Summary
يصف هذا البروتوكول العديد من الإجراءات لإعداد عينات الأنسجة المجمدة عالية الجودة في وقت التشريح لاستخدامها في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي: 1) الأنسجة المفرومة، 2) الخلايا الظهارية الكشط من الجهاز الهضمي، و 3) الأنسجة المكعبة عينات، مما يتطلب التجانس باستخدام جهاز تصغير الأنسجة.
Abstract
يكتسب فحص المذنب شعبية كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا والأنسجة المستزرعة ، خاصة بعد التعرض للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى. وقد كان الدافع وراء استخدام فحص المذنبفي الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية في القوارض هو اعتماد مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي في عام 2014. عادة ما يتم إعداد شرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة في وقت النُقال. ومع ذلك ، يمكن تجميد عينات الأنسجة تجنب التحديات اللوجستية المرتبطة بالتحضير المتزامن للشرائح من أعضاء متعددة لكل الحيوان ومن العديد من الحيوانات في كل دراسة. كما يتيح التجميد عينات الشحن من مرفق التعرض إلى مختبر مختلف للتحليل، ويسهل تخزين الأنسجة المجمدة تأجيل اتخاذ قرار بتوليد بيانات تلف الحمض النووي لجهاز معين. إن فحص المذنب القلوي مفيد للكشف عن الحمض النووي المرتبط بالتعرض، فواصل مزدوجة وأحادية، وآفات قلوية-لابيلي، وفواصل حبلا مرتبطة بإصلاح الختان غير الكامل للحمض النووي. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج تلف الحمض النووي أيضًا عن القص الميكانيكي أو إجراءات معالجة العينات غير السليمة ، مما يربك نتائج الفحص. وقد يكون من الصعب التحكم في إمكانية استنساخ عينات الأنسجة أثناء النُقات ومعالجتها بسبب تقلب موظفي المختبرات ذوي المستويات المختلفة من الخبرة في حصاد الأنسجة الخاصة بإمكانية فحص المذنب. وتعزيز الاتساق من خلال التدريب على تجديد المعلومات أو نشر وحدات متنقلة مزودة بموظفين من ذوي الخبرة في المختبرات أمر مكلف وقد لا يكون ممكنا دائما. لتحسين توليد متسقة من عينات ذات جودة عالية لتحليل المقنب، تم تقييم طريقة لتجانس مكعبات فلاش المجمدة من الأنسجة باستخدام جهاز mincing الأنسجة مخصصة. عينات أعدت لفحص المذنب من قبل هذه الطريقة مقارنة بشكل إيجابي في الجودة لعينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing أثناء النُقات. وعلاوة على ذلك، تم قياس انخفاض الضرر الحمض النووي الأساسي في الخلايا من مكعبات المجمدة من الأنسجة بعد التخزين لفترات طويلة.
Introduction
يستخدم فحص المذنب بشكل متزايد كوسيلة لتقييم تلف الحمض النووي في الخلايا المستزرعة والأنسجة المعرضة للمواد الكيميائية أو الضغوطات البيئية الأخرى1. يمكن للفحص الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج وأحادية، والآفات القلوية والآفية، وفواصل حبلا واحدة المرتبطة بإصلاح الحمض النووي غير مكتملة. يوصي المجلس الدولي لتنسيق المتطلبات التقنية للمستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) بالمبادئ التوجيهية للاختبار الصيدلاني بفاصل خيط الحمض النووي مثل فحص المذنب كاختبار ثان ٍ لتكملة قياس النواة المجهرية لمادة الكريات والقوارض لتقييم السمية الجينية للقدرة العضوية العضوية العضوية الحمراء وكاختبار متابعة لتقييم طريقة العمل في الأعضاء المستهدفة لتحريض الورم2. توصي الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA) بالفحص في حالة التسمم على المذنب كاختبار متابعة مناسب للتحقيق في مدى أهمية النتيجة الإيجابية في اختبار السمية الجينية في المختبر3. وفي عام 2014، تمت الموافقة على مبدأ توجيهي لاختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي فيما يتعلق بفحص المذنبات القوارض، مما زاد من مقبولية القول لاستخدامه في الاختبارات التنظيمية لإمكانات السمية الجينية. ويستند هذا الفحص على الفصل الكهربائي من حلقات الحمض النووي استرخاء والشظايا التي تهاجر من الخلايا المنتحلة. في الأساس ، يتم تضمين الخلايا المفردة في agarose التي تم طبقات على شرائح المجهر. ثم يتم غمر الشرائح في المخزن المؤقت حل السليس تليها القلوية (درجة الحموضة > 13) الحل، والذي يسمح للحمض النووي ملفوف بإحكام للاسترخاء والاسترخاء. ثم توضع الشرائح في حقل كهربائي، مما يحفز هجرة الحمض النووي المشحون سلبا نحو الأنود، مما يخلق صورا تشبه المذنبات؛ المقدار النسبي للحمض النووي في ذيل المذنب مقارنة مع رأس المذنب يتناسب بشكل مباشر مع كمية تلف الحمض النووي؛ عادة ما يتم قياس محتوى الحمض النووي في الذيل باستخدام برامج التصوير الرقمي.
نظرًا لأن مقاز المذنب يكشف الحمض النووي المجزأ ، فإن التحديد الكمي الدقيق لتلف الحمض النووي الناجم عن التعرض يمكن أن يُمكن أن يُربك بسبب تجزؤ الكروماتين المرتبط بالنخر أو الخلايا المبرمجة الناتجة عن السمية أو الإجهاد الناجم عن العلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي نتيجة للقص الميكانيكي أو معالجة العينة غير السليمة4. وقد أظهرت أهمية الحفاظ على الأنسجة المحصودة المبردة قبل إعداد الشريحة لتقليل مستوى خط الأساس لتلف الحمض النووي في السابق5,6. العديد من المختبرات إعداد الشرائح فحص المذنب من الأنسجة الطازجة; ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا تحديًا لوجستيًا عند إعداد الشرائح من أنواع الأنسجة المتعددة لكل الحيوان في دراسة مع عدد كبير من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا يمثل مشكلة عندما يتم إعداد وتحليل الشرائح في مختبر بعيد، مما يستلزم شحن العينات. على سبيل المثال، يتضمن البرنامج الوطني الأمريكي لعلم السموم فحص المذنب كعنصر في برنامج اختبار السموم الوراثية (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ويدمج في بعض الأحيان الفحص في دراسات سمية الجرعة المتكررة لمدة 28 أو 90 يومًا؛ وهذا يتطلب جمع الأنسجة من قبل المختبر في الحياة ونقل العينات إلى مختبر آخر للتحليل. لتحقيق ذلك ، يتم مفروم قطع الأنسجة ، ويتم كشط / أو الخلايا الظهارية في الجهاز الهضمي ويتم تجميد التعليق الخلوي وتخزينها في ثلاجة للشحن والتخزين اللاحق من قبل المختبر المتلقي حتى التحليل7. التعامل السليم مع العينات أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الجودة باستخدام الأنسجة المجمدة. ومع ذلك ، فإن التلاعب القابل للتكرار لعينات الأنسجة أثناء النُسج الذي يقوم به أفراد دائمي التغير يصعب السيطرة عليه ، خاصة في المختبرات في الحياة التي لا تحصد الأنسجة بشكل روتيني لفحص المذنب. وغالبا ً ما يكون التدريب المنعش لموظفي التشريح أو استخدام وحدة متنقلة يعمل بها موظفون مختبرون متمرسون لجمع عينات من الأنسجة الطازجة أو المجمدة مكلفاً للغاية، أو غير ممكن، أو مجرد التقليل من قيمته.
لضمان توليد متسقة على نحو أفضل من عينات الأنسجة عالية الجودة لنقلها إلى موقع بعيد لتحليل فحص المذنب ، تم استكشاف فائدة الطريقة المنشورة6 لحفظ الأنسجة من مكعبات الأنسجة المجمدة الفلاشية. في هذه الطريقة، يتم تحميل مكعبات المجمدة من الأنسجة في جهاز mincing الأنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ(الشكل 1)التي يتم وضعها في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عازلة الباردة. ثم يتم دفع مكعب الأنسجة من خلال شبكة قياس صغيرة في نهاية الجهاز. إجبار تعليق الأنسجة مرارا وتكرارا من خلال منخل شبكة في كلا الاتجاهين عدة مرات يؤدي إلى تعليق خلية واحدة موحدة نسبيا. عينات أعدت من قبل هذه الطريقة مقارنة إيجابية في الجودة لكل من عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة التي أعدتها mincing. كفائدة إضافية ، على عكس العينات المفرومة ، يمكن تخزين مكعبات الأنسجة المجمدة لفترات طويلة من الزمن ولا تزال تحقق نتائج عالية الجودة في فحص المذنب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم حصاد الأنسجة أثناء إجراء الدراسات التي أجريت في المرافق المعتمدة من AAALAC في مختبرات عقد NTP وفقًا للوائح الممارسة المختبرية الجيدة (21 CFR الجزء 58) وبروتوكولات الاستخدام الحيواني المعتمدة من قبل الحيوان المؤسسي لجنة الرعاية والاستخدام (IACUC) في كل مختبر.
1. حصاد الأنسجة وتجهيزها
ملاحظة: من المفيد إعداد أنابيب عينة مكررة (على سبيل المثال، الكبد) أو نقل ما يقرب من نصف العينة إلى أنبوب تخزين آخر (على سبيل المثال، الاثني عشر والمعدة) لتمكين إعادة التحليل، إذا لزم الأمر. لتقليل التباين المحتمل بين العينة والعينات لأنسجة الأمعاء ، يوصى بتوخي الحذر لأخذ عينات من نفس المنطقة من الأنسجة بالنسبة للمعدة لكل الحيوان ، وتقسيم عينة لتوليد عينات مكررة. يوصى باستخدام ملقط بلاستيكية لنقل الأنسجة اللزجة مثل الدماغ. كخيار، يمكن تصفية مستحضرات الأنسجة المفرومة أو الكشطأو المتجانسة لتحقيق تعليق خلية واحدة متجانسة باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر متصلة بأنبوب مخروطي.
- إزالة أي الأنسجة المتصلة المرفقة، والأجهزة، والحطام من الجهاز (ق) من الفائدة. مباشرة بعد إزالة, حفيف الجهاز بقوة في قارب وزن متوسط الحجم يحتوي على ~ 7 مل من الباردة الطازجة حل mincing (ملغ++, Ca++ والفينول الأحمر خالية من حل الملح المتوازن هانك, 10% v/ v DMSO, و 20 mM EDTA pH 7.5) لإزالة الدم المتبقية والحطام.
- نقل كل عضو إلى آخر قارب وزن نظيفة تحتوي على ما يكفي (~ 7 مل) محلول الممسحة الباردة للحفاظ على الأنسجة المغمورة، على الجليد، حتى مزيد من المعالجة.
- قم بإزالة مقطع من كل عضو مهم ووضعه في كاسيت تضمين. إصلاح في 10٪ محايدة المؤقتة formalin، تقليم، والبارافين تضمين وفقا للإجراءات القياسية للمختبر لتقييم ممكن في المستقبل علم الأمراض الهستوم.
- للكبد، وقطع مقطع طولي 5 مم من الفص الأيسر وحفيف بلطف في ~ 7 مل من محلول المقلب الباردة. ضع شريط الأنسجة في قارب وزن متوسط الحجم نظيف يحتوي على ~ 7 مل من محلول المينغ البارد والحفاظ على الجليد حتى يصبح جاهزًا لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11).
- لالاثني عشر، وقطع جزء 10 ملم من الاثني عشر مقربة من المعدة. باستخدام إبرة 21-25 G, تدفق لإزالة الحطام والبكتيريا.
- إدراج إبرة في نهاية واحدة من الاثني عشر وتدفق مع 1 مل من محلول المقلب الباردة.
- تدفق الاتجاه الآخر عن طريق التقليب الاثني عشر أكثر وتكرار مع آخر 1 مل من محلول mincing. تخلص من الإبرة.
- شريحة الاثني عشر مفتوحة وشطف في ~ 7 مل من محلول mincing قبل وضعه في قارب وزن متوسط الحجم يحتوي على ~ 7 مل من محلول mincing نظيفة؛ الحفاظ على الجليد حتى تكون جاهزة لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11).
- بالنسبة للدماغ، قد يكون من المفيد تقسيم الدماغ أولاً إلى نصفي نصفي نصفي. يمكن حفظ نصف الكرة الأرضية واحد لاحتمال علم الأمراض الهستولوجية (انظر الخطوة 1.2).
- تشريح منطقة الدماغ (المناطق) من الفائدة وحفيف بلطف في ~ 7 مل من محلول المقلب الباردة.
- نقل الأنسجة (الأنسجة) إلى قارب وزن متوسط الحجم نظيف يحتوي على ~ 7 مل من محلول المينغ البارد والحفاظ على الجليد حتى تصبح جاهزة لمزيد من المعالجة (الخطوة 1.8 أو 1.11؛ لاحظ أن المناطق الصغيرة مثل المخيخ وقرن آمون قد لا تتطلب أي تشذيب آخر).
- للمعدة
- إزالة وتجاهل المعدة. قطع فتح المعدة غدية وغسل خالية من الطعام باستخدام ~ 7 مل من عازلة الموين الباردة في قارب وزن متوسط الحجم.
- إزالة شريط 5 مم من المعدة الغدية القريبة من الاثني عشر لتثبيت لتقييم ممكن علم الأمراض الهسطولوجية (انظر الخطوة 1.2).
- ضع المعدة المتبقية في ~ 7 مل من عازل المينغ البارد ة في قارب وزن متوسط الحجم واحتضان على الجليد لمدة 15-30 دقيقة.
ملاحظة: وقد لا تكون خطوة الحضانة هذه ضرورية؛ بل قد تكون ضرورية. تم تضمين هذه الخطوة في بروتوكول التحقق من صحة JaCVAM، ولكن لم يرد ذكرها في المبدأ التوجيهي اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي8،9. - نقل المعدة إلى قطعة نظيفة من البارافين (أو طبق بيتري أو وزن القارب) وكشط بلطف ظهارة السطح مرتين أو أكثر باستخدام شفرة مشرط أو مكشطة polytetrafluoroethene (PTFE) لإزالة الحطام. التقاط الغشاء المخاطي في المعدة مع ملقط وشطف مع 1 مل من عازلة الموعن الباردة باستخدام pipet. نقل أنسجة المعدة إلى سطح نظيف أو طبق.
- كشط بعناية ظهارة المعدة 4-5 مرات (أكثر، إذا لزم الأمر) في محلول mincing (عادة 250 ميكرولتر / فأر أو 500-1000 μL/rat) مع الجزء الخلفي من شفرة مشرط أو مكشطة PTFE للإفراج عن الخلايا. اختياريا، شطف الأنسجة مع حجم متساو تقريبا من محلول المواخر لاسترداد المزيد من الخلايا. جمع محلول mincing الذي يحتوي على الخلايا المفرج عنها باستخدام أنبوب ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير على الجليد.
- لعينات الأنسجة mincing، وقطع قسم 3-4 ملم من أنسجة الكبد أو الدماغ أو ~ 5 ملم من الاثني عشر ونقل إلى 1.5 أو 2.0 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى التي تحتوي على 1 مل من محلول المقلب الباردة. المفروم بسرعة (≤ 30 ق) مع مقص mincing حتى تفرقنا ناعما، مع الحفاظ على العينة الباردة. يجب أن تبدو العينة غائمة قليلاً. ومع ذلك، فمن الشائع لبعض القطع أن تبقى من شأنها أن تستقر إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- لاستخدام الأنسجة الطازجة، والحفاظ على أنابيب تحتوي على الأنسجة المفرومة أو الخلايا الظهارية كشط على الجليد. استخدام الأنسجة لإعداد الشرائح المذنب في غضون ما يقرب من 1 ح من الحصاد (المبينة في القسم 2).
- لتجميد عينات الأنسجة، مباشرة بعد mincing أو جمع الخلايا الظهارية كشط
- تأمين غطاء أنبوب وإسقاط أنبوب في قارورة ديوار التي تحتوي على النيتروجين السائل; يمكن الحفاظ على أنابيب في النيتروجين السائل لمدة النُج (≤3 ساعة).
- استرداد أنابيب باستخدام مغرفة ومكان على الجليد الجاف لفرز. نقل الأنابيب إلى صندوق التجميد على الثلج الجاف وصندوق تخزين في ثلاجة -80 درجة مئوية.
- لإعداد مكعبات المجمدة من الأنسجة، وقطع عدة قطع صغيرة من الأنسجة (≤ 4 ملم في القطر و ~ 6 ملم في الطول؛ الشكل 1).
- إسقاط ها مباشرة مباشرة في قارب وزن متوسط الحجم أو وعاء مناسب آخر يحتوي على النيتروجين السائل.
- انتظر بضع ثوان حتى تتجمد القطع تمامًا ونقل مكعبات الأنسجة المجمدة الفردية إلى أنبوب ميكروطرد مركزي أو أنبوب التبريد المسمى الذي يتم صيانته على الثلج الجاف؛ لا تسمح القطع لتكتل معا خلال عملية التجميد.
- نقل الأنابيب إلى صندوق التجميد على الثلج الجاف وصندوق تخزين في ثلاجة -80 درجة مئوية.
2. إعداد الشرائح
-
للأنسجة المفرومة / الكشط
- الحفاظ على أنابيب تحتوي على الأنسجة الطازجة على الجليد الرطب.
- ضع أنابيب الأنسجة المجمدة في حمام مائي درجة حرارة الغرفة حتى يتم إذابة العينات تمامًا ، مع ضمان الحفاظ عليها باردة. نقل الأنابيب على الجليد على الفور.
- مباشرة قبل سحب الخلايا لنقلها إلى agarose (الخطوة 2.3), مزيج كل تعليق الخلية بلطف; للعينات غير المصفاة، والسماح لقطع كبيرة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على جميع الأنابيب على الجليد حتى تم إعداد الشرائح لجميع العينات.
-
للأنسجة المكعبة
- استرداد الأنابيب التي تحتوي على مكعبات الأنسجة من الفريزر 80 درجة مئوية والحفاظ على الجليد الجاف حتى إعداد الشريحة.
- Aliquot 1 مل من وسيط التاجر (0.14 M NaCl ، 1.47 mM KH2PO4، 2.7 mM KCl ، 8.1 mM Na2HPO4أو 10 mM NaEDTA ، pH 7.4) أو محلول mincing في أنبوب طرد مركزي صغير يحمل علامة 1.7 مل لكل عينة والحفاظ على الجليد.
- العمل بسرعة لتجنب ذوبان الأنسجة، ووضع مكعب من الأنسجة في نهاية مفتوحة من جهاز mincing الأنسجة درجة حرارة الغرفة(الشكل 1). ويمكن استخدام قطع الأنسجة متعددة; إذا لزم الأمر ، قد يتم قطع الأنسجة المجمدة أو تكسيرها إلى قطع أصغر باستخدام هاون والحشرات الباردة لتقليل حجم المكعب ليتناسب مع الجهاز.
- إدراج بسرعة المكبس حقنة مطابقة الحجم في الجهاز لدفع الأنسجة إلى نهاية شبكة التي ينبغي بعد ذلك أن توضع في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على محلول الموقن الباردة؛ تجنب إجبار السائل على تجاوز الأنبوب. تزج في نهاية شبكة الجهاز لحوالي 5-10 s في محلول المقلب الباردة للسماح للأنسجة بذوبان الجليد تماما.
- الاكتئاب تماما المكبس حتى ينظر إلى الخلايا البثق من خلال المسام شبكة. ثم سحب المكبس حتى ما يقرب من 2.5 سم واضغط لأسفل مرة أخرى تماما؛ كرر العملية عدة مرات حتى يصبح حل mincing عكرًا.
- إذا لزم الأمر ، قد تتركز العينة لزيادة كثافة الخلايا عن طريق الطرد المركزي المبرد لمدة 5 دقيقة عند 1100 دورة في الدقيقة وإزالة جزء من supernatant.
- كرر العملية لجميع العينات باستخدام جهاز مسح الأنسجة النظيفة لكل عينة.
- نقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب يحتوي على 450 ميكرولتر من 0.5٪ نقطة انصهار منخفضة agarose عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تعديل الأحجام، ولكن يجب أن يكون مقدار agarose ≤ 1٪. - إعداد وتسجيل الشرائح كما هو موضح سابقا10،11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الدراسة الأولى
تم حصاد الكبد من اثنين من أفواج من الفئران الذكور سبراغ داولي تدار زيت الذرة لمدة 4 أيام، متداخلة من قبل أسبوع واحد. تم إعداد الشرائح من الأنسجة المفرومة الطازجة ، والأنسجة المفرومة المجمدة ، والأنسجة المكعبة المجمدة التي تتم معالجتها في حل التاجر المتوسط أو mincing باستخدام جهاز mincing الأنسجة. تم تقييم الأنسجة المجمدة التي تم الحصول عليها من الحيوانات من الفوج الأول بعد تخزين الفريزر لمدة 3.5 أشهر. تم تقييم الأنسجة المجمدة التي تم الحصول عليها من الحيوانات من الفوج الثاني بعد تخزينها لمدة ~ 6 أشهر. لم يتم تضمين المذنبات التي تظهر مورفولوجيا "القنفذ" المميزة ، التي تشير إلى الخلايا التالفة بشدة (من مسببات غير مؤكدة التي قد تشمل السمية الخلايا أو الإجهاد الميكانيكي) ، في تسجيل النسبة المئوية للحمض النووي الذيل ؛ تم جدولة النسبة المئوية للقنافذ ، التي تم تحديدها فقط عند الفحص البصري للمورفولوجيا ، بشكل منفصل وفقا لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي TG 4899. يتم تلخيص متوسط النسبة المئوية لنتائج الحمض النووي الذيل للحيوانات في الأفواج (على أساس تسجيل 100 خلية / الحيوان) في الشكل 2A. جميع الطرق التي تستخدم الأنسجة المجمدة أنتجت قيم أعلى، وإن لم تكن دائما مختلفة إحصائيا، من الأنسجة الطازجة. بالنظر إلى أن الحد الأعلى الموصى به ل% الحمض النووي الذيل في كبد الفئران الطازجة هو 6٪9، فإن هذه النتائج تثبت أن أيًا من هذه الطرق يمكن أن تعمل بشكل جيد لتقييم الأنسجة المجمدة. يتم تنفيذ حل Mincing على الأقل على قدم المساواة وكذلك وسيط التاجر. وبما أن هذا الأخير هو أكثر استهلاكا للوقت لإعداد، تم اختيار حل mincing للدراسات اللاحقة. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تلف الأنسجة من الفوج الحيواني الثاني الذي تم تخزينه مجمدًا لمدة 6 أشهر قبل المعالجة مقارنة بالأنسجة من الفوج الأول الذي تمت معالجته بعد حوالي 3.5 شهر ًا من التخزين. عموما، فإن % القنافذ يوازي النسبة المئوية للحمض النووي الذيل على الرغم من أن القنافذ ٪ في الأنسجة المجمدة بالنسبة إلى الأنسجة الطازجة كانت أكثر متغيرة من النسبة المئوية للحمض النووي الذيل(الشكل 2B). توفر قيم نقاط النهاية هذه في الأنسجة الطازجة خط أساس يمكن على أساسه قياس تلف الحمض النووي الذي تم إدخاله من خلال طرق التجميد.
الدراسة الثانية
كانت الفئران الإناث B6C3F1 تدار المالحة العادية أو المغيرة، ميثيلي ميثانسولفونات (EMS) في 200 ملغ/ كغ/ يوم في المالحة العادية لمدة ثلاثة أيام. تم حصاد الأنسجة 3 ح بعد إعطاء الجرعة النهائية ومعالجتها طازجة في فحص المذنب. تم تجميد الأنسجة الإضافية بعد أن تم مفرومها في محلول mincing أو جمعها كمكعبات. وعالجت العينات المكعبة في وقت لاحق في محلول التمين باستخدام جهاز المنخل مباشرة قبل إعداد شرائح المذنب. على فرضية أن الخلايا التي تظهر مورفولوجيا القنفذ تمثل الخلايا في نهاية عالية من سلسلة من الضرر الحمض النووي الناجم عن المواد الكيميائية، تم تضمين القنافذ القابلة للتآكل من قبل برنامج التصوير في التهديف الآلي للحمض النووي الذيل٪ . يتم تلخيص نتائج الحمض النووي الذيل ٪ (على أساس تسجيل 150 خلية / الحيوان) في الشكل 3. أنسجة الكبد المجمدة كمكعبات ومعالجتها في وقت لاحق باستخدام جهاز mincing الأنسجة أسفرت عن نتائج مشابهة جدا لتلك التي تم الحصول عليها للأنسجة المفروم حديثا. كانت قيم الحمض النووي للذيل ٪ أعلى إلى حد ما للأنسجة المفرومة المجمدة ، ولكن قيم خط الأساس للأنسجة المفرومة المجمدة كانت أقل من 6 ٪ ، كما هو موصى به لكبد الفئران الطازجة في المبدأ التوجيهي لاختبار OECD لمزل المذنب9. تم قياس زيادة ذات دلالة إحصائية في تلف الحمض النووي الناجم عن EMS في عينات الأنسجة التي تم معالجتها بالطرق الثلاث جميعها.
الدراسة الثالثة
أجزاء من أنسجة الكبد التي تم جمعها من الفئران B6C3F1 الإناث في دراسة سمية 90 يوما من اختبار الكيميائية التي أجراها مختبر بعيد تم مفروم أو مقطعة إلى مكعبات، فلاش المجمدة، وشحنها بين عشية وضحاها على الجليد الجاف إلى هذا المختبر للتحليل. تم تحليل الأنسجة المفرومة بعد ~ 2 أشهر من تخزين الفريزر(الشكل 4). تم تضمين الخلايا التي ظهرت عند الفحص البصري لتكون القنافذ ولكن كانت قابلة للتآكل من قبل برنامج التصوير في قياسات الحمض النووي الذيل ٪ (150 خلية سجلت / الحيوان). تم جدولة عدد القنافذ (سواء كانت قابلة للتآكل أو غير قابلة للجراحة) التي تم تحديدها فقط عند الفحص البصري للمورفولوجيا في ما مجموعه 150 خلية / الحيوان بشكل منفصل لتوفير معلومات عن تردد هذه الخلايا التالفة للغاية. بشكل عام، كان تلف الحمض النووي (مقاسًا بـ % DNA الذيل) في الأنسجة المفرومة المجمدة مرتفعًا عبر جميع مجموعات الجرعات ذات التباين الكبير بين الحيوانات والحيوانات، بما في ذلك في مجموعة التحكم في السيارة. النسبة المئوية لنتائج الحمض النووي الذيل ترتبط مع % القنافذ (التي تم تحديدها فقط على أساس المورفولوجيا)، مما يشير إلى أن القنافذ ساهمت بشكل كبير في المستوى العالي من تلف الحمض النووي الذي لوحظ في هذه العينات. بناءً على مستوى الخلفية العالي لتلف الحمض النووي الذي تم قياسه في الأنسجة المفرومة ، تم تحليل الأنسجة المكعبة المجمدة لاحقًا بعد ~ 22 شهرًا من التخزين(الشكل 4). كان كل من تلف الحمض النووي و% القنافذ منخفضة جدًا في الأنسجة المكعبة المجمدة التي تم إعدادها بالتوازي مع عينات الأنسجة المفرومة. وهكذا، فإن الخلايا التالفة للغاية التي يعكسها مورفولوجيا القنفذ في عينات الأنسجة المفرومة لم تكن بوضوح نتيجة لعملية بيولوجية، ولكن من المرجح أن يتم إدخالها عن طريق التعطيل الميكانيكي و / أو احترار الأنسجة أثناء إجراء التمينق قبل تجميد الفلاش. واعتبرت هذه البيانات غير موثوقة. لحسن الحظ، قدم تحليل الأنسجة المكعبة المجمدة نتيجة واضحة، وهي عدم وجود استجابة تلف الحمض النووي في كبد الفئران الإناث بعد ثلاثة أشهر من التعرض للمادة الكيميائية الاختبارية. النتائج التي قدمتها هذه الدراسة الحالة مثال على المخاطر المرتبطة بإعداد الأنسجة المفرومة من قبل مختبر عديم الخبرة نسبيا وتبين فائدة طريقة الأنسجة المكعبة المجمدة للتحايل على هذه المشكلة.
الشكل 1: جهاز mincing الأنسجة والغاكر المستخدمة لإعداد تعليق خلية واحدة من الأنسجة المجمدة. وتفضل الدكتور غونار برونبورغ (نورجينتيك، أوسلو، النرويج) تقديم الجهاز النموذجي (القطر الداخلي 4.5 ملم، حجم الشبكة 0.4 مم). توفر اللوحة على اليمين مثالًا لمكعب من الأنسجة بحجم مناسب للاستخدام مع الجهاز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة تلف الحمض النووي المقيس بعينات كبد فئران مفرومة ومتجانسة طازجة ومجمدة. تم حصاد الكبد من اثنين من الأفواج المتداخلة (ن = 5 / مجموعة / مجموعة) من الفئران الذكور سبراغ داولي تدار زيت الذرة لمدة 4 أيام. تم إعداد الشرائح من الأنسجة المفرومة الطازجة ، والأنسجة المفرومة المجمدة ، والأنسجة المكعبة المجمدة التي تتم معالجتها في حل التاجر المتوسط أو mincing باستخدام جهاز mincing الأنسجة. تم تحليل الأنسجة المجمدة ~ 3.5 و 6 أشهر بعد تشريح للأفواج 1 و 2 ، على التوالي. لم يتم تضمين المذنبات المصنفة على أنها القنافذ على أساس المورفولوجيا في تسجيل النسبة المئوية للحمض النووي الذيل. (أ)الفوج يعني % نتائج الحمض النووي الذيل. (ب)الفوج يعني % نتائج القنفذ. تعكس أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. وأجريت تحليلات إحصائية لمقارنة الأنسجة المجمدة بالأنسجة الطازجة لكل مجموعة ولمقارنة النتائج بين الأفواج لكل طريقة لإعداد الأنسجة. * مختلفة إحصائيا(ع < 0.05) من الأنسجة المفرومة الطازجة داخل نفس الفوج باستخدام الطالب تي الاختبار؛ #statistically مختلفة(p < 0.05) من الأنسجة المفرومة الطازجة داخل نفس الفوج باستخدام اختبار مان ويتني للبيانات غير الموزعة عادة؛ ¥ الفرق الإحصائي(ع < 0.05) بين الأفواج باستخدام الطالب تي الاختبار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة تلف الحمض النووي الناجم عن EMS في أنسجة الكبد معالجتها بإجراءات مختلفة. متوسط النسبة المئوية للحمض النووي الذيل للفئران الإناث B6C3F1 تدار مركبة أو 200 ملغ / كغ / يوم EMS لمدة ثلاثة أيام (ن = 5 / المجموعة). تم حصاد الكبد 3 ح بعد إعطاء الجرعة النهائية ومعالجتها طازجة في ازهة المذنب. تم تجميد أنسجة الكبد إضافية فلاش بعد أن المفروم في محلول mincing أو جمعها كمكعبات; تم تجانس العينات المكعبة باستخدام جهاز mincing الأنسجة مباشرة قبل إعداد شرائح المذنب. ولضمان عدم استبعاد الخلايا في الطرف الأعلى من سلسلة الأضرار الناجمة عن الحمض النووي الناجم عن EMS من التحليل، تم تضمين المذنبات التي يبدو أنها تفي بالوصف المورفولوجي للقنافذ ولكن تبين أنها قابلة للتآكل بواسطة برنامج التصوير. تعكس أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم استخدام اختبار t للطالب لمقارنة كمية تلف الحمض النووي في الحيوانات المعرضة لEMS مع ذلك في الحيوانات مراقبة السيارة لكل طريقة إعداد العينة. *زيادة ذات دلالة إحصائية عند p < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 - ما إذا كانت هناك نسبة دراسة حالة تثبت فائدة طريقة المكعب المجمد ة والبيانات عالية الجودة التي تم الحصول عليها بعد التخزين لفترات طويلة. أجزاء من أنسجة الكبد التي تم جمعها من الفئران B6C3F1 الإناث تتعرض لتركيزات مختلفة من مادة كيميائية اختبار ~ 90 يوما (ن = 5 / مجموعة) تم مفروم أو مقطعة إلى مكعبات وفلاش المجمدة في المختبر في الحياة وشحنها في وقت لاحق إلى هذا المختبر للتحليل. تم تحليل الأنسجة المفرومة بعد ~ 2 أشهر من التخزين. بسبب سوء نوعية البيانات ، تم تحليل الأنسجة المكعبة المجمدة في وقت لاحق بعد ~ 22 شهرا من التخزين. ولضمان عدم استبعاد الخلايا في الطرف الأعلى من سلسلة تلف الحمض النووي الناجم عن المواد الكيميائية من التحليل، أُدرجت بيانات من خلايا قابلة للتآكل يبدو أنها قنافذ عند الفحص البصري. (أ)المجموعة تعني % نتائج الحمض النووي الذيل. بالمقارنة مع الأنسجة المفرومة ، تم الحصول على نتائج عالية الجودة من الأنسجة المكعبة المجمدة ، حتى بعد التخزين لفترات طويلة. (ب)المجموعة تعني % نتائج القنفذ. وتتضح تقنية التمين الضعيف من الضرر الواسع النطاق للحمض النووي غير البيولوجي الذي لوحظ كمذنبات قنفذ في عينات الأنسجة المفرومة. تعكس أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم استخدام ANOVA مع اختبار Dunnett لتقييم استجابة إيجابية للمادة الكيميائية الاختبار لكل طريقة إعداد العينة. لم تكن هناك مجموعات جرعات ذات دلالة إحصائية(p < 0.05) تم اكتشافها لأي من الأسلوبين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلف الحمض النووي الأساسي الذي يقاس بأنسجة دماغ الفئران المجمدة. يتم توفير نتائج مسح المذنب للأنسجة المفرومة أو المكعبة المجمدة التي تمثل عدة مناطق مختلفة من الدماغ من الفئران سبراغ داولي الذكور والإناث. وتم تجميع البيانات (التي تم توليدها عن طريق إدراج مذنبات القنفذ القابلة للقنفذ) على مدى عدة دراسات؛ ن = العدد الإجمالي لأنسجة الدماغ التي تم تقييمها لكل طريقة إعداد عينة. تعكس أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ثبت سابقا7،12،13، التعامل بشكل صحيح فلاش الأنسجة المفرومة المجمدة يوفر نتائج جيدة في فحص المذنب. في الواقع، خط الأساس % قيم الحمض النووي الذيل للفئران المفروم المجمدة والكبد الماوس أعدت في مختبرنا عادة ≤ 6٪، كما أوصى به المبدأ التوجيهي اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي9 لعينات الكبد الفئران المفروم حديثا. وقد تم الحصول على نتائج جيدة من قبل مختبرات متعددة باستخدام مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة التي تم مفرومة وتخزينها المجمدة; وبالمثل، تم استخدام الخلايا الظهارية المجمدة فلاش كشط من أجهزة في الجهاز الهضمي بنجاح في فحص المذنب7،12،13،14. يبدو أن الأنسجة المفرومة/المكشطة المجمدة مستقرة نسبيًا لعدة أشهر على الأقل. الطريقة المستخدمة التجانس من مكعبات فلاش المجمدة من الكبد باستخدام جهاز mincing الأنسجة التي وصفها أصلا جاكسون وآخرون6،تسفر عن نتائج في فحص المذنب على الأقل مماثلة وأفضل عادة (أي مستويات خط الأساس الأدنى من تلف الحمض النووي) من تلك التي تم الحصول عليها للكبد المفروم المجمدة. وتنطبق هذه المنهجية أيضا على أنواع الأنسجة الأخرى6؛ في تجربتنا، وقد تم الحصول على نتائج ممتازة بالمثل باستخدام الاثني عشر مكعبات المجمدة (البيانات غير مبين) وأنسجة الدماغ(الشكل 5). ومع ذلك، قد لا يكون جهاز المنخل قابلاً للتجانس بين جميع أنواع الأنسجة. في دراسة تجريبية، وجدنا أن أنسجة القلب العضلية لا يمكن بسهولة أن تضطر من خلال جهاز المنخل، مما أدى إلى ضعف الانتعاش الخلية. بدلا ً من ذلك ، يتم مصبغة الأنسجة فور ذوبان تعليق الخلايا مع قيم الحمض النووي الذيل الأساسية ٪ مماثلة لتلك المفرومة قبل تجميد الفلاش (البيانات غير مبينة). وتجدر الإشارة إلى أنه عندما يتم التعامل معها بشكل صحيح أثناء التشريح (أي الحفاظ على البرد والرطوبة؛ والفلاش المجمد كقطع فردية وغير مسموح له بذوبان الجليد جزئيًا)، فقد أسفرت الأنسجة المكعبة المجمدة عن تلف منخفض جدًا في الحمض النووي الأساسي حتى بعد ما يقرب من عامين من تخزين الفريزر(الشكل 4).
استخدام إما تعليق الخلايا المجمدة أو الأنسجة المكعبة في فحص المذنب يوفر العديد من المزايا على الأنسجة الطازجة بما في ذلك: 1) تسهيل جمع متزامن لأنواع متعددة من الأنسجة لتحليل المذنب؛ 1) تيسير جمع متزامن لأنواع متعددة من الأنسجة لتحليل المذنبات؛ 1) تيسير جمع الأنسجة المتعددة في وقت واحد لتحليل المذنبات؛ (2) تيسير جمع الأنسجة المتعددة في وقت واحد لتحليل المذنبات؛ (2) تيسير جمع أنواع متعددة من الأنسجة في وقت واحد لتحليل المذنبات. 2) تسهيل جمع الأنسجة في مختبر في الحياة ونقل العينات إلى مختبر مختلف للتحليل؛ 3) الراحة لتأجيل قرار لتحليل أنسجة معينة لعدة أشهر. على الرغم من أن تجانس الأنسجة المجمدة في وقت إعداد الشريحة هو أكثر تعقيدا من mincing الأنسجة الطازجة في وقت الحصاد، واستخدام الأنسجة مكعبات المجمدة يوفر العديد من الفوائد الإضافية التي تشمل: 1) لا شرط للموظفين المدربين في فحص المذنب (على سبيل المثال، وحدة متنقلة) أو الإمدادات المتخصصة / الكواشف في النض؛ 1) 2) فرصة أقل للأخطاء التقنية (على سبيل المثال، ارتفاع درجة حرارة العينة؛ عدم كفاية إطلاق الخلايا؛ حجم عينة الأنسجة دون المستوى الأمثل) أثناء النُس؛ 3) فرصة الحد الأدنى لإدخال تلف الحمض النووي الميكانيكية أثناء معالجة العينة (على سبيل المثال، القص mincing)؛ و 4) انخفاض الضرر الحمض النووي الأساسية، حتى بعد التخزين لفترات طويلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعهد الوطني للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية بموجب العقد HHSN273201300009C؛ ومع ذلك ، فإن البيانات أو الآراء أو الاستنتاجات الواردة فيها لا تمثل بالضرورة بيانات أو آراء أو استنتاجات NIEHS أو NIH أو حكومة الولايات المتحدة.
Acknowledgments
المؤلفون مدينون لينكولن مارتن وكيلي أوينز للمساعدة التقنية الخبراء إعداد وتسجيل الشرائح المذنب والدكتور كارول شوارتز لإجراء التحليلات الإحصائية. كما يعترف المؤلفون بالمساهمات الداعمة لأعضاء برامج علم السموم الوراثية، وعلم السموم الاستقصائي، والنُسب في ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. ICH. , (2012).
- EFSA. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead. Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).
- Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).
- Jackson, P., et al. Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay. Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).
- Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).
- Uno, Y., et al. JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).
- OECD. OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. 489, (2016).
- Hobbs, C. A., et al. Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats. Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).
- Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver. Journal of Visualized Experiments. (111), 53833 (2016).
- Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats. Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).
- Hobbs, C. A., et al. Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential. Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).
- Pant, K., et al. Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).
