मुद्रित ज्यामिति संरक्षित, और perfusable बने रहे; हालांकि, एक भी एक आगे परीक्षण के लिए चुना गया था (यानी, 3 wt.% ALG + 3 wt.% सीएमसी + 1.5 wt.% एनएफसी), जो अप करने के लिए 10 परतों के साथ perfusable पाड़ के मुद्रण की अनुमति दी. कस्टम नोजल के साथ मुद्रण प्रक्रिया चित्र 5कमें दिखाई गई है। कोर/शेल प्रिंटिंग कम चिपचिपा योगों के साथ संभव था; हालांकि, उच्च सांद्रता के साथ जैल नोजल के माध्यम से निरंतर प्रवाह की अनुमति नहीं दी. प्राथमिक पार लिंकिंग के लिए (कोर सामग्री, मुद्रण के दौरान दिया) 100 m CaCl2 का उपयोग किया गया था, जो पर्याप्त रूप से एक खोखले फिलामेंट के निरंतर गठन स्थिर, नोजल के भीतर जेल solidification के कारण के बिना. मुद्रण के बाद, पाड़ एक 5 wt.% CaCl2 समाधान में भिगो रहे थे पूरी तरह से पार लंबी अवधि के आकार निष्ठा के लिए hydrogel लिंक. एक समाप्त पाड़ नमूना चित्र 5Bमें चित्र है. अनुकूलन के दौरान, एक कृत्रिम डाई तैयार करने की प्रक्रिया दृश्य मूल्यांकन और extruded फिलामेंट की गुणवत्ता की जांच की अनुमति देने के लिए, मुख्य समाधान में इस्तेमाल किया गया था। डाई अंतिम पाड़, जो सेल बोने और खेती के लिए तैयार किए गए थे के निर्माण के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था.

लाइव/मृत परख
ऊष्मायन के बाद, ईसीएस की कल्पना करने और इनक्यूबेट किए गए पाड़ के भीतर जीवित (हरा) और मृत (लाल) कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए एक जीवित/मृत परख का उपयोग किया गया था। यह दो मुख्य प्रयोजनों की सेवा: ए) पाड़ एक bioसंगत वातावरण प्रदान करने के लिए सेल पर हानिकारक प्रभाव का प्रदर्शन के बिना विकास और आसंजन को बढ़ावा देने के लिए, और बी) ट्यूबलर संरचनाओं की संरचनात्मक अखंडता कल्पना करने के लिए और उनके अधिक विस्तार में आंतरिक चैनल प्रणाली.

लाइव/मृत परख के परिणाम चित्र 6में दिखाए गए हैं। इंट्रासेल्यूलर एस्टरेस की उपस्थिति में, प्लाज्मा झिल्ली पारगम्य कैल्सीन-एएम को कैल्सीन में बदल दिया जाता है, जिससे लाइव कोशिकाओं में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन होता है। दूसरी ओर, एपोटोटिक कोशिकाओं को झिल्ली अपारगम्य प्रोपिडियम आयोडाइड द्वारा कल्पना की जाती है, जो डीएनए डबल हेलिक्स में इंटरक्लेटेड होने पर लाल रंग में फ्लोरेस जताता है। लाइव / मृत छवियों और पाड़ के उज्ज्वल क्षेत्र चित्रों खोखले चैनलों के अंदर कोशिकाओं कल्पना में मदद करने के लिए संयुक्त किया गया. धुंधला समाधान इंजेक्शन था, और परख 48 एच के लिए पाड़ सेल ऊष्मायन के बाद 3 डी मुद्रित पाड़ में सीधे प्रदर्शन किया.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ईसी के एक अपेक्षाकृत छोटे सीडिंग घनत्व (340,000 कोशिकाओं /एमएल) का इस्तेमाल किया गया था, क्योंकि इस अध्ययन में केवल पर्फ्यूसेबल पाड़ के कोर/खोल मुद्रण के लिए एक सबूत के अवधारणा के रूप में कार्य किया गया था। लाइव /मृत परख का सबसे महत्वपूर्ण निष्कर्ष यह है कि 48 एच के बाद भी, कोई मृत कोशिकाओं (लाल) मनाया गया, साबित होता है कि न तो पाड़ सामग्री ही है, और न ही इसकी गिरावट उत्पादों विषाक्त प्रभाव का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, ईसीएस वास्तव में पालन किया था और पाड़ के अंदर संलग्न रहते हैं और समान रूप से वितरित agglomerates फार्म जब चैनलों के अंदर हो गया लग रहा था. यह पता चलता है कि वर्णित निर्माण विधि और पाड़ निर्माण vivo में निर्माण के लिए एक उपयुक्त रूपरेखा प्रदान करते हैं, प्रासंगिक, ट्यूबलर ऊतक morphologies. सभी तीन स्थानिक आयामों में सेल-ईसीएम बातचीत और तंग सेल सेल संचार की नकल करने के अलावा, जटिल ऊतक इंजीनियरिंग को भी अपनी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए नए माध्यम के लिए निरंतर सेल जोखिम की आवश्यकता होती है। यह बदले में निरंतर भ्रम के तहत एक घने चैनल नेटवर्क द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो भविष्य के काम में आगे की जांच वारंट, और सामग्री और विकास मानकों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी vasculature के दीर्घकालिक ऊतक इंजीनियरिंग की सुविधा.

Figure 1
चित्र 1: कोर/शेल नोजल प्रोटोटाइप। (क) समग्र डिजाइन और नोजल शरीर प्रोटोटाइप के मुख्य घटक दिखाए जाते हैं। नोजल शीर्ष के माध्यम से एक कुंद अंत G27 सुई डालने से पूरा हो गया है. शीर्ष और नीचे सुई धारकों स्थिर और नोजल अक्ष के साथ सुई realign, यह सुनिश्चित करना है कि टिप केंद्र के माध्यम से नोजल से फैली हुई है.  माध्यमिक सिरिंज से extruded "खोल" सामग्री के साथ नोजल कनेक्ट करने के लिए, एक luer-लॉक संबंधक के साथ ट्यूबिंग पार्श्व इनपुट करने के लिए जुड़ा हुआ है. यहाँ से, सामग्री एक संकीर्ण चैनल के माध्यम से नोजल के लिए भेजा है. उल्लेख चैनल के निर्माण के लिए दो पदों में ड्रिलिंग की आवश्यकता होती है, जिससे होल का उत्पादन होता है जिसे निर्माण के बाद सीमित करने की आवश्यकता होती है। (बी) दिखाया एक डाला G27 सुई के साथ नोजल के एक करीबी अप है, नोजल से बाहर का विस्तार. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अंतिम कोर/ (क) दिखाया गया है कि हाइड्रोजेल(दाएं) युक्त सही ढंग से संलग्न सिरिंजों के साथ पूरा कोर/शेल नोजल है, "खोल" और क्रॉस-लिंकिंग समाधान (बाएं) को "कोर" के रूप में एक्सट्रूड किया गया है। (बी) दिखाया गया है कोर / खोल सेट अप दो extruders के साथ Vitaprint प्रणाली में स्थापित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्यूबलर पाड़ के जी कोड. यहाँ प्रिंटर सॉफ्टवेयर के एक स्क्रीनशॉट दिखाया गया है, विशेष रूप से पथ पूर्वावलोकन (एक) और कच्चे जी पहली परत के कोड (बी). जी-कोड लक्ष्य निर्देशांकों का एक सेट है, जिसमें सापेक्ष दिशाओं में निरपेक्ष स्थानिक दिशाओं (X, Y, $) के साथ-साथ बाहर निकालना (ए,बी) में निर्देश दिए गए हैं। G आदेश अनुदेश के प्रकार को निर्धारित करता है, जबकि G1 लक्ष्य निर्देशांकों की ओर रैखिक गति का प्रतिनिधित्व करता है और G92 प्रारंभिक प्रारंभिक प्रारंभिक स्थिति निर्धारित करता है। इसके अतिरिक्त, निम्नलिखित आदेशों की फीड-दर का निर्धारण अनुदेश F के साथ mm/min में किया जाता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक खोखले इंटीरियर के साथ एक पाड़ किनारा के पार अनुभाग. (ए) दिखाया ताजा मुद्रित और बाद संसाधित पाड़ के पार अनुभाग टुकड़ा है. (बी) दिखाया 72 एच के लिए सेल संस्कृति मीडिया में incubated होने के बाद पाड़ के पार अनुभागीय टुकड़ा है. जबकि नोजल आकार एक दौर पार अनुभाग के साथ एक ट्यूब के बाहर निकालना परिभाषित करता है, फिलामेंट कुछ जमा पर चपटा प्रतीत होता है. आंतरिक चैनल, तथापि, बरकरार रहता है और ऊष्मायन के दौरान अपने फार्म को बरकरार रखता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पाड़ के कोर/ यहाँ, तीन स्तरीय खोखले-ट्यूब पाड़ का निर्माण () और इसका अंतिम रूप (बी) दिखाया गया है . बेहतर दृश्य के लिए, कोर में पार से जोड़ने समाधान एक लाल रंग के साथ दाग था. निर्माण पाड़ स्थिरता बनाए रखने के लिए पर्याप्त यांत्रिक स्थिरता दर्शाती है, भले ही मोटा संरचनाओं (अप करने के लिए 10 परतों, डेटा नहीं दिखाया) गढ़े हैं. अंतिम संरचना के बाहरी आयाम लगभग 27 मिमी x 27 मिमी x 3.5 मिमी थे. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: लाइव / मृत परख पाड़ में सीधे प्रदर्शन किया. HUVECs का निलंबन आंतरिक पाड़ चैनल में इंजेक्ट किया गया था, 48 एच के लिए incubated, और लाइव / मृत डाई के साथ इलाज किया. व्यवहार्य HUVECs हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रकाश, जो छवि के उज्ज्वल धब्बे में प्रतिनिधित्व किया है उत्सर्जन. मृत कोशिकाओं हरी फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन; हालांकि, कोई भी मनाया पाड़ में दिखाई दे रहे हैं. कोशिकाओं का वितरण भी आकार का प्रतीक है और चैनलों के भ्रम क्षमताओं को बनाए रखा. एक छोटी सी हद तक, लाइव / मृत परख समाधान भी मचान सामग्री दाग, माइक्रोस्कोप के नीचे प्रकाश फ्लोरोसेंट का उत्पादन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

नोज़ल डिजाइन
विकसित कोर / खोल नोजल का उपयोग करना, एक दो-एक्सट्रूडर विटाप्रिंट प्रणाली में एकीकृत, खोखले, ट्यूबलर पाड़ एक एकल चरण प्रक्रिया में गढ़े गए थे। तैयार पाड़ के अधिकांश के माध्यम से ट्यूब दीवार की एक भी मोटाई को प्राप्त करने के लिए, सुई बाहरी बाहर निकालना अंगूठी की धुरी पर केंद्रीय रूप से तैनात करने की जरूरत है. मानक गेज सुइयों अक्सर अक्ष से दूर एक मामूली, अभी तक महत्वपूर्ण विलक्षणता प्रदर्शन. इस प्रकार, नोजल बॉडी को सुई को दो स्थानों पर रखने के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक बार शीर्ष पर (हब फिक्सिंग) और एक बार अंतिम कोर/खोल कक्ष से पहले (कैनुला को ठीक करना), इसके अक्षीय संरेखण को सही करना। अक्षीय संरेखण की शुद्धता निर्धारण बिंदु के बीच की दूरी के साथ बढ़ जाती है। वहाँ है, तथापि, सुई की लंबाई और उपलब्ध नोजल चैम्बर मात्रा के बीच एक tradeoff. सेट अप की कार्यक्षमता में सुधार करने के लिए आगे, नोजल के कुछ संशोधनों को लागू किया जा सकता है: ए) बेहतर स्थिरता के साथ एक नोजल माउंट, बी) सुई संगतता की एक व्यापक रेंज के लिए अतिरिक्त नलिका, सी) सुई के लिए एक सटीक समायोजन तंत्र नोजल पोजीशनिंग, और डी) मक्खी सामग्री की तैयारी पर के लिए अतिरिक्त आदानों और microfluidic उपकरणों को एकीकृत।

हाइड्रोजेल इटिटिमाइजेशन
इष्टतम ALG: सीएमसी अनुपात निर्धारित करने के लिए, कई सामग्री पुनरावृत्तियों का मूल्यांकन किया गया। आम तौर पर, दोनों घटकों के 3 wt.% से ऊपर सांद्रता के साथ कोर / खोल मुद्रण असंभव प्रदान किया गया था, क्योंकि यह एक सतत hydrogel प्रवाह के लिए अनुमति नहीं दी या नोजल के clogging में हुई. विशेष रूप से, 3 wt.% से ऊपर ALG एकाग्रता चिपचिपापन जरूरत से ज्यादा वृद्धि हुई है और नोजल clogging में हुई, जबकि कम ALG सांद्रता और उच्च सीएमसी (gt; 3 wt.%) सांद्रता नीचे पार जोड़ने बार धीमा और इस तरह पर्याप्त प्रदान करने में विफल पाड़ के संरचनात्मक समर्थन. कोर/शेल प्रिंटिंग कम चिपचिपा योगों के साथ संभव था; हालांकि, extruded जेल चिपचिपापन दीर्घकालिक आकार निष्ठा बनाए रखने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. अंत में, एक 1:1 ALG: सीएमसी अनुपात सबसे उपयुक्त विकल्प है जो Maver एट अल द्वारा एक पिछले अध्ययन की पुष्टि साबित हो गयाथा. एनएफसी के अलावा काफी प्रिंटहोने और कोर / खोल मुद्रित पाड़ की संरचनात्मक कठोरता में सुधार हुआ है, लेकिन सामग्री के पार जोड़ने गुणों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा।

कस्टम अनुप्रयोगों, विशिष्ट सेल प्रकार और प्रयोगात्मक सेट अप के लिए अनुकूलित अच्छी तरह से पूंछ मचान सामग्री है, जो संरचना और पार से जोड़ने तंत्र में अलग अलग होंगे की आवश्यकता होगी. इस कार्य में वर्णित विधि एक ऐल्जिनेट-सेलूलोज़ मिश्रित बहुलक समाधान पर आधारित है, जो कि के2+ आयनों का उपयोग करके परस्पर जुड़े आयन के साथ जुड़ा हुआ है। अल्गिनेट स्वयं (1,4)से जुड़े जेड-डी-मैनुरोनेट (एम) और जेड-एल-गुलुरुनेट (जी) अवशेषों का एक रैखिक बहुलक है जिसे कै2 ़ और अन्य द्विसंयोजक धनायनों जैसे Sr2+, Br2+, Mg के अनुप्रयोग द्वारा उत्क्रमणीय रूप से आइओनीली क्रॉसलिंक किया जा सकता है। 2+| फिर भी, alginate के पार से जोड़ने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आयन Ca2 + CaCl2के रूप में रहता है. Ca2+ का उपयोग CaSO4 या CaCO3के रूप में भी किया जा सकता है; हालांकि, CaSO की कम विलेयता4 CaCl2 के सापेक्ष धीमी जेलेशन का मतलब है. CaCO3 भी धीमी जेलेशन बार जो कमजोर और असंगत यांत्रिक गुणों में परिणाम कर सकते हैं पैदावार.

लंबे समय तक जेलेशन बार आम तौर पर एक अधिक समरूप निर्माण काउत्पादन, तथापि, कुछ अनुप्रयोगों, जैसे कोर / ज2़ आयन भी जेलेशन को प्रेरित करते हैं; हालांकि, उनके पार जोड़ने दक्षता के बारे में 5x-10x कम है, Ca2 +की तुलना में, 2-3 एच के पार से जोड़ने के समय के साथ. इसके अतिरिक्त, मैग्नीशियम आयन गुलुरोनिक इकाइयों की ओर अधिक चयनात्मक होते हैं, इसलिए क्रॉस-लिंकिंग एएलजी51की रासायनिक संरचना पर अधिक निर्भर करता है। इस मामले में, खोखले संरचना के पतन से पहले निरंतर खोखले चैनल गठन सुनिश्चित करने के लिए एक तेजी से जेलेशन दर आवश्यक है। CaCl2 सबसे तेजी से जेलेशन दर पैदावार, जो खोखले फिलामेंट के प्रत्यक्ष जमाव के लिए महत्वपूर्ण है। 100 एमएम CaCl2 का उपयोग किया गया था, जो पर्याप्त रूप से नोजल के भीतर जेल ठोसीकरण के कारण के बिना एक खोखले फिलामेंट के निरंतर गठन को स्थिर किया गया था।

पाड़ के मुद्रण और पोस्ट प्रसंस्करण
निम्नलिखित चरणों की प्रक्रिया के इस भाग के दौरान विचार किया जाना चाहिए, सहित 1) यह सुनिश्चित करना है कि सभी समाधान और सामग्री 3 डी bioprinter सहित ठीक से मुद्रण से पहले बाँझ रहे हैं. 2) hydrogel तैयार करते समय, सामग्री की एकरूपता निरंतर मुद्रण के लिए महत्वपूर्ण है। अशुद्धियों या हवा के बुलबुले का परिचय से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे नोजल को रोक सकते हैं और / 3) सीरिंज को लुअर-लॉक तंत्र के माध्यम से कोर/शेल नोजल से ठीक से जोड़ा जाना चाहिए और चित्र 2क, बीमें देखे गए एक्सट्रूडर माउंट्स में सही ढंग से डाला जाना चाहिए। 4) एक जटिल संरचना मुद्रण से पहले, यह जेल के एक छोटे से हिस्से को पूर्व-उत्तेजित करने और क्रॉस-लिंकिंग समाधान को कोर/शेल नोजल में अतिरिक्त हवा के बुलबुले को साफ करने और एक सतत हाइड्रोजेल प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की जाती है। यह repeatability में सुधार करने के लिए जी कोड में सीधे शामिल किया जा सकता है. 5) यह पाड़ ही शुरू होता है की छपाई से पहले एक समरूप खोखले फिलामेंट के बिछाने सुनिश्चित करने के लिए पाड़ आसपास एक स्कर्ट जोड़ने के लिए उपयोगी है.

इसके अतिरिक्त, 6) मुद्रण फिलामेंट और सब्सट्रेट के बीच आसंजन में सुधार करने के लिए, यह अच्छा आसंजन (यानी, एक गिलास स्लाइड या पेट्री डिश) के साथ एक फ्लैट सतह का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। 7) बाहर निकालना नोजल hydrogel के निर्बाध प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट के साथ सीधे संपर्क में नहीं होना चाहिए। प्रारंभिक दूरी दृढ़ता से प्रिंट की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा, लेकिन extruded फिलामेंट की मोटाई प्रारंभिक सेटिंग का एक अच्छा सन्निकटन है. 8) जी कोड में प्रारंभिक मुद्रण ऊंचाई व्यक्तिगत जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। मुद्रण मानकों अनुकूलित कर रहे हैं के बाद, पाड़ जी कोड ग्रह सीएनसी सॉफ्टवेयर में आयात किया जाना चाहिए और मुद्रण प्रक्रिया प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में शुरू कर दिया. 9) को नियंत्रित करने और इष्टतम पाड़ मुद्रित करने के इरादे से hydrogel प्रवाह का अनुकूलन करने के लिए, दोनों निर्माण संरचना और मुद्रण मानकों विविध होना चाहिए (यानी, मुद्रण गति, बाहर निकालना दबाव, मुद्रण तापमान, सब्सट्रेट के बीच की दूरी और बाहर निकालना नोजल, परत ऊंचाई, पाड़ आकार, आदि).

सामान्य तौर पर, उच्च प्रवाह दर उच्च चिपचिपापन के साथ योगों को मुद्रित करने के लिए आवश्यक हैं। जैसा कि उल्लेख किया गया है, सभी हाइड्रोजेल योगों, जो तत्काल रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग के लिए उपयुक्त हैं, खोखले ट्यूबों के एक कदम निर्माण के लिए अनुमति देते हैं और वर्णित कोर/शेल सेट-अप के साथ उपयोग किया जा सकता है। मुद्रण और क्रॉस-लिंकिंग तंत्र को तदनुसार अनुकूलित किए जाने की आवश्यकता है। मुद्रण के बाद, सभी पाड़ के बाद माध्यमिक पार से संसाधित किया गया 5 wt.% CaCl2 समाधान है, जो ALG-CMC घटक के पूर्ण पार से जोड़ने का आश्वासन दिया और कम से कम 30 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश के तहत दोनों पक्षों से बाँझ. यह पूरी तरह से पार से जोड़ने समाधान और काफी लंबे समय के लिए पार से जोड़ने की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए इनक्यूबेट के साथ पाड़ निगल सुनिश्चित किया जाना चाहिए. पोस्ट-प्रोसेसिंग का उपयोग की गई सामग्री और क्रॉस-लिंकिंग तंत्र के आधार पर अलग-अलग होगा, जिस पर पहले से विचार किया जाना चाहिए। पोस्ट प्रसंस्करण के बाद, पाड़ सब्सट्रेट से ध्यान से हटाया जाना चाहिए, सेल संस्कृति मीडिया को स्थानांतरित, और सेल बोने से पहले कम से कम 24 एच के लिए एक नियंत्रित वातावरण में incubated. एक बेरंग माध्यम का उपयोग पाड़ में इंजेक्शन के दौरान सेल निलंबन की दृश्यता में सुधार होगा.

लाइव/मृत परख
परख आयोजित करने से पहले लाइव/डेड घोल को सीधे तैयार किया जाना चाहिए और परख आयोजित करने से पहले अंधेरे में रखा जाना चाहिए, क्योंकि इसमें फ्लोरोसेंट रंग होते हैं जो विरंजन के लिए प्रवण होते हैं। वांछित ऊष्मायन समय के बाद, सेल संस्कृति मीडिया ध्यान से पाड़ आसपास छोड़ दिया जाना चाहिए और PBS के साथ कुल्ला. आदर्श रूप में, एक ही प्रवेश बिंदु सेल बोने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए लाइव / मृत परख पाड़ में इंजेक्शन किया जा रहा द्वारा पीछा किया.

परिणामों का महत्व
दोनों ALG और सीएमसी पहले से ही इन विट्रो में एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके ECM-mimetic सुविधाओं के आधार पर, शारीरिक पार से जोड़ने, और biocompatibility, ALG आमतौर पर वितरण और angiogenic विकास कारकों के नियंत्रित रिलीज के लिए एक घटक के रूप में नियोजित किया गया है (जैसे, bFGF, HGF, VEGF164, और अंग-1 *respectively)52 ,53,54. इसके अलावा, जिलेटिन के साथ संयोजन में, सीएमसी भी शारीरिक स्थितियों55के तहत अपनी तेजी से पार से जोड़ने क्षमताओं के कारण संवहनी endothelial कोशिकाओं encapsulating के लिए इस्तेमाल किया गया है। एनएफसी आगे यांत्रिक स्थिरता और पाड़ के आकार निष्ठा को बढ़ाने के लिए जोड़ा गया. इस बात पर बल दिया जाना चाहिए कि इसका उद्देश्य संवहनी को बढ़ाना नहीं था, बल्कि पर्फूसर, खोखले एएलजी-सीएमसी पाड़ के उत्पादन की संभावना को प्रदर्शित करना था, जो कोर/शेल फैशन में मुद्रित होता है, जो लगाव और प्रसार की सुविधा भी प्रदान करता है। एचयूवीसी। एक ALG-सीएमसी मिश्रण का उपयोग करने का विकल्प आमतौर पर इस्तेमाल किया, आसानी से सुलभ, और bioसंगत आधार सामग्री है कि खोखले चैनलों के कोर / कई अन्य सामग्री एंजियोजेनेसिस को बढ़ाने के लिए अधिक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है; तथापि, कुछ कोर/शेल प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि वे तीव्र जेलेशन/क्रॉस-लिंकिंग की सुविधा नहीं देते हैं, जो इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (अनुदान संख्या: P3-0036, और I0-0029) से प्राप्त इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं, और विज्ञान, शिक्षा और खेल मंत्रालय (अनुदान संख्या: 5442-1/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

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References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

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Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

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