Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

doi: 10.3791/59952 Published: August 22, 2019

Summary

Bruken av thiolated uracil til følsomt og renser spesielt RNA fra gjær Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Nukleotid analoge, 4-thiouracil (4tU), er lett tatt opp av celler og innlemmet i RNA som det er skrevet i vivo, slik at isolering av RNA produsert i en kort periode med merking. Dette gjøres ved å feste en biotin moiety til innarbeidet alkyltiokarbamid gruppe og affinitet rensing, ved hjelp av streptavidin belagt perler. Å oppnå en god avkastning på ren, nylig syntetisert RNA som er fri for eksisterende RNA, gjør kortere merking ganger mulig og tillater økt Temporal oppløsning i kinetisk studier. Dette er en protokoll for svært spesifikke, høykapasitets rensing av nylig syntetisert RNA. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan RNA er Hentet fra gjær Saccharomyces cerevisiae. Protokollen for rensing av thiolated RNA fra total RNA bør imidlertid være effektiv ved hjelp av RNA fra en hvilken som helst organisme når den er Hentet fra cellene. Renset RNA er egnet for analyse av mange brukte teknikker, slik som Reverse transkriptase-qPCR, RNA-SEQ og SLAM-SEQ. Spesifisitet, følsomhet og fleksibilitet av denne teknikken gir uovertruffen innsikt i RNA metabolisme.

Introduction

RNA har en dynamisk natur; snart etter at den er produsert mye RNA er raskt behandlet og degradert. Foreløpig de fleste studier av RNA metabolisme analysere den totale cellulære RNA, som er mest fullstendig behandlet og på steady state nivå. Dette nivået avhenger av balansen mellom utbredelsen av transkripsjon, post-transcriptional modning og degradering. Analyse av prosesser som fører til steady state likevekt krever spesialiserte teknikker for å fange svært kortvarig RNA arter.

Metabolsk merking av RNA med nukleotid analoger som 4-thiouracil (4tU) eller 4-thiouridine (4sU) (se Duffy et al.1 for en utmerket vurdering), gir muligheten til å isolere Alkyltiokarbamid begynnende RNAs og deres prosessering mellom produkter. Men publiserte protokoller innebære merking ganger av flere minutter2,3, som er langsom i forhold til frekvensen av produksjonen av mange transkripsjoner. Det tar i rekkefølgen av ett minutt å transkribere gjennomsnittlig gjær genet, så merking gjær RNA for mindre enn ett minutt kan betraktes som svært kort. Den ekstremt raske og spesifikke 4 thiouracil protokollen (ers4tU) maksimerer signal til støyforhold ved å maksimere 4tU innlemmelse og minimere utvinningen av umerkede, eksisterende RNA gjør svært kort merking ganger mulig4.

Den alkyltiokarbamid basen må importeres til cellene raskt og i tilstrekkelig mengde til å merke den nye syntetisert RNA (nsRNA) på en effektiv måte. For å fremme dette, er celler dyrket i uracil medium, og uttrykk for en passende permease bidrar til å øke 4tU eller 4sU opptak (se tabell 1 for en liste over plasmider som bærer egnede permease gener og supplerende figur 1). 4tU's løselighet i natriumhydroksid unngår behovet for giftige organiske løsemidler som kreves av andre nukleotid analoger. Dessverre har det blitt observert voksende kulturer i lange perioder med alkyltiokarbamid nucleosides ved konsentrasjoner som er større enn 50 μM for å forstyrre ribosomer5. Men konsentrasjonen (10 μM) brukes her, og den ekstremt korte merking ganger, minimere skadelige effekter5 (figur 1a), mens fortsatt gir tilstrekkelig RNA for analyse.

Denne teknikken kan kombineres med rask og spesifikk auxin-mediert forringelse av et mål protein6,7 (figur 2), referert til som "β-EST Aid 4U" protokollen, der β-østradiol regulert uttrykk for auxin induserbart degron (AID)-systemet kombineres med 4tU-merking. Med β-EST AID 4U-tilnærmingen kan et mål protein tømmes og effekten på RNA-metabolismen overvåkes nøye (figur 2). Timingen er kritisk; Det er tilrådelig å vise den med følgende videoen og følge nøye med på figur 2 og dens animerte form (se supplerende figur 2).

Prosessering og nedbrytning av RNA må stoppes svært raskt for nøyaktig tidsoppløsning. Dette oppnås ved hjelp av metanol ved lav temperatur, som fikser celleinnholdet svært raskt og forringer cellemembranen samtidig bevare nukleinsyre syre innhold8. RNA-ekstraksjon skal være effektiv og ikke skade RNA-en. Mekanisk lyse er effektivt i fravær av chaotropic midler (ofte disse inneholder alkyltiokarbamid grupper, så bør unngås). Lithium klorid utfelling av RNA foretrekkes, da tRNAs er mindre effektivt igangsatte. tRNAs er raskt kopieres og naturlig thiolated9, så fjerner tRNAs reduserer konkurranse for biotinylation reagens. Hvis små, svært strukturerte RNAs er av interesse, anbefales alkohol-baserte RNA nedbør metoder.

For å gjenopprette thiolated RNA, er biotin covalently festet via de alkyltiokarbamid gruppene innlemmet i RNA med 4tU. Bruk av modifisert biotin, som festes via et spaltbare disulfide (f.eks. HPDP-biotin (N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)pRopionamide,) eller MTS-biotin (metan thiosulfonate)) anbefales som det tillater utgivelsen av RNA ved tilsetning av et reduksjonsmiddel. Biotinylated RNA er affinitet renset på streptavidin koplet til magnetiske perler. Denne protokollen er lik andre som er oppført tidligere10 , men har vært intensivt optimalisert for å redusere bakgrunnen.

Det finnes to typer tiolderivat-eksperiment som kan utføres, kontinuerlig og usammenhengende merking. Hver har sine egne fordeler. I kontinuerlig merking legges 4tU til kulturen og prøvene som tas med jevne mellomrom. Denne typen eksperiment viser hvordan RNA-en behandles, og hvordan nivåene endres over tid. Eksempler er sammenligning av mutant med vill-type eksperimenter og et puls-jage eksperiment. Eksperimentene som vises i figur 3B, c er av denne typen. For usammenhengende merking en endring er indusert inn i systemet og RNA overvåkes. Når endringen har blitt indusert kulturen må deles inn i flere sub-kulturer, og til bestemte tider, hver og en er så alkyltiokarbamid-merket for en kort periode. Et eksempel er β-EST AID 4U vist i figur 27. Denne typen eksperiment er spesielt nyttig for å overvåke effekten av en metabolsk endring på RNA-behandling (se figur 3D).

En grafisk fremstilling av et alkyltiokarbamid-eksperiment er presentert i Figur 4 og figur 5, og et regneark som i stor grad forenkler ytelsen til protokollen er tilgjengelig (se 4tU eksperiment mal. xlsx). I tillegg til dette inneholder utfyllende informasjon en omfattende feilsøkingsveiledning. For β-EST AID 4U-protokollen som integrerer 4tU-merkingen med auxin-protokollen, se figur 2 og supplerende figur 2. Se Barrass et al.7 for den detaljerte nød tømming protokollen.

Protocol

1. vekst og alkyltiokarbamid-merking

Merk: tid for fullføring av denne delen av protokollen er svært variabel, avhengig av cellevekst rate. La 1 time klargjøre løsningene og utstyret før alkyltiokarbamid og 30 min etter merking for å behandle prøvene.

  1. Kontroller at S. cerevisiae- belastningen inneholder en plasmider koding av en Permease (tabell 1) for å øke 4tU import til cellen.
    Merk: uten importør er det lite sannsynlig at merking for mindre enn 2 minutter er vellykket11 (se supplerende figur 1). 4tU innlemmelse er mer effektiv hvis veksten er i medium uten uracil, så belastningen må være URA3+; flere av plasmider i tabell 1 bære URA3 som markør. Hvis denne protokollen skal kombineres med hjelp fra β-EST7, kreves det ytterligere belastningsendringer.
  2. Forbered YMM uracil medium ved å legge til 6,9 g gjær nitrogen base uten aminosyrer, 20 g glukose, og 1,92 g av SCSM enkelt dråpe-out − ura (tabell over materialer) til 1 L vann. Autoklav eller filter sterilisere vekstmedium før bruk.
    Merk: filter sterilisering foretrekkes som peptid/sukker komplekser produsert av autoklavering co-fremskynde med cellene i metanol som brukes i prøvetaking samling.
  3. Grow gjær i YMM uracil-fritt medium til en optisk tetthet på 600 NM (OD600) på 0,6 − 0.8. Sikre at kulturen er i log fase vekst og har vært i minst to doublings. Veksten ved 30 ° c anbefales vanligvis, men andre temperaturer kan brukes, for eksempel for temperaturfølsomme stammer.
    Merk: avhengig av belastningen, vekst forholdene og RNA-utbyttet, vil det være behov for ca. 30 mL prøvevolum. Dette beløpet vil bli antatt i hele protokollen. 30 mL kultur er den mest som vil passe inn i en 50 mL sentrifugerør med 20 mL metanol, så er et praktisk volum for å starte optimalisering. Vurder å bruke flere prøvevolum for tidlige tid punkter for å øke RNA-utvinningen, opptil 2000 mL har blitt brukt til langsommere voksende celler med veldig korte etikett tider (< 1 min).
  4. Chill ca 50 mL av H2O på Ice. For hver prøve, tilsett 200 μL av zirconia perler til en 2 mL skrue-cap tube og chill på isen. Også satt 20 mL av metanol (forsiktig), i 50 mL sentrifugerør, og plasser på tørr is (forsiktig). Metanol bør være 1/3 til 2/3 volumet av prøven.
    FORSIKTIG: metanol er giftig ved innånding, kontakt og forbruk. Dispensere store volumer i en avtrekks hette og bruk to par hansker, da metanol kan trenge hansker i nitril. Metanol er svært brannfarlig, holdes borte fra alle antennelseskilder.
    Merk: tørr is kan forårsake kalde brannskader ved kontakt og produserer asphixiant gass, bruk hansker ved håndtering og bruk på et godt ventilert sted.
    Merk: legge perlene på dette punktet er enklere enn etter prøven har blitt lagt til som røret er tørt og når spinne ned cellen pellet perlene er også spunnet klar av røret tråden spare tid. I tillegg gjør dette at perlene avkjøles før prøven legges til.
  5. Hvis en S. pombe Spike skal legges til kulturen (i stedet for senere), tine en alikvot av thiolated S. pombe celler på is og Vortex grundig, minst 30 S, deretter legge til kulturen. Hvis utarbeidet i henhold til instruksjonene nedenfor, er en S. pombe alikvot tilstrekkelig for 400 ml kultur (nok til 12 30 ml prøver pluss litt for å tillate feil i håndteringen). Hvis det brukes mer eller mindre kultur, justerer du volumet S. pombe lagt til i kulturen.
    1. Grow 1 L av S. pombe kultur til OD600 til 0,8 nøyaktig som beskrevet i protokollen for S. cerevisiae.
    2. Alkyltiokarbamid-label som trinn 1,7, men i 10 min.
    3. Fiks all kulturen med 400 mL metanol på tørr is, i hovedsak som beskrevet i trinn 1,9.
    4. Pellet cellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 3 min.
    5. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 3,3 mL H2O.
    6. Del inn i alikvoter på 80 μL hver. Store ved-80 ° c.
    7. Bruk alt av én alikvot for 400 mL kultur eller 10 μL per 30 mL prøve.
      Merk: Reduser volumet på spiker til 1/10 hvis du utfører RNAseq. Ikke gjenbruk alikvoter; kastes ubrukt pigg. Denne Spike er nyttig for å normalisere og sammenligne resultater på tvers av tids punkter og eksperimenter.
  6. For usammenhengende merking, indusere de nødvendige metabolske forstyrrelsene (f. eks, vekstforhold, gen induksjon eller forringelse som β-EST AID7 (figur 2 og supplerende figur 2), og deretter dele kulturen. Sørg for at alle flasker og medier er ved ønsket temperatur, og om mulig aerate mediet før du legger til kulturen.
  7. Legg 4tU til kulturen til en konsentrasjon på 10 μmM og bland kraftig (1/10 000 av kultur volumet av 100 mm 4TU oppløst i 1 M NaOH). Tiolderivat-etikett for 15 s til 5 min.
    Merk: tretti sekunder er et godt utgangspunkt. Alkyltiokarbamid-merking for mindre enn 20 s gir mer variable resultater på grunn av vanskeligheter med å manipulere kulturen under tidspress. Men merking for mer enn 1 min reduserer den timelige oppløsningen av teknikken.
  8. Hvis et jager eksperiment skal utføres; tillate alkyltiokarbamid-merking for 20 − 30 s deretter jage ved å legge 1/200 kultur volum på 1 M uridindifosfatglukuronosyltransferase (ikke thiolated), til en endelig konsentrasjon på 5 mm.
    Merk: Uridindifosfatglukuronosyltransferase er å foretrekke å uracil for jakten, som uridindifosfatglukuronosyltransferase er mer vannløselig slik at et mindre volum som skal legges til kulturen og så det er mindre forstyrrelse for veksten av cellene.
  9. Ta prøver av kulturen med jevne mellomrom (minst 15 s), til slutten av tiden kurset. Samplings intervaller kortere enn dette er vanskelig å utføre på en pålitelig måte. Legg prøven til metanol på tørr isen forberedt i trinn 1,4. For enkelhets skyld, tilsett 30 mL kultur til et 50 mL rør som inneholder 20 mL metanol.
    Merk: karbondioksid oppløses i metanol når kulden; Dette kommer ut av løsningen på tilsetning av prøven og skum ved blanding, noe som resulterer i prøve tap. For å unngå dette, chill metanol til <-70 ° c i et tett forseglet rør til nær den tiden det er nødvendig, og deretter overføre til tørr is.
  10. Forsegle røret og bland godt ved risting. Plasser prøvene på isen. Kontroller at ingen av prøvene har frosset; Hvis så, forsiktig varm i hånden, invertere hele tiden. Dette gjøres best i hånden som prøven temperatur kan vurderes, bør det alltid føles kaldt. Plasser på isen. Dette er ikke et pause punkt. Når alle prøvene er væsken videre til neste trinn.
  11. Spin på 3000 x g for 2 min (ved 4 ° c hvis mulig) å pellet cellene. Hell av væsken og resuspend pellet i minst 1 mL iskaldt vann ved forsiktig pipettering opp og ned.
    Merk: den gjenværende metanol i prøve pellet hjelpemidlene blanding.
  12. Overfør til 2 mL skrulokk rør som klargjort i trinn 1,4. Spin kort (f. eks 10 s total tid) på > 13000 x g til re-pellet cellene, sted tilbake på isen og fjerne væske.
    Merk: celle pellet kan oppbevares ved-70 til-80 ° c i flere måneder.

2. utarbeidelse av total RNA

Merk: tiden for ferdigstillelse er 90 min.

  1. Bruk dietyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlede løsninger for å beskytte RNA-en mot degradering. Alikvot løsningene med filter pipette og hansker til enhver tid.
    1. Til en løsning legge 1/1000 volum av DEPC og bland ved kraftig risting.
    2. La ved romtemperatur (RT) i 24 h, deretter autoklav.
    3. Løsninger med Amin grupper (som Tris) kan ikke behandles DEPC. Alikvot pulveret og oppbevar spesielt for RNA-arbeid. Bruk tidligere DEPC behandlet H2O for å gjøre løsningen.
      Merk: Når alkyltiokarbamid på RNA-en er photoactivatable, minimerer du eksponeringen for UV-lys fra nå av. Lagring bør være i mørket og inkubasjons gjøres best i en PCR-maskin med lokk.
  2. Hvis en S. pombe Spike skal legges til cellen pellet snarere enn kulturen (ikke gjør begge deler), legger det nå. Tin en alikvot av thiolated S. pombe celler på is og Vortex grundig, minst 30 S, før du legger til pellet.
    Merk: Hvis utarbeidet i henhold til trinn 1.5.1 − 1.5.7, er 10 μL av S. pombe alikvot nødvendig for en pellet avledet fra 30 ml kultur.
  3. Før du setter på hetten, spinner du veldig kort for 1 − 2 s for å sikre at ingen zirconia perler er fanget mellom hetten og røret, noe som kan føre til at prøven og fenol lekker fra slangen.
  4. Resuspend cellene i 400 μL av acetate EDTA (AE) buffer (50 mM natrium acetate pH 5,3, 10 mM EDTA pH 8,0), ved virvlingen kraftig. Tilsett 40 μL av 10% (w/v) natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS). Ikke Vortex, som SDS vil skum.
  5. Hvis β-EST AID 4U-protokollen skal brukes, ta 40 μL av celle fjæringen for proteinanalyse7. Tilsett 40 μL av AE for å gjøre volumet tilbake til 400 μL.
  6. Tilsett 800 μL av fenol (forsiktig) ved lav pH og Vortex i 10 s.
    FORSIKTIG: fenol er giftig og etsende ved innånding og kontakt. Utfør alltid prosedyrer som involverer fenol i en avtrekksvifte og bruk to par hansker.
  7. Lyse cellene i en homogenisator (f.eks. materialfortegnelsen) i tre 2-minutters serieopptak med den laveste strøminnstillingen. La prøvene på isen i 2 min mellom pulser på homogenisering.
    Merk: Optimaliser betingelsene hvis du bruker andre homogenisatorer. Utilstrekkelig risting vil resultere i dårlig avkastning, mens overdreven risting resulterer i tilsynelatende høyere utbytte, som bestemmes av absorbansen ved 260 NM (A260), men RNA kan forringes. En homogenisator foretrekkes, men varm fenol RNA rensing12 kan brukes.
  8. Plasser den lysert prøven på tørr is i 5 minutter, inntil den stivner, dette reduserer genomisk DNA overføres til RNA. Ikke Frys for lenge prøven vil ikke tine. Spin 5 min i microfuge ved > 13000 x g ved RT; ikke bli fristet til å gjøre dette ved 4 ° c, da prøven/fenol-miksen vil holde seg solid gjennom hele spin hvis den utføres ved lav temperatur.
    Merk: Hvis prøven fortsatt er frosset på slutten av spinn, re-spin for ytterligere 5 min til prøven har helt tint.
  9. Fenol/kloroform ekstrakt deretter kloroform ekstrakt med et lik volum (ca. 600 μL) av fenol: kloroform 5:1 deretter kloroform (forsiktig). Overfør den øverste fasen til et annet rør som inneholder fenol: kloroform 5:1 eller kloroform. Vortex, deretter spinne i 5 minutter i en microfuge på RT. Deretter overfører du den øverste fasen til en ny 1,5 mL tube.
    FORSIKTIG: kloroform er giftig ved innånding og kontakt. Utfør alltid prosedyrer som involverer kloroform i en avtrekks hette og bruk to par hansker.
  10. Legg til en tredje til halv volum (ca. 300 μL) på 10 M LiCl, og bland for å utløse RNA. Prøven skal gå skyet umiddelbart, men la stå i minst 10 min på isen eller ved 4 ° c (ikke Oppbevar under-20 ° c som det vil fryse), eller til utfelling flocculates.
  11. Spin for 5 min på > 13000 x g i en microfuge. Ta av væsken, kort re-spin og fjern Dregs. Vask pellet med 300 − 500 μL av 70% etanol, spinn kort og fjern gjenværende etanol.
    Merk: i løpet av disse vasker holde pellet på samme side av røret som første spinn, på denne måten pellet vil ikke flytte og brekke; Hvis det bryter noe av RNA-en kan gå tapt ved et uhell.
    Merk: ikke tørk pellet; så lenge det meste av væsken har blitt fjernet det vil ikke forstyrre med påfølgende trinn. RNA-en kan også lagres på dette stadiet ved-20 ° c i noen måneder eller-70 til-80 ° c for langtidslagring.
  12. Løs opp RNA-pellet-en på 90 μL av TE pH 7,0 (10 mM Tris HCl pH 7,0, 1 mM EDTA pH 8,0) ved oppvarming ved 65 ° c med risting, da RNA-pellet kan være vanskelig å oppløse. Dette må ikke være mer enn 5 minutter , da RNA blir dårligere ved høyere temperaturer. Se etter fullstendig RNA-oppløseliggjøringen og Overfør deretter til et 0,2 mL rør. Pipetter prøven opp og ned; Det bør ikke være noen "klumper", og væsken skal stige og falle jevnt i spissen. Denne løsningen er tyktflytende, så den endelige pipettering bevegelsen bør være langsom.
    Merk: RNA-en kan oppbevares ved-20 ° c i mørket på dette stadiet; Dette kan også være fordelaktig for RNA løselighet.

3. Biotinylation

Merk: tiden for ferdigstillelse er 60 min. Følgende trinn er praktisk gjort i en stripe av rør med integrert caps som de har mindre tendens til å åpne på virvlingen enn strimler med separate caps.

  1. Biotinylate ved å tilsette 10 μL (1/10 endelig volum) av en 5 mm HPDP oppløsning (MTS-biotin kan brukes på nøyaktig samme måte som HPDP), til RNA og bland godt. Varm opp RNA-en i mer enn et par sekunder ved 65 ° c før du legger til biotin. Ruge ved 65 ° c i 15 min til maksimalt 30 min i mørket.
    Merk: denne oppvarmingen er nødvendig som noen HPDP batcher utløse på RT i RNA prøven. En PCR-blokk med oppvarmet lokk er ideell for dette.
  2. Forbered en liten harpiks volum, størrelse utelukkelse kolonne (tabell over materialer) for å utelukke den kommunefritt biotin. Fjern den nederste koden i kolonnen og løsne hetten, plass i en 2 mL sentrifugerør. Spin på 1500 x g i 1 min for å skylle ut buffer legge 0,3 ml av te forsiktig til toppen av kolonnen og spinne igjen. Gjenta vask og spinn to ganger til totalt 3 vasker. Til slutt overfører den vasket kolonnen til en frisk 1,5 mL tube.
  3. Når prøve inkubasjons (trinn 3,1) er fullført, legger du til prøven øverst i kolonnen. Spin på 1500 x g for 2 min. Den biotinylated RNA-prøven er nå i bunnen av røret.
    Merk: det er ikke nok med 1 min spin til å eluere hele prøven.
  4. Legg til en tredje til halv volum (ca. 40 μL) på 10 M LiCl, bland for å re-utløse RNA som trinn 2,10. Prøven skal gå skyet umiddelbart, men la stå i minst 5 min på isen eller ved 4 ° c eller til utfelling flocculates; oppbevares under-20 ° c da det vil fryse. Sentrifuger prøven i 5 minutter ved > 13000 x g i en microfuge.
  5. Vask med 80% etanol, ≤ 1 t roterende. Følg fremgangsmåten i trinn 2,11 for å fjerne så mye av væsken som mulig.
    Merk: som HPDP-biotin er svært løselig i 80% etanol, er dette en ekstra rensing trinn.
  6. Gjenta 80% etanol vask for å fjerne så mye un-innarbeidet biotin som mulig.
    Merk: RNA-en kan også oppbevares på dette stadiet ved-20 ° c i mørket.

4. rensing av det nye syntetisert RNA

Merk: tiden for ferdigstillelse er 2 t.

  1. Re-oppløse RNA i 200 μL av DEPC-behandlet H2O (65 ° c inkubasjons kan brukes, tilsvarende prosedyren i trinn 2,12).
  2. Mål RNA-konsentrasjonen ved A260 ved hjelp av en spektrofotometer; prøven må fortynnes 1/10 for å få den innenfor spektrofotometer lineære rekkevidde. Vortex denne fortynning i minst 10 s for å sikre at den viskøs RNA er jevnt oppløst.
    Merk: effektiviteten av biotinylation kan vurderes av dot blot13 om nødvendig.
  3. Legg like store mengder RNA til et friskt rør og lag opptil 200 μL i DEPC-behandlet H2O. Bruk hele prøven med lavest RNA-konsentrasjon og bruk et passende volum av de andre prøvene for å få en tilsvarende mengde RNA for hver.
    Merk: regnearket 4tU eksperiment mal. xlsx har et skjema for å hjelpe denne beregningen.
  4. Når prøven er på RT, tilsett 25 μL av 10 x NaTM buffer (0,1 M Tris HCl pH 7,0, 2 M NaCl, 250 mM MgCl2), 25 μL av 1 m NaPi pH 6,8 (0,5 m NaH2PO4 0,5 M na2HPO4) og 2,5 til 10%. Bland godt og snurr forsiktig (< 30 s; ca. 100 x g).
    Merk: for å unngå utfelling av SDS og salter, må prøvene oppbevares på RT gjennom følgende prosedyrer opp til trinn 4,13.
  5. Gjør perle bufferen som inneholder 1x NaTM-buffer, 0,1 M NaPi og 0,1% SDS, 2 mL per prøve. Legg den nødvendige mengden av H2O først og SDS sist. Dette må gjøres friskt hver gang som en utfelling former etter 24 h.
    Merk: for å unngå dannelse av precipitates må perle bufferen oppbevares på RT i hele følgende prosedyrer. Ikke DEPC behandle eller autoklav.
  6. Tilsett 50 μL av streptavidin perler til en lav oppbevaring 1,5 mL tube. Plasser røret på den magnetiske stativet, vent til perlene å bosette og deretter fjerne væsken
  7. Vask streptavidin perler.
    1. Tilsett 200 μL av perle buffer og Vortex til perle pellet er helt resuspendert. Vanligvis er 3 − 5 s alt som kreves. For vask før RNA prøven er lagt til er det tilstrekkelig å snu rørene rundt slik at perlene beveger seg over røret til den andre siden. Deretter slår rørene tilbake til den opprinnelige siden slik at perlene reiser over røret igjen.
    2. Snurr røret i lav hastighet (ca. 100 x g) for maksimalt 5 s for å spinne ned væsken, men ikke perlene.
    3. Plasser den magnetiske stativet slik at perlene kan fanges opp av magneten.
    4. Fjern væsken ved aspirasjon for et lite antall prøver; hell av væsken Hvis mange prøver.
      Merk: med et stort antall prøver, fjerne all væsken rent ved aspirasjon kan være problematisk, som perlene i den første prøven kan tørkes ut før siste prøven er ferdig, dette øker bakgrunnen. Vask kan bli fremskyndet ved å helle av væsken fra alle prøvene samtidig mens på magneten. De bør være igjen litt lenger på magnet før helle og den lille mengden væske som gjenstår må pustende unna, men generelt, betyr det mindre tid på magnet og uten væske. På denne måten er det mulig å gjøre 24 eller flere utdrag raskt.
  8. Blokk med 200 μL perle buffer, 10 μL 20 mg/mL glykogen og 2,5 μL 5 mg/mL tRNA, 20 min roterende ende over ende ved moderat hastighet ved RT. Rotasjonen er å holde perlene i suspensjon. Når blokkeringen er fullført, Fjern væsken som trinn 4.7.2 − 4.7.4 og vask igjen, som trinnene i Seksjon 4,7.
  9. Resuspend perlene i prøven. Ruge ved RT med rotasjon i 30 min.
  10. Under inkubasjons forbereder du et friskt 1,5 mL rør for hver prøve. Tilsett 1/10 -volum (ca. 10 ΜL) av 3 M natrium acetate pH 5,3 og 20 μg av glykogen, og snurr på ca. 100 x g for 3 s. oppbevares i et rack til det trengs.
  11. Fjern den ubundne RNA-en fra perlene, som trinn 4.7.2 − 4.7.4. Den ubundne RNA-en kan holdt ut i et friskt rør, men salter og SDS gjør det svært vanskelig å rense. Deretter vaskes perlene, som § 4,7 med virvlingen, for minimum 3 til maksimalt 5 ganger.
  12. Etter den endelige vask ta spesiell forsiktighet for å aspirer all væsken; tilbake til hvert rør og aspirer Dregs av buffer igjen.
  13. For å eluere RNA, tilsett 50 μL av ferskt tilberedte 0,7 M β-mercaptoethanol (βME) til perlene (1/20 fortynning av den kommersielt leverte lager løsningen). Vortex og snurre kort, som trinn 4.7.1 og 4.7.2. Plasser slurry i magnet stativet og Pipetter RNA-en som inneholder løsningen, i 1,5 mL sentrifuge slangen som er klargjort i trinn 4,10.
  14. Eluere igjen som trinn 4,13 for å gjenopprette resterende RNA fra perlene og tilsett eluert prøven til røret som inneholder den første eluering fra disse perlene.
  15. Fjern rester av perlene fra eluert RNA ved å plassere prøven tilbake i magnet stativet og overføre væsken til et friskt, lavt bindende 0,5 mL sentrifugerør.
  16. Bland prøven og deretter utløse nsRNA ved å legge til 2,5 x volumer (280 μL) av etanol og bland igjen. La stå i 1 time til over natten ved-20 ° c. Snurr i en pre-kjølt sentrifuge (4 ° c) for 20 min ved maksimal hastighet (minst 13 000 x g).
  17. Vask grundig med 200 μL av 70% etanol ved-20 ° c. Som resterende βME vil hemme nedstrøms applikasjoner, spin på hvert trinn for å fjerne så mye av Dregs som mulig; på slutten prøven skal ikke lukten av βME.
  18. Oppløses på nytt i 10 − 20 μL av DEPC-behandlet 1x TE med tilsvarende 0,005 μL RNase-hemmer.
    Merk: alle påfølgende etapper skal utføres på is.
  19. Mål RNA-konsentrasjonen og renheten.
    1. Mål A260 og a225 i et lavt samplings volum spektrofotometer.
      Merk: en absorbansen maksimal nær λ = 225 NM er fra en uunngåelig forurensning fra perlene. I fravær av RNA vil signalet fra forurensende stoff reduseres til 35% ved λ = 260 NM. Derfor anslås den faktiske mengden RNA med formelen: (A260-(a225* 0.35)) * 40 ng/μL.
    2. Alternativt kan du analysere prøven på en mikro-fluider elektroforese system som en bioanalyzer.
      Merk: denne analysen er å foretrekke fremfor å bruke en spektrofotometer som RNA-integritet kan vurderes, ikke forstyrrer miljøgifter med kvantifisering og mindre prøve er nødvendig.
  20. Analysere nsRNA.
    NOTE: for eksempel, spesifikk RNAs kan kvantifisert av målestokk det omvendte transkriptase qPCR teknikker. RNA forberedt på denne måten er kompatibel med biblioteket forberedelse for RNA-SEQ. fjerning av rRNA er ikke nødvendig for merking ganger mindre enn 5 min. recoding SLAMseq14 kan også utføres på denne RNA.

Representative Results

Typisk avkastning for nsRNA utvinnes ved hjelp av denne ers4tU protokollen vises i figur 1B, dette har blitt produsert av en bioanalyzer og spor viser utbytte av RNA versus størrelse (nukleotider [NT]). Merk, både i bioanalyzer og den innfelte grafen, at RNA-gjenoppretting fra punkt 0 er en svært liten del av den som utvinnes fra lengre tid punkter-omtrent 0,3 μg av RNA utvinnes fra ca. 109 celler sammenlignet med over dobbelt så mye etter bare 30 s med merking (0,8 μg av nsRNA) fra samme antall celler. RNA-gjenoppretting på 15 s er mer variabel som små forskjeller i utførelsen av sampling har en proporsjonalt større effekt på RNA-gjenoppretting. I det bioanalyzer sporet kan rRNA prekursorer ses på som en topp i nærheten av 1000 og en doublet på 1700 − 1800 NT. Overflod av disse mellom produkter øker som thiolation fortsetter.

Alkyltiokarbamid-merkingen ble brukt for å kvantifisere skjøting av ACT1 transkripsjon (Figur 3). Thiolation ble utført og prøver tatt ved 15 s intervaller fra starten av alkyltiokarbamid-merking og behandling av ACT1 RNA overvåket (figur 3a, b). Som det kan sees, pre-mRNA genereres (ved transkripsjon), og uforståelige (ved første trinn av skjøting fra pre-mRNA), selv etter bare 15 s av merking. Etter ca 45 s til 1 min, mengden av uforståelige og pre-mRNA nå likevekt med så mye av disse RNA artene blir skapt av transkripsjon som er behandlet bort av skjøting.

For å produsere dataene vist i figur 3c belastningen var pulserende med 4tU for 25 s og deretter jaget med uridindifosfatglukuronosyltransferase. Generasjonen av pre-mRNA og uforståelige når maksimalt 1 minutt. Dette sammenligner godt med figur 3b; maksimum oppnås etter 45 s for å nå likevekt pluss 25 s av merkingen. Etter toppen, nivåene nedgangen som alkyltiokarbamid-merket RNAs er jaget gjennom skjøting prosessen.

Figur 3D viser tømming av et protein skjøting faktor og dens effekt på RNA metabolisme, ved hjelp av β-EST Aid 4U system6,7. Her er Prp16p redusert fra nær fysiologiske nivåer til 5% av dette nivået etter 25 min av nedbryting. Prp16p er en viktig skjøting faktor for det andre trinnet av skjøting15. Uforståelige fjernes under det andre trinnet av skjøting (figur 3a), men her de øker over nivået av pre-MRNA som Prp16 blir begrensende. Ved senere nedbryting ganger, andre faktorer blir begrensende på grunn av sekundære effekter, slik at nivåer av lariat nedgang, og pre-mRNA nivåer stige. Nivået av skjøtes mRNA avslår.

Figure 1
Figur 1: vekst i 4tU og RNA utvinning. (a) 4-thiouracil påvirker vekst. Øke konsentrasjonen av 4tU i YMM drop-out vekstmedium uten uracil øker dobling tiden av S. cerevisiae (BY4741) bærer p4FuiΔPEST plasmider. Veksten av fire replikere kulturer ble overvåket ved 30 ° c i en Tecan Infinite Pro 200. Alle kulturer var i logg fasen gjennom, med OD600 mellom 0,1 og 0,6. Mock er en kontroll kultur med en tilsvarende mengde NaOH lagt til, som ikke i seg selv endre vekstraten. Denne grafen viser at alkyltiokarbamid er kompromiss mellom rask merking og skade på cellen. Feil stolper er standard feil av 4 replikerer. (b) nsRNA yield øker lineært fra ca 15 s av merking. Den viktigste figuren viser bioanalyzer spor av renset, nsRNA fra 0 (ikke thiolated) til 2 min etter tilsetting av 4tU på 15 s intervaller. Merk at 15 s prøven ikke vises, da det var umulig å skille fra den umerkede prøven. De to store toppene tilsvarer ribosomal RNAs (rRNAs). Den rRNA forløpere og mellom produkter er synlige som flere topper på større molekylvekt enn eldre rRNAs. Utvinningen av disse forløpere og mellom produkter øker med tiden. Resultater fra ett representativt eksperiment vises. Den innfelte grafen viser utvinningen av nsRNA med økende inkubasjons med 4tU. Avkastningen av nsRNA øker med økende vekst tid med 4tU. Utvinningen er bemerkelsesverdig lineær (R2 = 0,934) gjennom hele tidsskalaen i dette eksperimentet, og viser en svak økning over bakgrunnen selv ved 15 s merking med 4tU selv om ikke skilles fra umerkede prøven av øyet fra bioanalyzer Spor. Feil stolper viser standard feil for tre biologiske replikeres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: β-EST Aid 4U β-EST Aid 4U grafisk protokoll. Et grafisk sammendrag av protokollen for β-EST AID 4U-protokollen. β-østradiol (β-EST) fremmer uttrykket av auxin induserbart degron (AID) system som i sin tur reduserer et AID * merket mål protein, se Barrass et al.7 for en detaljert protokoll. I dette tilfellet degron system uttrykk er initiert 25 min før protein degradering starter og thiolation på hver gang punktet er for 1 min. prøvene tas før induksjon og hvert 2. minutt under nedbryting. En animert versjon vises i supplerende figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: forløpere og mellom produkter av ACT1 RNA skjøting. Skjøting av ACT1 pre-mRNA transkripsjoner ble overvåket av KVANTITATIVE omvendt transkripsjon PCR16. Nivåene av ACT1 forløper (pre-mRNA), mellomliggende lariat-Exon2 (lariat) og skjøtes produkt (mRNA) vises normalisert mot nivået av ACT1 exon2 og steady state nivåer av disse RNAs. (a) plassering av qPCR produkter på ACT1 transkripsjon. Skjematisk av plasseringen av qPCR produkter som brukes til å analysen nivåene av forløpere, mellom produkter og varer av skjøting reaksjonen av ACT1 transkripsjoner16. Exoner representeres av esker, Intronets opprinnelse som en linje og qPCR-produktene som linjer med diamanter i begge ender, fargen matcher de som brukes i diagrammene. Pre-mRNA PCR er spesifikk for pre-mRNA og ikke noen mellom produkter av skjøting som dette produktet krysser grenen punktet som er forstyrret etter det første skrittet av skjøting. Lariat PCR vil oppdage produktet av det første skrittet av skjøting og excised lariat produsert etter den andre. Den mRNA PCR er spesifikk for produktet av skjøting, mRNA. Resultater fra ekson PCR (finnes i alle forløpere, mellom produkter, unntatt excised lariat) vises ikke i diagrammene da dette ble brukt til å normalisere dataene og er derfor alltid lik 1. (b) kontinuerlig thiolabelling. Mengden av pre-mRNA øker med tiden som 4tU er innarbeidet ved transkripsjon, og etter en kort forsinkelse, skjøting konverterer det til lariat-exon2 mellomliggende og skjøtes produkter. Nivåene av disse pre-mRNA og lariat arter er synlig over bakgrunnen etter så lite som 15 s av vekst med 4tU og nå et maksimum etter ca 45 s av kontinuerlig merking med 4tU, noe som peker deres produksjon er balansert ved konvertering til skjøtes mRNA og/eller degradering. Verdiene er normalisert til steady state (venstre-mest punkt i grafen), og ekson 2 nivåer for å vise sitt utseende og behandling i forhold til transkripsjon av ekson 2. Som RNA skjøting av ACT1 er i stor grad co-transcriptional4,17 skjøtes mRNA raskt blir den mest tallrike arter, er dens nivå lik som ekson 2. Standard feil av tre biologiske replikerer, hver analyseres i tre eksemplarer. (c) puls/Chase. Thiolation puls på 25 sekunder etterfulgt av jage med uridindifosfatglukuronosyltransferase. Sammenlignet med steady state nivåer av disse RNAs (venstre-mest punkt), er de i utgangspunktet svært rikelig i den nylig syntetisert bassenget. Nivåene gradvis avta som de er behandlet i mRNA (eller degradert), nærmer seg nivåer svært lik steady state nivåer med 5 min. standard feil av tre biologiske replikerer, hver analyseres i tre eksemplarer. (d) nsRNA og protein forringelse. Skjøting av ACT1 pre-mRNA transkripsjoner overvåkes av kvantitativ omvendt transkripsjon PCR som i panel (a) ved tømming av Prp16 protein ved hjelp av auxin degron systemet som beskrevet i figur 2. Prp16 protein nivåene er også vist i grafen plottet mot den andre Y-aksen som prosentandel av nivåer før auxin tømming. Prp16 er en viktig del av spliceosome, spesielt viktig for det andre trinnet av skjøting vist i panel (a), hvoretter uforståelige er degradert. Når dette trinnet blir begrensende uforståelige akkumuleres i utgangspunktet. På senere tidspunkt poeng skjøting svikter helt, uforståelige er ikke lenger produseres og pre-mRNA nivåer stige. Feil stolpene er standard feil på tre biologiske replikeres, hver analyseres i tre eksemplarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: grafisk sammendrag av protokoll seksjonene 1 til 3. Cellene er thiolated med 4tU og lov til å vokse til å innlemme den modifiserte nukleotid inn i RNA. En thiolated S. pombe Spike kan legges til for å tillate normalisering på tvers av tids punkter og eksperimenter. Pulsen på 4tU kan bli jaget ved hjelp av un-thiolated uridindifosfatglukuronosyltransferase. Merking kan enten utføres kontinuerlig fra 4tU tillegg eller fra en endring til vekstforhold, kulturen splittet og 4tU lagt til kulturer i økende tider fra vekst tilstand endres, men hver merking bare for en kort tid. Cellene er samlet, og RNA forberedt fra cellene, fortrinnsvis ved hjelp av en homogenisator og fenol-baserte metoder. RNA-en er biotinylated og deretter biotinylated RNA-en renset fra en biotin med en størrelses ekskluderings søyle. NsRNA er nå klar for rensing med streptavidin perler (seksjon 4, figur 5). Tall i rødt tilsvarer trinn numrene i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: grafisk sammendrag av protokoll delen 4. Etter på fra avsnittene 1 til 3 (Figur 4), blokkeres de streptavidin perlene, og biotinylated RNA-prøven legges til de forberedte perlene. Biotinylated RNA binder seg til de streptavidin perlene og den un-biotinylated RNA-en fjernes og vaskes. Biotinylated RNA er eluert fra perlene ved hjelp av βME og igangsatte klar for videre forskning. Tall i rødt tilsvarer trinn numrene i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: forbedring av nsRNA utvinning fra gjærceller med og uten ytterligere kopier av importøren på 1 og 3 minutter med alkyltiokarbamid. Merk at Fui1 er gjær egen promoter uttrykt fra en 2 μm plasmider. Den genomisk kopi av dette genet er til stede i begge disse stammene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: animert versjon av β-EST Aid 4U β-EST Aid 4U grafisk protokoll. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1:4tU_experiment_template. xltx. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Plasmider navn Importør/permease Markør Kommentar
p4Fui S. cerevisiae Fui1 URA3 Fui1 importerer Uracil og Uridindifosfatglukuronosyltransferase, noe som gjør den ideell for puls/jage eksperimenter.
pAT2 S. cerevisiae Fui1 LEU2
p4Fui-ΔPEST S. cerevisiae Fui1 URA3 PEST-motivet til Fui1 har blitt deaktivert, slik at permease ikke forringes når det er tilstrekkelig intracellulære uracil for cellens behov. Fungerer godt i merking eksperimenter og forbedrer puls/jage ytelse.
p4Fur S. cerevisiae Fur4 URA3 Uracil permease
YEpEBI311 H. sapiens ENT1 LEU2 Miller et al.11. Inneholder også en HSV tymidin kinase gen.
(equilibrative nukleosid transporter)
Alle plasmider er 2 μm-baserte. Alle P4 plasmider og pAT er basert på pRS16 serien av plasmider. FUI1 og FUR4 er uttrykt fra sine egne, endogene arrangører.

Tabell 1: plasmider brukt med denne protokollen.

Discussion

Denne artikkelen presenterer en protokoll for ekstremt rask og spesifikk 4tU merking, for gjenvinning av begynnende, nylig syntetisert RNA fra S. cerevisiae etter så lite som 15 S for merking, med svært lav forurensning av umerkede RNA.

Brukeren bør alltid sørge for å opprettholde integriteten til RNA-en ved bruk av kalde temperaturer og DEPC-behandlede reagenser. Streptavidin perle rensing er generelt pålitelig; perle bufferen er imidlertid vanskelig å håndtere; Det må gjøres fersk, med sine komponenter lagt i riktig rekkefølge, og ikke kjølt eller autoklaveres. Vanlige svakheter omfatter RNA-ufullstendig som oppløses etter nedbørs trinnene, og det blir heller ikke biotinylated eller på annen måte tapt under behandlingstrinnene. Det er omfattende hjelp til feilsøking i Tilleggsmaterialet.

Det er noen begrensninger å være klar over i ers4tU. En allerede nevnt er at 4tU bremser veksten av gjær (figur 1a). Bortsett fra endogenously thiolated RNAs9, kan bare RNAs som har blitt skrevet ut i løpet av merkings perioden, renses ved denne metoden. Polymerases stanset på gener gjennom thiolation tiden vil ikke produsere thiolated transkripsjoner som kan renses, selv om transkripsjoner som er delvis merket på grunn av Polymerases inn eller forlate en pausetilstand under thiolation kan gjenopprettes. Stammer som transkribere dårlig, enten på grunn av mutasjon eller vekstforhold, produsere lite nsRNA, selv om teknikkene som brukes her vil likevel forbedre utvinningen av nsRNA i forhold til andre metoder. Lengre tider og økt kultur volumer kan være nødvendig i disse stammene og forhold. Merk at uracil er en god kilde til nitrogen og så denne metoden bør være trialed før de brukes for studier som involverer nitrogen sult.

Den ers4tU protokollen er spesielt nyttig for analyse av kortvarig RNAs, hvorav mange er så raskt degradert at de ikke kan identifiseres uten ødeleggende den fornedrelse maskineri. Eksempler er kryptiske ustabile transkripsjoner (CUTs)4, og korte transkripsjoner produsert av tidlig avslutning eller promoter proksimale pause18 og antisens transkripsjon "oppstrøms" fra en promoter (ber)19. De mellom produkter produsert under prosessering av stabile RNA arter er også forbigående, men kan bli beriket ved hjelp av ers4tU transkripsjon4. Ers4tU-protokollen er derfor eksepsjonell i å tillate svært forbigående RNA-arter å bli analysert og tatt under nær fysiologiske forhold, som er en stor fordel i forhold til andre metoder. Denne teknikken har blitt brukt til å studere transkripsjon og nedstrøms RNA prosessering Kinetics i RNA polymerase mutanter som forlenge raskere eller tregere enn normalt20.

Thiolation er likeledes forenlig med RNA-SEQ og SLAM-SEQ21, tillater alle RNA produsert innen en meget kort tid vindu å bli kjennetegnet inne utsøkt detaljen.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Wellcome finansiering til JB [104648]. Arbeid i Wellcome senter for Cell Biology er støttet av Wellcome kjerne finansiering [092076]. Forfatterne erkjenner medlemmer av laboratoriet for deres hjelp: Bella sentimental, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias og shiney George. Forfatterne vil også gjerne takke Patrick Cramer for plasmider YEpEBI31111.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol (βME) Sigma-Aldrich M3148 CAUTION toxic. Stock solutions are aproximatly 14 M, make at 1/20 dilution for use
Chloroform Sigma-Aldrich 25668 CAUTION toxic
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 add 1/1000 volume to a solution, leave at room temperature for 24 h, then autoclave
DMF (N,N-dimethylformamide)  Sigma-Aldrich 227056 CAUTION toxic
EDTA Sigma-Aldrich 3609 Make 0.5 M and pH to 8.0 with sodium hydroxide
Ethanol Sigma-Aldrich 29221
EZ-link HPDP Biotin Thermo scientific 21341 Store protected from light. Disolve all the vial contents in 22.7 mL DMF (to make a 4 mM stock solution). Store away from water, in the dark & at -20 °C. Check the solution before using, as some batches of HPDP precipitate in storage; heat at 42 °C to resuspend.
Glucose Fisher Scientific  G/0500/60
Glycogen [20 mg/mL] Sigma-Aldrich 10901393001 Store at -20 °C
Immobilised TCEP Disulfide Reducing Gel Thermo Scientific 77712 Optional
LiCl Sigma-Aldrich 793620 10 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the LiCl crystals to the water slowly.
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich 63033 1 M solution. CAUTION: this gets very hot as is dissolves and can even boil at greater than 100 oC, add the MgCl2 crystals to the water slowly.
Methanol Fisher Scientific M/4000/PC17 CAUTION Toxic and flammable
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S3139 Make 1 M solutions of each and mix in equal amount to obtain a solution of the appropriate pH
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264
NaCl Sigma-Aldrich S9888-M 5 M solution
Phenol, low pH.   Sigma-Aldrich P4682 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Phenol Chloroform 5:1 (125:24:1) low pH.  Sigma-Aldrich P1944 Store in the dark at 4 °C. CAUTION toxic
Pierce Spin Columns Thermo Scientific 69702 Optional
SCSM single drop-out –ura Formedium  DSCS101
Sodium Acetate Sigma-Aldrich 32318-M Make a 3 M solution and pH to 5.3 with acetic acid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429 CAUTION corrosive
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Sigma-Aldrich 436143 CAUTION irritant, do not inhale
Streptavidin Magnetic beads NEB 1420S Store at 4°C 
SUPERase-In, RNase inhibitor Life technologies  AM2696 Store at -20°C
Thiolated Schizosaccharomyces pombe for spike See section 1.7 of the protocol
4-thiouracil (4tU)  ACROS ORGANICS 359930010 Store in the dark. Make 100 mM Stock in 1M NaOH, store solutions at -20°C. 
Tris base Sigma-Aldrich 93362 1 M solutions at various pH
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001 5mg/ml, store at -20°C
Uridine Sigma-Aldrich U3750 Make 1 M solution in H2O. Split into 2 mL aliquots and store at -20 C.
Yeast nitrogen base without amino acids  with amonium sulphate Formedium CYN0410
Zeba Columns 0.5ml Thermo Scientific 89882 Store at 4 °C 
Zirconia beads Thistle Scientific 110791052
Equipment and Consumables
Beadbeater Biospec 112011EUR Other homogenisers can be used; the correct conditions for each homogeniser and strain must be established.
Bioanalyser (Agilent) or similar to assess RNA quality. If this is not important a spectrophotometer is useful to quantify the RNA.
Centrifuge: capable of spinning cultures at 4 °C and at least 3000 g. Pre-chill if possible.
Centrifuge: capable of spinning up to 2 mL tubes at variable speeds upto 13,000 g and down to 1000 g 
Magnetic rack for separating the beads from the sample. The one used in the paper is 3D printed, available from Thingiverse (thing:3562952). Comercially available racks exist 
PCR machine with a heated lid that will allow incubation in the dark.
Rotating wheel to rotate 1.5 mL tubes end over end 
Shaking heating block (such as Eppendorf Thermomixer) is recomended 
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 0.5mL Eppendorf H179467N
Tubes, centrifuge, Low retention, RNase free 1.5mL Ambion AM12350
Tubes, centrifuge, 50 mL  Sarstedt 62.547.004 Other centrifuge tubes are not gas proof allowing CO2 to disolve in the methanol, this comes out of solution vigorously on adding warm culture, leading to sample loss
Tubes, centrifuge, 15 mL  Sarstedt 62.554.001
Tubes, 2 mL, screw cap Greiner 723361
Tubes 0.2 mL strip of 8 with integral lids Brand 781332

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10, (1), e1513 (2018).
  2. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).
  3. Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. Journal of Visualized Experiments. (140), e57982 (2018).
  4. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  5. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).
  6. Mendoza-Ochoa, G. I., et al. A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast. Yeast (Chichester England). 36, (1), 75-81 (2018).
  7. Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  8. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  9. Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression. Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).
  10. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).
  13. Rädle, B., et al. Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  14. Herzog, V. A., et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).
  15. Ohrt, T., et al. Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system. RNA. 19, 902-915 (2013).
  16. Alexander, R. D., et al. RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 16, 2570-2580 (2010).
  17. Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast. RNA. 23, 601-610 (2017).
  18. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).
  19. Preker, P., et al. RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters. Science. 322, 1851-1854 (2008).
  20. Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast. Genome Research. 28, 203-213 (2018).
  21. Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding. Nature Methods. 15, 221-225 (2018).
Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).More

Barrass, J. D., Beggs, J. D. Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU). J. Vis. Exp. (150), e59952, doi:10.3791/59952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter