Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Core/Shell Printing stillaser for vev engineering av rørformede strukturer

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/59951
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2, 1, 1, 1,3
1Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Institute for Development of Advanced Applied Systems (IRNAS), 3Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Maribor

Summary

Presentert her er en enkel å bruke, Core/Shell, tredimensjonale bioprinting satt opp for ett-trinns fabrikasjon av hul stillaser, egnet for vev engineering av vaskulær og andre rørformede strukturer.

Abstract

Tredimensjonal (3D) utskrift av kjernen/skallet filamenter tillater direkte fabrikasjon av kanal strukturer med et stabilt skall som er tverrbundet i grensesnittet med en flytende kjerne. Sistnevnte er fjernet etter utskrift, etterlot seg en hul tube. Integrere en additiv produksjonsteknikk (som den som er beskrevet her med skreddersydd [bio] blekk, som strukturelt og biokjemisk etterligner den innfødte ekstracellulære Matrix [ECM]) er et viktig skritt mot avansert vev engineering. Nøyaktig fabrikasjon av veldefinerte strukturer krever imidlertid skreddersydde fabrikasjon strategier optimalisert for materialet i bruk. Derfor er det fornuftig å begynne med et oppsett som er passelig, enkel å bruke, og kompatibel med et bredt spekter av materialer og applikasjoner. Dette arbeidet er en lett-å-produsere kjerne/Shell dyse med luer-kompatibilitet for å utforske kjernen/Shell utskrift av woodpile strukturer, testet med en veldefinert, alginat-basert stillas materiale formulering.

Introduction

Uten tvil, det endelige målet for vev Engineering (te) er å produsere funksjonelle vev eller organer in vitro, som kan brukes til å regenerere eller erstatte skadde eller syke deler av menneskekroppen1,2,3. Nåværende forskning i vevs teknikk (TE) er fokusert på individuelle aspekter av feltet (stillas materialer, fabrikasjon prosedyrer, celle kilder, etc.) 4,5, i tillegg til å utvikle Simple in vitro-modeller av vev og organer som etterligner fundamentale aspekter ved deres in vivo kolleger. Slike modeller er allerede nyttig for mange programmer, for eksempel narkotika screening og toksisitet studier, spesielt i tilfeller der konvensjonelle 2D cellekulturer unnlater å etterligne den dynamiske reaksjoner av Native vev6,7, 8,9. Tredimensjonale in vitro modeller er vanligvis konstruert ved å kombinere celler10, fysikalsk-kjemiske signaler11, og biologisk aktive molekyler12,13 på stillaser, som er Hentet fra decellularized vev eller konstruert de Novo fra biologiske eller biokompatible materialer14,15,16,17,18.

Det er avgjørende at stillaser recapitulate den komplekse 3D mikroarkitektur og hierarkisk struktur av de innfødte vev for å muliggjøre funksjonalitet av utviklet vev, representant for in vivo vev19. Til tross for den betydelige teknologiske utviklingen i TE, er utvikling av fysiologisk relevante kunstige vevs konstruksjoner fortsatt en utfordring. Tykt vev (> 200 μm i tykkelse) er spesielt problematisk, på grunn av begrensninger som oksygen og næringsstoffer diffusjon20. Fremskritt mot større vev konstruksjoner er gjort; imidlertid må de nødvendige høy nærhet av celler til blodkar for å transportere oksygen og næringsstoffer og fremme avfalls fjerning være sammenfattet. Endometrial blodkar av vev (eller alternativt, fabrikasjon av sammenkoblede 3D vaskulære nettverk innen vev konstruerer) spiller en avgjørende rolle i å opprettholde celle levedyktighet og fremme funksjoner av in vitro utviklet vev, som er vanskeligere for modeller i langvarige eksperimenter21,22. Videre har den nødvendige oppløsningen, strukturelle integritet, og samtidig biokompatibilitet ennå ikke oppnås23.

Flere TE tilnærminger har blitt foreslått i et forsøk på å konstruere blod fartøy-lignende strukturer og tilrettelegge endometrial blodkar in vitro. Noen eksempler er seeding endothelial celler (også co-kultivert med andre celletyper som fibroblaster) som selv montere å generere mikrovaskulær nettverk24, bruk av vaskulære stamceller og pericytes som fremmer endothelial celle vekst21,25, levering av angiogenic vekstfaktorer som induserer endometrial blodkar20,26, ved hjelp av celle ark teknologi som gjør det mulig for kontroll over vaskulær lagdeling20, og fabrikasjon av svært porøse stillas strukturer som fremmer angiogenese27. De nevnte tilnærminger fokus på angiogenese induksjon, som vanligvis krever betydelige mengder ekstra vekstfaktorer (f. eks VEGF) og tid til å danne. Men de største ulempene er deres begrensede reproduserbarhet og begrenset romlig kontroll over vaskulær mønster, vanligvis resulterer i en tilfeldig blodkar fordeling i vevet konstruere som ikke nødvendigvis Letter blod.

Additiv produksjon (AM, som 3D-bioprinting) er i økende grad involvert i fabrikasjon av 3D-konstruksjoner ved hjelp av biologiske eller biokompatible materialer for å skape stillaser egnet for TE. Flere AM tilnærminger blir brukt og utviklet parallelt (f. eks Ink jet-og microextrusion metoder, ulike typer litografiske teknikker) for å produsere stillaser som etterligner innfødte vev i sin arkitektur, biokjemi og funksjonalitet . De enkelte teknikkene viser visse fordeler og ulemper28, noe som er grunnen til ulike modifikasjoner blir utforsket (f. eks, mikro-mønstre, indusert angiogenese, etc.) for å øke i hvilken grad store, komplekse og stabile vaskulære nettverk kan være fabrikkert22,29,30.

Blant disse er ekstrudering bioprinting den mest brukte metoden, spesielt på grunn av det brede spekteret av kompatible materialer (en generelt celle vennlig prosess28,31,32), så vel som eksepsjonell allsidighet i Bruksvilkår (for eksempel innebygd og offer utskrift23,33, fabrikasjon av hule strukturer34,35, etc.). De viktigste utfordringene forplanting stede studier inkluderer overføring fra 2D til 3D strukturer, dannelse av et tett nettverk av hule rør med høy romlig oppløsning, og generell mekanisk integritet og form Fidelity under væske strømning i cellekultur forholdene30.

Den enkleste tilnærmingen til perfusable vev er fabrikasjon av en sammenhengende nettverk av kanaler innenfor konstruere. Opprettelsen av slike perfusable kanaler i et vev stillas er ventet å løse mange av de nevnte problemene, som det umiddelbart gir for næringsstoffer og oksygen diffusjon mens du fjerner avfallsprodukter. Derfor unngås den potensielle dannelsen av nekrotisk områder innenfor konstruksjonen36. Slike kanaler kan i tillegg være sådd med endothelial celler (ECs) og tjene som kunstige blodårer i 3D-vev modeller37. I de mest elementære forstand, kan et fartøy bestå av en hul kanal, mykt lag av ECs, og stiv skall. Nylig, 3D ekstrudering av to forskjellige materialer i en kjerne/Shell mote utnytte co-aksial nåler for ekstrudering har fått mye interesse38,39,40,41, som det gir mulighet for fabrikasjon av hule rør.

I likhet med konvensjonelle microextrusion 3D-utskrift, er Core/Shell utskrift utført med en co-aksial dyse (f. eks, to nåler med ulik diameter på samme akse på en måte, slik at den bredere nålen omslutter den smalere en). Dermed kan to materialer være ekstrudert samtidig, med en som sentral filament eller "indre" kjerne og et sekund som den "ytre" Shell41. Hittil har co-aksial bioprinting blitt benyttet for å dikte strukturer med solid42, Core/Shell43, og hule tråder40,44; materialene som brukes har imidlertid ikke blitt optimalisert for både optimal celle levedyktighet og mekanisk robusthet av trykte konstruksjoner. Som nevnt, gir teknikken muligheten til å kombinere Biomaterials med ulike mekaniske egenskaper, der stivere en støtter den mykere en. Enda viktigere, hvis stillaset materiale (f. eks, alginat, carboxymethyl cellulose) er ekstrudert som skallet, mens kjernen består av tverr-linking agent (f. eks, kalsiumklorid) er utlevert fra den indre kapillær deretter skylles ut etter utskrift, er det mulig å dikte opp en kontinuerlig hul tube i et enkelt trinn45.

Med dette i bakhodet, en enkel og repeterbar ett-trinns metoden ble utviklet for å bygge veldefinerte og perfusable stillaser for prosjektering av vaskulære strukturer og andre rørformede vev. For å utvikle en kostnadseffektiv teknologi, bør fabrikasjon ideelt sett være en enkelt-trinns prosess. Derfor ble et kjerne/Shell-oppsett tilpasset og integrert i 3D-bioprinter. Den grunnleggende designen består av en sentral dyse laget av metall for å unngå deformasjon under injeksjon, rundt som en andre dyse av en større diameter er plassert. En slik co-aksial dyse oppsett tillater co-ekstrudering av de to renn og umiddelbar krysskobling av ekstrudert hydrogel kanal. Dette muliggjør direkte fabrikasjon av flerlags hule filamenter, mens påfølgende kryss-linking med høyere konsentrasjoner av kalsiumklorid (CaCl2) sikre mer permanent stabilisering fra utsiden.

Som sådan, denne metoden gjør det mulig for samtidige utskrift av stillaser og microchannels, der hul hydrogel filamenter tjene som et stillas for å støtte den mekaniske integriteten til 3D konstruksjoner og samtidig fungere som innebygd microchannels å levere næringsstoffer for cellevekst. Denne protokollen gir en detaljert prosedyre av kjernen/skallet 3D bioprinting strategi basert på bruk av en skreddersydd co-aksial dyse der hydrogel 3D strukturer med innebygde kanaler er fabrikkert ved å kontrollere kryss-linking å produsere hule filamenter, som forblir perfusable under celle kulturen.

Oppsettet for 3D-utskrift som brukes i dette arbeidet, er konfigurert som tidligere beskrevet av Banović og Vihar46 og kan deles inn i tre hovedkomponenter: a) en tre-akse CNC mekanisk oppsett med 50 μm posisjonering nøyaktighet i X, Y, og Z retninger; B) to ekstrudere, tilpasset for engangsbruk, 5 mL luer sprøyter, med 1,2 μL Voxel oppløsning; og C) kontrollere elektronikk og programvare.

For å lette kjernen/Shell utskrift, en passende dyse ble utviklet som kan monteres på en av ekstrudere (primære Ekstruder, skrive ut kjernen) og er kompatibel med G27 Butt-end nåler. Den har også luer-kompatibilitet for å koble til den andre Ekstruder (skrive ut skallet). De første prototyper ble fabrikkert ved å sette inn en stump-end G27 nål (indre diameter = 210 μm, ytre diameter = 410 μm) til enten en G21 nål (indre diameter = 510 μm, ytre diameter = 820 μm) eller G20 konisk tupp (indre diameter = 600 μm), deretter sette inn en sekundær n eedle sideveis for å levere skall materialet. Men på grunn av liten bøying av nålen akselen, er det ikke mulig å produsere en dyse spissen med konsentrisk justering av indre og ytre nåler.

For å løse dette problemet, ble en ny dyse design utviklet som oppfylte følgende kriterier: 1) det kan produseres ved hjelp av en 3-akse CNC Mill, 2) det kan være laget av ulike materialer (høy ytelse plast, for eksempel PEEK eller metaller), 3) den har luer kompatibilitet for påføring av skall materiale, og 4) er kompatibel for en G27 Butt-end nål og holder den på plass på to posisjoner for å justere spissen med den sentrale aksen. En skjematisk fremstilling av munnstykket prototype er vist i figur 1.

Protocol

1. utarbeidelse av hydrogeler og kryss-linking løsninger

  1. Kort sagt, ved å blande kraftig, oppløse ALG og CMC pulver i ultra-rent vann for å få en total 3 WT% ALG og 3 WT% CMC løsning.
    Merk: i dette arbeidet brukes 5 mL sprøyter for utskrift; dermed justeres den endelige mengden materiale til dette volumet. For andre ekstrudering patroner og trykte utvalgsstørrelser, bør imidlertid mengden av tilberedt materiale skaleres tilsvarende.
  2. Tilsett 1,5 vekt% cellulose nanofibre til ALG-CMC-blandingen for ekstra mekanisk forsterkning for å nå ønsket viskositet, egnet for utskrift.
  3. Agitere den hydrogel suspensjonen til homogen ved hjelp av en overhead mikser.
    Merk: det skal ikke finnes fibre eller bobler i hydrogel.
  4. Forbered 10 mL 100 mM kalsiumklorid (CaCl2) oppløsning i ultra-rent vann, som brukes som primær tverr kobling løsning for utskrift.
  5. Forbered 10 mL 5 WT .% CaCl2 løsning i ultra-rent vann, som brukes som en sekundær tverr kobling løsning i etterbehandling av stillaser.
    Merk: Generelt, alle hydrogel formuleringer, som er egnet for umiddelbar kjemisk kryss-linking, tillater ett-trinns fabrikasjon av hule rør og kan brukes med denne type kjerne/Shell oppsett. Trykking og kryss-linking mekanismer må optimaliseres tilsvarende. Viskositet av hydrogel vil variere avhengig av ønsket sammensetning; Men, det kan justeres med polymer konsentrasjoner og tilsetning av tykkelse midler (f. eks nanofibre). Den ideelle viskositet for 3D-utskrift av stabile konstruksjoner er høy nok til at ekstrudert filament beholder sin form og for at stillaset holder sin egen vekt før krysskobling.

2. Core/Shell utskrift av perfusable stillaser

  1. Før utskrift, sterilisere bioprinter ved sprøyting 70% etanol grundig og utsette det til UV-lys for 1 t.
  2. Slå på bioprinter og Kjør Kontrollprogramvaren, som kommer i en bunt med 3D-skriveren.
  3. Utfør homing-prosedyren ved å trykke på hjem -ikonet.
  4. Bruke verktøylinjens kommando fil | Import G-kode, importere den genererte stillaset g-koden.
  5. Overfør hydrogel til en steril 5 mL sprøyte og plasser den i en av de Ekstruder festene på 3D-skriveren. Via luer og et kort rør kobler du den til side luer inngang på kjerne/skall munnstykket.
  6. Overfør kryss koblings løsningen (100 mM CaCl2) til en annen steril 5 ml sprøyte med en vedlagt G27 Butt-end nål og sett den inn i den øverste nåle holde ren av kjerne/skall munnstykket. Den indre nålen skal være litt stikker (~ 1 mm) fra den ytre kjernen/skall munnstykket. Juster justeringen manuelt. Sett den andre sprøyten inn i ekstrudering-braketten.
  7. For å sette inn sprøyter riktig i brakettene (oppsett vist i figur 2), må du manuelt kontrollere begge ekstrudering mounts ved å klikke på A-og B -og opp-og ned -pilene.
  8. Før utskriften starter, separat extrude hydrogel og krysskobling løsning for å fjerne alle overflødige luftbobler i kjernen/skallet munnstykket og sikre en kontinuerlig hydrogel flyt.
  9. Bruk Z -og opp-og ned -pilene til å justere avstanden mellom munnstykket og trykk underlaget manuelt. Det anbefales å bruke et flatt, glass-utskrift substrat, som har god vedheft. Ekstrudering munnstykket skal ikke være i kontakt med underlaget for å muliggjøre uavbrutt strøm av hydrogel. Den optimale avstanden mellom munnstykket og underlaget (lag høyde) er vanligvis den samme som bredden av den ytre dyse diameter, men den er justert til materialet som brukes og individuelle utskrifts parametre. Juster start utskrifts høyden i henhold til individuelle behov.
  10. Trykk på avspillings knappen for å starte utskriftsprosessen.
    Merk: det anbefales å inkludere utskrift av et skjørt (Figur 3) rundt stillaset for å sikre legging av en homogen hul filament før utskrift av selve stillaset starter. For å oppnå optimal hydrogel flyt med den hensikt å skrive ut optimale stillaser, varierer formulering sammensetning, kryss-linking løsning sammensetning, og utskrift parametere (dvs. utskriftshastighet, ekstrudering trykk, utskrifts temperatur, avstand mellom substrat og ekstrudering dyse, etc.).
  11. Etter utskrift, forsiktig fjerne underlaget med trykt stillaset og hell den sekundære tverr kobling løsning (5 WT .% CaCl2) over hele stillaset å sikre kryss-kobling over hele stillaset. Ruge i 1 min ved romtemperatur (RT).
    Merk: Pass på at hele stillaset er nedsenket i kryss koblings løsningen. Dette trinnet er avgjørende for å oppnå ønsket styrke egenskaper av stillaset, men vil variere avhengig av materialet og tverr-linking metoden som brukes.
  12. Ved hjelp av en skalpell manuelt kutte overflødig skjørt materiale.
  13. Sterilisere stillaser under et UV-lys i 30 min. Vend stillaset forsiktig og gjenta steriliseringsprosessen.
  14. Løsne stillaset forsiktig fra underlaget ved å trekke det forsiktig sidelengs. Hvis stillaset fester seg sterkt til underlaget, skille det ved å sette inn en skarp kant mellom dem.
  15. Overfør stillaset til et fargeløs cellekultur medium (DMEM supplert med 5 WT .% FBS, 100 U/mL penicillin og 1 mg/mL Streptomycin), og ruge dem ved 37 ° c i en atmosfære som inneholder 5 WT .% CO2 i minst 24 timer.

3. utarbeidelse av endothelial celler og live/Dead analysen løsning

  1. For celle dyrking klargjør du det avanserte DMEM-mediet med ekstra fenol-rød og supplerer den med 5 WT .% FBS og 2 mM L-glutamin. Tilsett 100 U/mL penicillin og 1 mg/mL Streptomycin.
  2. Initiere den menneskelige navle vene endothelial celle (HUVEC) linje og passasje dem i samsvar med HUVEC dyrking protokoller som beskrevet47.
    Merk: det anbefales å kultur cellene i cellekultur medier med ekstra fenol rød for enkel visualisering under injeksjon av cellene i hvit gjennomskinnelig stillaser som beskrevet nedenfor.
  3. For celle telling, Pipetter 100 μL av celler suspendert i cellekultur medier og beis dem med 900 μL av 0,1 WT .% trypan blå oppløsning.
  4. Bruk en automatisert celle teller eller manuell hemocytometer for å telle og oppnå estimert antall celler i suspensjon.
  5. For den levende/døde analysen, utarbeide en løsning av 4 mM Calcein-AM og 2 mM propidium iodide i steril PBS.
    Merk: den levende/døde løsningen skal være forberedt direkte før du gjennomfører analysen.

4. overføring av celler til stillaser

  1. Fjern stillaser fra cellekultur Media og overføre dem til et tilstrekkelig stort glass Petri parabolen.
  2. Umiddelbart før du injiserer cellene inn i stillaser, distansere HUVECs fra flaskene ved hjelp av behandling av 0,25 WT .% Trypsin.
    1. Kast en kort stund på cellekultur mediene og ruge cellene med 0,25 WT .% Trypsin (~ 2 mL) i 5 min ved 37 ° c.
    2. Etter inkubasjons legge til ~ 3 mL cellekultur medier til trypsinized celler og overføre alle frittliggende celler til en sentrifuge tube.
    3. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min og kast supernatanten.
    4. Resuspend cellene i fersk cellekultur medier.
  3. Tell cellene som beskrevet tidligere. Juster den totale celle konsentrasjonen i henhold til individuelle behov. I dette arbeidet brukes en start konsentrasjon på 340 000 celler/mL.
  4. Resuspend cellene i en steril sprøyte med en butt G27 nål.
  5. Finn et inngangspunkt og start nøye sprøytebruk av celler i stillaser. Celle fjæringen flyte gjennom et gjennomskinnelig stillas skal være synlig. Sørg for at hele stillaset fylles opp med celle fjæring.
  6. Senk stillaser i cellekultur medier og ruge dem ved 37 ° c i en atmosfære som inneholder 5 WT .% CO2 i opptil 10 dager.
  7. Fylle cellen kulturen medier i henhold til eksperimentelle behov.

5. live/Dead-analyse og celle avbildning

  1. Etter inkubasjons, skyll stillaser med PBS.
  2. Med en butt-end nål, nøye injisere tidligere forberedt Live/Dead løsning (4 mM calcein-AM og 2 mM propidium iodide i PBS) inn i stillaser og ruge dem i PBS i 30 min ved 37 ° c. Pass på at løsningen renner gjennom hele stillaset.
  3. Skyll stillaser med PBS.
  4. Overfør stillaser forsiktig til et glass lysbilde.
  5. Observer fargede celler direkte i stillaser under et fluorescens mikroskop.
    Merk: levedyktige celler produserer grønne fluorescens og døde celler avgir røde fluorescens lys.

Representative Results

Målet med dette arbeidet var å utvikle en lett-å-produsere kjerne/Shell dyse med luer-kompatibilitet for Core/Shell utskrift av woodpile strukturer. I tillegg ble en enkel og repeterbar en-trinns utskriftsprotokoll beskrevet, som er enkel å modifisere og rommer et bredt spekter av materialer og ulike kjemiske tverr-linking mekanismer for å bygge veldefinerte og perfusable stillaser for prosjektering av vaskulær og andre rørformede vev strukturer.

Kjerne/skall munnstykke
Munnstykket er sammensatt av en G27 Butt-end nål (for å skrive ut den indre aksial filament) og munnstykket, som holder nålen på plass og skaper en ytre dyse for skallet filament med en tilkoblingsport for materiale input. En skjematisk er vist i figur 1. To 5 mL sprøyter, som er plassert i den individuelle ekstrudere og gir kjerne-og skall materialer. Slangen forbinder munnstykket med sprøyten, og gir skallet materiale.

Den komplette monteringen av kjerne/skall munnstykket og sprøyte oppsettet vises i figur 2. Den første funksjonelle prototypen av munnstykket kroppen ble produsert av CNC fresing en blokk med polyoxymethylene (POM). Kompatibilitet og forsegling mellom elementet, en G27 nål og slange ble testet ved å installere i Vitaprint. Ingen lekkasje av skall materialet ble observert i munnstykket, luer-kontakten eller mellom kropp og nål. Munnstykket passer tett med nål navet (luer kontakt), noe som sikrer synkronisert bevegelse av hele munnstykket med Ekstruder.

Stillas bygning
Den enkleste tilnærmingen til fabrikere stillaser er ved å sette materialer lag for lag der utskriftsretningen endres hvert påfølgende lag, vanligvis i en vinkel på 90 °. På grunn av de Visco-elastiske og hygroskopisk egenskapene til hydrogeler, er det fortsatt utfordrende å beholde figur gjengivelsen til de trykte strukturene. Hovedformålet med denne protokollen delen er 3D-utskrift av perfusable Core/Shell stillaser bruker to polymerer, som tidligere har vist lovende resultater for stillas bygning (ALG og CMC) med tilsetning av cellulose nanofibre (NFC) for økt mekanisk stabilitet. Både ALG og CMC er negativt ladet, vannløselige lineære kopolymerer48 og begge inneholder kar bok syl grupper, som kan krysskoblet med tillegg av divalent. Ca2 + partikler danner ioniske obligasjoner med to funksjonelle grupper samtidig, danner forbindelser mellom polymer kjeder, økende gel stivhet.

Utskrift av perfusable stillaser
Målet med denne prosessen er å 3D-print enkle woodpile stillas strukturer, som spenner over flere lag og beholde sin form troskap så vel som perfusability til å bli fullt tverrbundet. Dette krever enda koekstrudering av kjernen og skallet uten crossover eller uttrekk bevegelser, som kan avbryte flyten. Derfor er typisk CAD modellering og kutting metoder mindre egnet. I dette arbeidet, en manuelt utformet g-kode brukes, og en python-basert g-kode generator ble utviklet for rask g-kode forberedelse.

Stillaser ble strukturert i en woodpile rutenett form og bygget på en flat glass overflate. Den fabrikasjon ble utført lag-for-lag, deponering krysset linjene i hvert etterfølgende lag i en vinkel 90 ° til den forrige. I tillegg var hvert etterfølgende lag 2% smalere i X-og Y-retningene, noe som sikrer kontinuerlig filament-støtte ved foregående lag. Avstanden mellom filamenter (macropore størrelse) kan være presist utformet i g-koden ved å ta hensyn til den ytre diameter av ekstrudert filament (0,8 mm) og avstanden mellom støttelinjer (3 mm).

Stillaser var nødvendig for å oppfylle viktige inkluderings kriterier for videre vurdering. Først var stillaser med minst 4 lag i høyden nødvendig for å beholde sin strukturelle integritet og geometri (for eksempel macropore størrelse) under utskrift, for å være kvalifisert for videre utvikling. For det andre trengte stillaser å forbli perfusable (stabil microchannels) selv etter å ha blitt inkubert i 7 dager i cellekultur medier ved 37 ° c. Ved passende tidsintervaller (1, 2, 5 og 7 dager) stillaser ble tatt ut av kulturen Media og testet for å se om de fortsatt var perfusable. I figur 4a, viser tverrsnitt av et friskt trykt og post-behandlet stillas en godt synlig hul kanal inne i filamentet. I figur 4ber det klart at selv etter 72 h inkubasjons i cellekultur medier ved 37 ° c, beholder filament den hule strukturen gjennom hele stillas lengden.

Flere formuleringer var utskriftsvennlig, forble strukturelt stabile, bevart den trykte geometri, og forble perfusable; en enkelt ble imidlertid valgt for videre testing (dvs. 3 WT .% ALG + 3 vekt% CMC + 1,5 WT .% NFC), som tillot utskrift av perfusable stillaser med opptil 10 lag. Utskriftsprosessen med det tilpassede munnstykket vises i figur 5a. Core/Shell utskrift var mulig med mindre tyktflytende formuleringer; men gels med høyere konsentrasjoner ikke tillater kontinuerlig flyt gjennom munnstykket. For primær tverr kobling (kjernemateriale, levert under utskrift) 100 mM CaCl2 ble utnyttet, noe som tilstrekkelig stabilisert den kontinuerlige dannelsen av en hul filament, uten å forårsake gel herding i munnstykket. Etter utskrift ble stillaser dynket i en 5 WT .% CaCl2 -løsning for fullstendig krysskobling av hydrogel for langsiktig figur gjengivelse. Et ferdig stillas prøven er avbildet i figur 5B. Under optimaliseringen, prosessen av formuleringen en kunstig fargestoff ble brukt i kjernen løsningen, for å muliggjøre visuell evaluering og undersøke kvaliteten på ekstrudert filament. Fargestoffet ble ikke brukt for fabrikasjon av den endelige stillaser, som var forberedt på celle seeding og dyrking.

Live/Dead-analysen
Etter inkubasjons ble en live/Dead-analyse brukt til å visualisere ECs og skille mellom de levende (grønne) og de døde (røde) cellene i inkubert stillaset. Dette tjente to hovedformål: A) for å avgjøre om stillaser gir et biokompatible miljø for å fremme vekst og vedheft uten stiller skadelige effekter på cellen, og B) for å visualisere den strukturelle integriteten av rørformede strukturer og deres interne kanalsystemet i mer detalj.

Resultatene av den levende/døde analysen er vist i figur 6. I nærvær av intracellulære esterazami, plasma membranen gjennomtrengelig Calcein-AM omdannes til Calcein, avgir grønn fluorescens lys i levende celler. På den annen side, apoptotisk celler er visualisere av membran ugjennomtrengelig propidium iodide, som fluoresces i rødt når intercalated i DNA dobbel Helix. Live/Dead bilder og lyse felt bilder av stillaser ble kombinert for å hjelpe visualisere cellene inne i hule kanaler. Farge løsningen ble injisert, og analysen utføres direkte i 3D trykt stillaser etter stillas-celle inkubasjons for 48 h.

Det bør bemerkes at en relativt liten seeding tetthet av ECs ble brukt (340 000 celler/mL), som denne studien fungerte bare som en proof-of-konsept for Core/Shell utskrift av perfusable stillaser. Den mest betydningsfulle konklusjonen av Live/Dead analysen er at selv etter 48 h, ingen døde celler (rød) ble observert, beviser at verken stillaset materialet selv, eller dets fornedrelse produkter utstilt toksiske effekter. Videre, det ECs did faktisk holde fast og være igjen knyttet innenfor det stillaser og syntes å blankett jevnt distribuert agglomerater når voksen innenfor kanalene. Dette tyder på at den beskrevne fabrikasjon metoden og stillas formulering gir et egnet rammeverk for å bygge in vivo, relevant, rørformede vev morfologier. Foruten å etterligne Cell-ECM interaksjoner og tett celle-celle kommunikasjon i alle tre romlige dimensjoner, komplekse vev engineering krever også konstant celle eksponering til friskt medium for å opprettholde sin levedyktighet. Dette i sin tur kan oppnås ved et tett kanalnettverk under kontinuerlig, noe som garanterer videre etterforskning i fremtidig arbeid, og vil kreve optimalisere materiale og vekst parametre for å lette langsiktige vev engineering av blodkar.

Figure 1
Figur 1: prototype i kjerne/skall munnstykke. (A) den generelle designen og de viktigste komponentene i dysen kroppen prototypen er vist. Munnstykket er fullført ved å sette inn en butt-end G27 nål gjennom toppen. Toppen og bunnen nål holdere nakkens og justere nålen med dysen aksen, slik at spissen strekker seg fra munnstykket gjennom sentrum.  For å koble munnstykket med "skall" materiale ekstrudert fra den sekundære sprøyten, er slangen med en luer festet til den laterale inngangen. Herfra er materialet videresendt til munnstykket gjennom en smal kanal. Fabrikasjon av den nevnte kanalen krever boring i to posisjoner, produsere hull som må begrenses etter produksjon). (B) vist er et nærbilde av munnstykket med en innsatt G27 nål, som strekker seg ut av munnstykket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: endelig kjerne/Shell-oppsett. (A) vist er det ferdige kjerne/Shell munnstykket med riktig vedlagte sprøyter som inneholder hydrogel (høyre), bygge "skall" og kryss-linking løsning (venstre) ekstrudert som "kjernen". (B) vist er kjerne/Shell-oppsettet installert i Vitaprint-systemet med to ekstrudere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: G-kode av rørformede stillas. Her vises et skjermbilde av skriverprogramvaren, spesielt stien forhåndsvisning (a) og rå g-kode av det første laget (B). G-koden er et sett med instruksjoner med mål koordinater i absolutte romlige retninger (X, Y, Z), samt ekstrudering (A, B) i relative retninger. G-kommandoen bestemmer instruksjons typen, mens G1 representerer lineær bevegelse mot mål koordinatene, og G92 bestemmer startposisjonen. I tillegg er feed-rate av følgende kommandoer bestemmes med instruksjon F i mm/min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tverrsnitt av et stillas tråd med hul interiør. (A) vist er tverrsnitt skive av fersk trykt og post-behandlet stillaset. (B) vist er tverrsnitt skive av stillaset etter å ha blitt inkubert i cellekultur medier for 72 h. Mens munnstykket definerer ekstrudering av et rør med en rund tverrsnitt, synes filament å være litt flat på deponering. Den interne kanalen forblir imidlertid intakt og beholder sin form under inkubasjons. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: kjerne/Shell-utskrift av stillaser. Her vises fabrikasjon (a) av et trelags hul rør stillas og dens endelige form (B). For bedre visualisering, tverr kobling løsning i kjernen var farget med en rød farge. Formuleringen viser tilstrekkelig mekanisk stabilitet for å beholde stillaset stabilitet, selv om tykkere strukturer (opp til 10 lag, data som ikke vises) er fabrikkert. De ytre dimensjonene av den endelige strukturen var ca 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Live/Dead-analysen utført direkte i stillaser. En suspensjon av HUVECs ble injisert i den indre stillaset kanalen, inkubert for 48 h, og behandlet med levende/døde fargestoff. Levedyktig HUVECs avgir grønn fluorescens lys, som er representert i den lyse flekker av bildet. Døde celler avgir grønt fluorescens lys; men ingen er synlige i det observerte stillaset. Fordelingen av cellene betyr også form og evne til å beholde kanalene. I mindre grad, levende/døde analysen løsningen også farget stillas materialet, som produserer lys fluorescens under mikroskopet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Munnstykke design
Ved hjelp av den utviklede kjernen/skallet munnstykket, integrert i en to-Ekstruder Vitaprint system, hule, rørformede stillaser ble fabrikkert i en enkelt-trinns prosess. For å oppnå en jevn tykkelse av røret veggen gjennom de fleste av de preparerte stillaser, må nålen plasseres sentralt på aksen av den ytre ekstrudering ringen. Standard gauge nåler ofte viser en liten, men likevel betydelig valse av aksen. Således ble munnstykket kroppen designet for å holde nålen på to steder, en gang på toppen (fixing navet) og en gang før den endelige kjernen/Shell kammer (fikse kanyle selv), korrigere sin aksial justering. Presisjonen til aksial justeringen øker med avstanden mellom festepunktet. Det er imidlertid en balanse mellom nållengde og tilgjengelig dyse kammer volum. For å forbedre funksjonaliteten til oppsettet ytterligere, kan visse modifikasjoner av munnstykket implementeres: A) en dyse montere med forbedret stabilitet, B) ekstra dyser for et bredere spekter av nål kompatibilitet, C) en presis justering mekanisme for nål til dyse posisjonering, og D) integrere ekstra innganger og mikrovæskebasert enheter for på fly materiale forberedelse.

Hydrogel optimalisering
For å finne det optimale ALG: CMC-forholdet ble flere Material gjentakelser evaluert. Vanligvis ble Core/Shell-utskrift med konsentrasjoner over 3 WT .% av begge komponentene gjort umulig, fordi den ikke tillot en kontinuerlig hydrogel strømning eller resulterte i tilstopping av munnstykket. Nærmere bestemt økte ALG-konsentrasjonen over 3 WT .% viskositet for mye og resulterte i tilstopping av munnstykket, mens lavere ALG-konsentrasjoner og høyere konsentrasjoner av CMC (> 3 WT .%) bremset ned tverr koblingstider og dermed ikke klarte å gi tilstrekkelig strukturell støtte av stillaset. Core/Shell utskrift var mulig med mindre tyktflytende formuleringer; imidlertid må ekstrudert gel viskositet være tilstrekkelig til å opprettholde langsiktig form troskap. Til slutt, en 1:1 ALG: CMC ratio ble bevist å være den mest hensiktsmessige valg som bekrefter en tidligere studie av Maver et al.49. Tillegg av NFC betydelig forbedret utskriftsevnen og strukturelle stivhet av kjernen/skallet trykt stillaser men hadde ingen signifikant effekt på kryss-linking egenskaper av materialet.

Egendefinerte programmer, optimalisert for bestemte celletyper og eksperimentelle set-ups vil kreve godt skreddersydde stillas materialer, som vil variere i komposisjon og kryss-linking mekanismer. Metoden beskrevet i dette arbeidet er basert på en alginat-cellulose blandet polymer løsning, som er tverrbundet ionically bruker ca2 + ioner. Alginat seg selv er en lineær polymer av blokker av (1, 4)-knyttet β-d-mannuronate (M) og α-l-guluronate (G) rester som kan være reverserbart ionically krysskoblet ved anvendelse av ca2 + og andre divalent spesifikasjoner som SR2 +, br2 +, mg 2 +. Likevel er den mest brukte ion for kryss-linking av alginat fortsatt ca2 + i form av CaCl2. Ca2 + kan også brukes i form av CaSO4 eller caco3; den lave løselighet av CaSO4 i forhold til CaCl2 betyr imidlertid tregere gelation. CaCO3 gir enda tregere gelation ganger som kan resultere i svake og inkonsekvente mekaniske egenskaper.

Lengre gelation ganger typisk produsere en mer homogen konstruksjon, men visse programmer, for eksempel Core/Shell utskrift krever rask gelation priser50. Mg2 + ioner induserer også gelation; men deres kryss-linking effektivitet er ca 5x-10x lavere, sammenlignet med ca2 +, med kryss-linking tider på 2-3 t. I tillegg er magnesium ioner mer selektiv mot guluronic enheter, derav kryss-linking avhenger mer på den kjemiske sammensetningen av ALG51. I dette tilfellet er en rask gelation hastighet avgjørende for å sikre kontinuerlig hul kanal formasjon før hul strukturen kan kollapse. CaCl2 gir den raskeste gelation hastighet, noe som er avgjørende for direkte deponering av hule filamenter. 100 mM CaCl2 ble benyttet, som tilstrekkelig stabilisert den kontinuerlige dannelsen av en hul filament uten å forårsake gel herding i munnstykket.

Utskrift og etterbehandling av stillaser
Følgende trinn bør vurderes under denne delen av prosessen, inkludert 1) sikre at alle løsninger og materialer, inkludert 3D-bioprinter er riktig sterilisert før utskrift. 2) når du klargjør hydrogel, er homogenitet av materialet avgjørende for kontinuerlig utskrift. Innføring av urenheter eller luftbobler bør unngås, da de kan tette munnstykket og/eller forstyrre ekstrudering. 3) sprøyter skal være riktig koblet til kjerne/skall munnstykket via luer mekanismen og riktig satt inn i Ekstruder mounts som vist i figur 2a, B. 4) før du skriver ut en kompleks struktur, anbefales det å pre-extrude en liten del av gel og krysskobling løsning for å fjerne overflødig luftbobler i kjernen/skallet munnstykket og sikre en kontinuerlig hydrogel flyt. Dette kan innlemmes direkte i g-koden for å forbedre repeterbarhet. 5) det er nyttig å legge til et skjørt rundt stillaset for å sikre legging av en homogen hul filament før utskriften av stillaset selv starter.

I tillegg, 6) for å forbedre vedheft mellom utskrift filament og substrat, anbefales det å bruke en flat overflate med god vedheft (dvs. et glass lysbilde eller Petri parabol). 7) ekstrudering munnstykket skal ikke være i direkte kontakt med underlaget for å muliggjøre uavbrutt strøm av hydrogel. Utgangs avstanden vil sterkt påvirke kvaliteten på utskriften, men tykkelsen på ekstrudert filament er en god tilnærming til den opprinnelige innstillingen. 8) Start utskrifts høyden i g-koden skal justeres i henhold til individuelle behov. Etter at utskriften parametrene er optimalisert, stillaset g-koden skal importeres til planet CNC programvare og utskriftsprosessen startet som beskrevet i protokollen. 9) for å kontrollere og optimalisere hydrogel flyt med den hensikt å skrive ut optimale stillaser, bør både formulering sammensetning og utskrift parametre varieres (dvs. utskriftshastighet, trykkpresse, utskrifts temperatur, avstand mellom underlaget og ekstrudering dyse, lag høyde, stillas størrelse, etc.).

Generelt er høyere strømningsrater nødvendig for å skrive ut formuleringer med høyere viskositet. Som nevnt, alle hydrogel formuleringer, som er egnet for umiddelbar kjemisk kryss-linking, tillater ett-trinns fabrikasjon av hule rør og kan brukes med den beskrevne kjernen/Shell oppsett. Trykking og kryss-linking mekanismer må optimaliseres tilsvarende. Etter utskrift ble alle stillaser behandlet av sekundær krysskobling med 5 WT .% CaCl2 -løsning, som sikret fullstendig krysskobling av ALG-CMC-komponenten og sterilisert fra begge sider under et UV-lys i minst 30 min. Det bør sikres at stillaset helt sluker med kryss-linking løsning og ruge for lenge nok til å fullføre kryss-linking prosessen. Post-prosessering vil variere basert på materialet og tverr-linking mekanisme som brukes, som bør vurderes på forhånd. Etter etterbehandling, stillaser bør fjernes forsiktig fra underlaget, overført til cellekultur Media, og inkubert i en kontrollert atmosfære i minst 24 h før celle seeding. Ved hjelp av en fargeløs medium vil forbedre synligheten av celle suspensjonen under injeksjon i stillaser.

Live/Dead-analysen
Den levende/døde løsningen bør være forberedt direkte før gjennomføre analysen og holdt i mørket før du gjennomfører analysen, da den inneholder fluorescens fargestoffer som er utsatt for bleking. Etter ønsket inkubasjonstid, bør cellen kultur Media forsiktig kastes rundt stillaser og skylles med PBS. Ideelt sett bør det samme inngangspunktet brukes for celle seeding etterfulgt av levende/døde analysen blir injisert i stillaser.

Viktigheten av resultater
Både ALG og CMC har allerede blitt brukt til å fremme angiogenese in vitro. Basert på sine ECM-mimetisk funksjoner, fysisk tverr kobling og biokompatibilitet, har ALG vært vanlig ansatt som en komponent for levering og kontrollert frigjøring av angiogenic vekstfaktorer (for eksempel bFGF, HGF, VEGF164 og Ang-1 * henholdsvis)52 ,53,54. Videre, i kombinasjon med gelatin, har CMC også blitt brukt til innkapsle vaskulær endothelial celler på grunn av sin raskt kryss-linking evner under fysiologiske forhold55. NFC ble lagt til for ytterligere å øke den mekaniske stabiliteten og formen troskap av stillaser. Det bør understrekes at målet ikke var å forsterke endometrial blodkar, men å demonstrere muligheten for å produsere perfusable, hul ALG-CMC stillaser, trykt i kjernen/skall mote, som også forenkler vedlegget og spredning av HUVECs. Valget av å bruke en ALG-CMC-blanding var basert på funn av brukte, lett tilgjengelige og biokompatible base materialer som kunne muliggjøre kjerne/skall utskrift av hule kanaler. Mange andre materialer kan være mer levedyktige alternativer for å forbedre angiogenese; Men, noen er ikke egnet for Core/Shell utskrift, som de ikke Letter rask gelation/Cross-Linking, som er avgjørende i denne tilnærmingen.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne den økonomiske støtte til dette prosjektet mottatt fra den slovenske Research Agency (gi tall: P3-0036, og I0-0029), og departementet for vitenskap, utdanning og sport (Grant nummer: 5442-1/2018/59).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) 180947 powder; Mw ~80,000
ATTC HUV-EC-C [HUVEC] LGC Standards (UK) ATCC-CRL-1730 Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) and unidentified factors from bovine pituitary, hypothalamus or whole brain extracts are mitogenic for this line; the cells have a life expectancy of 50 to 60 population doublings.
Axiovert 40 inverted optical microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH (Germany) three contrastingtechniques in one objective – e.g. brightfield,phase contrast and PlasDIC
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Germany) C1016 anhydrou; granular; ≤7.0 mm; ≥93.0%
Cellulose nanofibrils suspension (NFC, 3% (w/v)) The Process Development Center, University of Maine (Maine, USA) nominal fiber width of 50 nm; lengths of up to several hundred microns
ELGA Purelab water purification system Veolia Water Technologies (UK)
EVOS FL Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) AMF4300 a fully integrated, digital, inverted imaging system for four-color fluorescence and transmitted-light applications
Gibco Advanced Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Advance DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 12491015 high glucose; no glutamine; phenol red
Gibco Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 21063029 high glucose; L-glutamine; HEPES; no phenol red
Gibco Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 10270106 FBS origin: Brazil; 5 % (w/v) FBS
Hypodermic Sterican needle B. Braun Melsungen AG (Germany) 9180117 0.40 x 25mm, 27G x 1''
L-glutamine Sigma-Aldrich (Germany) G3126 ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
Live/Dead Cell Double Staining Kit Sigma-Aldrich (Germany) 4511 contains calcein-AM and propidium iodide (PI) solutions; suitable for fluorescence
Nunc EasYFlask cell culture flasks ThermoFisher Scientific Inc. (Germany) 156367 Nunclon Delta certified for monolayer formation, cloning efficiency, non-cytotoxic, non-pyrogenic, and sterility; filter caps; culture area of 25 cm2
Omnifix syringe B. Braun Melsungen AG (Germany) 4617053V 5 mL Luer Lock
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich (Germany) P3032 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich (Germany) P4417 tablet; one tablet dissolved in 200 mL of deionized water yields 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4, at 25 °C
Sodium carboxymethyl cellulose Sigma-Aldrich (Germany) 419338 powder; average Mw ~700,000
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich (Germany) S9137 powder; BioReagent; suitable for cell culture
Ultra-pure water Veolia Water Technologies (UK) 18.2 m? cm at 25?C
VitaPrint 3D bio-printer IRNAS (Slovenia)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  2. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering complex tissues. Science Translational Medicine. 4 (160), (2012).
  3. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in tissue engineering. Scientific American. 300 (5), 64-71 (2009).
  4. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  5. Park, K. M., Shin, Y. M., Kim, K., Shin, H. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2017: A Year in Review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (5), 327-344 (2018).
  6. Mattei, G., Giusti, S., Ahluwalia, A. Design criteria for generating physiologically relevant in vitro models in bioreactors. Processes. 2 (3), 548-569 (2014).
  7. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three‐dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  8. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  9. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  10. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  11. Di Nardo, P., Minieri, M., Ahluwalia, A. Stem Cell Engineering. , Springer. 41-59 (2011).
  12. Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. Journal of the Royal Society Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
  13. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled growth factor delivery for tissue engineering. Advanced Materials. 21 (3233), 3269-3285 (2009).
  14. Caddeo, S., Boffito, M., Sartori, S. Tissue Engineering Approaches in the Design of Healthy and Pathological In Vitro Tissue Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 40 (2017).
  15. Chang, H. -I., Wang, Y. Regenerative medicine and tissue engineering-cells and biomaterials. , InTech. (2011).
  16. Rice, J. J., et al. Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials. Advanced Healthcare Materials. 2 (1), 57-71 (2013).
  17. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocols. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  18. Yu, Y., Alkhawaji, A., Ding, Y., Mei, J. Decellularized scaffolds in regenerative medicine. Oncotarget. 7 (36), 58671-58683 (2016).
  19. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  20. Lovett, M., Lee, K., Edwards, A., Kaplan, D. L. Vascularization strategies for tissue engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 15 (3), 353-370 (2009).
  21. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  22. Bae, H., et al. Building vascular networks. Sci Transl Med. 4 (160), (2012).
  23. Štumberger, G., Vihar, B. Freeform Perfusable Microfluidics Embedded in Hydrogel Matrices. Materials. 11 (12), 2529 (2018).
  24. Ibrahim, M., Richardson, M. K. Beyond organoids: In vitro vasculogenesis and angiogenesis using cells from mammals and zebrafish. Reproductive Toxicology. 73, 292-311 (2017).
  25. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of adult mesenchymal stem cells on in vitro vascular formation. Tissue Engineering Part A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining neovascularization of a scaffold through staged release of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-BB. Tissue Engineering Part A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Li, X., He, J., Zhang, W., Jiang, N., Li, D. Additive manufacturing of biomedical constructs with biomimetic structural organizations. Materials. 9 (11), 909 (2016).
  28. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773 (2014).
  29. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  30. Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Advanced Materials. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  31. Huang, Y., Zhang, X. F., Gao, G., Yonezawa, T., Cui, X. 3D bioprinting and the current applications in tissue engineering. Biotechnology Journal. , (2017).
  32. Wang, X., et al. 3D bioprinting technologies for hard tissue and organ engineering. Materials. 9 (10), 802 (2016).
  33. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  34. Rocca, M., Fragasso, A., Liu, W., Heinrich, M. A., Zhang, Y. S. Embedded Multimaterial Extrusion Bioprinting. SLAS Technology. 23 (2), 154-163 (2018).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. Journal of Thoracic Disease. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  37. Hoch, E., Tovar, G. E., Borchers, K. Bioprinting of artificial blood vessels: current approaches towards a demanding goal. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 46 (5), 767-778 (2014).
  38. Yeo, M., Lee, J. S., Chun, W., Kim, G. H. An Innovative Collagen-Based Cell-Printing Method for Obtaining Human Adipose Stem Cell-Laden Structures Consisting of Core-Sheath Structures for Tissue Engineering. Biomacromolecules. 17 (4), 1365-1375 (2016).
  39. Liu, W., et al. Coaxial extrusion bioprinting of 3D microfibrous constructs with cell-favorable gelatin methacryloyl microenvironments. Biofabrication. 10 (2), 024102 (2018).
  40. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3D bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  41. Akkineni, A. R., Ahlfeld, T., Lode, A., Gelinsky, M. A versatile method for combining different biopolymers in a core/shell fashion by 3D plotting to achieve mechanically robust constructs. Biofabrication. 8 (4), 045001 (2016).
  42. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Advanced Materials. 28 (4), 677-684 (2016).
  43. Kim, G., Ahn, S., Kim, Y., Cho, Y., Chun, W. Coaxial structured collagen–alginate scaffolds: fabrication, physical properties, and biomedical application for skin tissue regeneration. Journal of Materials Chemistry. 21 (17), 6165-6172 (2011).
  44. Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
  45. Mistry, P., et al. Bioprinting Using Mechanically Robust Core-Shell Cell-Laden Hydrogel Strands. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  46. Banović, L., Vihar, B. Development of an extruder for open source 3D bioprinting. Journal of Open Hardware. 2 (1), (2018).
  47. HUV-EC-C [HUVEC] (ATCC® CRL-1730™) Homo sapiens umbilical vein. , Available from: http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx?geo_country=si#documentation (2019).
  48. Habib, A., Sathish, V., Mallik, S., Khoda, B. 3D printability of alginate-carboxymethyl cellulose hydrogel. Materials. 11 (3), 454 (2018).
  49. Maver, T., et al. Combining 3D printing and electrospinning for preparation of pain-relieving wound-dressing materials. Journal of Sol-Gel Science and Technology. , 1-16 (2018).
  50. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: Part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  51. Topuz, F., Henke, A., Richtering, W., Groll, J. Magnesium ions and alginate do form hydrogels: a rheological study. Soft Matter. 8 (18), 4877-4881 (2012).
  52. Perets, A., et al. Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 65 (4), 489-497 (2003).
  53. Ruvinov, E., Leor, J., Cohen, S. The effects of controlled HGF delivery from an affinity-binding alginate biomaterial on angiogenesis and blood perfusion in a hindlimb ischemia model. Biomaterials. 31 (16), 4573-4582 (2010).
  54. Peirce, S. M., Price, R. J., Skalak, T. C. Spatial and temporal control of angiogenesis and arterialization using focal applications of VEGF164 and Ang-1. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), H918-H925 (2004).
  55. Kageyama, T., et al. In situ cross-linkable gelatin-CMC hydrogels designed for rapid engineering of perfusable vasculatures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (6), 1059-1066 (2016).

Tags

Bioteknologi kjerne/Shell koaksial bioprinting bioteknologi vev engineering CMC alginat rørformede vev engineering endometrial blodkar
Core/Shell Printing stillaser for vev engineering av rørformede strukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milojević, M., Vihar, B.,… More

Milojević, M., Vihar, B., Banović, L., Miško, M., Gradišnik, L., Zidarič, T., Maver, U. Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures. J. Vis. Exp. (151), e59951, doi:10.3791/59951 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter