Summary
Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.
Abstract
Der Kometentest gewinnt an Popularität als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben, insbesondere nach der Exposition gegenüber Chemikalien oder anderen Umweltstressoren. Die Verwendung des Kometentests bei regulatorischen Tests auf genotoxisches Potenzial bei Nagetieren wurde durch die Annahme einer Testrichtlinie der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) im Jahr 2014 vorangetrieben. Kometen-Assay-Dias werden in der Regel aus frischem Gewebe zum Zeitpunkt der Nekropsie zubereitet; Das Einfrieren von Gewebeproben kann jedoch logistische Herausforderungen vermeiden, die mit der gleichzeitigen Vorbereitung von Dias aus mehreren Organen pro Tier und von vielen Tieren pro Studie verbunden sind. Das Einfrieren ermöglicht auch den Versand von Proben aus der Expositionseinrichtung an ein anderes Labor zur Analyse, und die Lagerung von gefrorenem Gewebe erleichtert das Aufschieben einer Entscheidung über die Generierung von DNA-Schadensdaten für ein bestimmtes Organ. Der alkalische Kometentest ist nützlich, um expositionsbedingte DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und Strangbrüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Exzisionsreparatur zu erkennen. DNA-Schäden können jedoch auch durch mechanischescheren oder unsachgemäße Probenverarbeitungsverfahren entstehen, was die Ergebnisse des Tests verwirrt. Die Reproduzierbarkeit bei der Entnahme und Verarbeitung von Gewebeproben während der Nekropsien kann aufgrund schwankender Labormitarbeiter mit unterschiedlicher Erfahrung bei der Ernte von Geweben für den Kometentest schwer zu kontrollieren sein. Die Verbesserung der Konsistenz durch Auffrischungsschulungen oder den Einsatz mobiler Einheiten, die mit erfahrenem Laborpersonal besetzt sind, ist kostspielig und möglicherweise nicht immer machbar. Um die konsistente Erzeugung hochwertiger Proben für die Kometen-Assay-Analyse zu optimieren, wurde eine Methode zur Homogenisierung von flashgefrorenen Gewebewürfeln mit einem kundenspezifischen Gewebeminziergerät evaluiert. Proben, die nach dieser Methode für den Kometentest hergestellt wurden, verglichen in der Qualität günstig in der Qualität mit frischen und gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken während der Nekropsie hergestellt wurden. Darüber hinaus wurden niedrige Basis-DNA-Schäden in Zellen aus gefrorenen Gewebewürfeln nach längerer Lagerung gemessen.
Introduction
Der Kometentest wird zunehmend als Mittel zur Bewertung von DNA-Schäden in kultivierten Zellen und Geweben verwendet, die Chemikalien oder anderen Umweltstressoren ausgesetzt sind1. Der Test kann DNA-Doppel- und Einstrangbrüche, alkali-labile Läsionen und einsträngige Brüche im Zusammenhang mit unvollständiger DNA-Reparatur erkennen. Der International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) empfiehlt einen DNA-Strangbruchtest wie den Kometentest als zweiten Test zur Ergänzung des Nagetier-Erythrozyten-Mikrokern-Assays zur Beurteilung der In-vivo-Genotoxizität und als Folgetest zur Beurteilung der Wirkungsweise in Zielorganen der Tumorinduktion2. Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) empfiehlt den In-vivo-Kometentest als geeigneten Folgetest zur Untersuchung der Relevanz eines positiven Ergebnisses in einem In-vitro-Genotoxizitätstest3. Im Jahr 2014 wurde eine OECD-Testrichtlinie für den Nagetierkometentest genehmigt, wodurch die Akzeptanz des Assays für die Anwendung bei regulatorischen Tests des genotoxischen Potenzials erhöht wurde. Der Test basiert auf der elektrophoretischen Trennung von entspannten DNA-Schleifen und Fragmenten, die aus Nukleoiden von lysierten Zellen wandern. Grundsätzlich sind einzelne Zellen in Agarose eingebettet, die auf Mikroskopschlitten geschichtet wurde. Die Dias werden dann in den Lysepuffer eingetaucht, gefolgt von einer alkalischen (pH > 13) Lösung, die es der fest gewickelten Kern-DNA ermöglicht, sich zu entspannen und zu entspannen. Dias werden dann in ein elektrisches Feld gelegt, das die Migration negativ geladener DNA zur Anode stimuliert und Bilder erzeugt, die Kometen ähneln; die relative MENGE der DNA im Kometenschweif im Vergleich zum Kometenkopf ist direkt proportional zur Menge der DNA-Schäden; DER DNA-Gehalt im Schwanz wird in der Regel mit hilfe digitaler Bildgebungssoftware quantifiziert.
Da der Kometentest fragmentierte DNA erkennt, kann eine genaue Quantifizierung von expositionsinduzierten DNA-Schäden durch Chromatinfragmentierung im Zusammenhang mit Nekrose oder Apoptose infolge behandlungsinduzierter Zytotoxizität oder Stress verwirrt werden. Darüber hinaus kann eine DNA-Schädigung durch mechanisches Scheren oder unsachgemäße Probenbearbeitung auftreten4. Die Bedeutung der Aufrechterhaltung des vor der Folienvorbereitung gekühlten Erntegewebes zur Minimierung des Ausgangsniveaus der DNA-Schäden wurde bereits5,6gezeigt. Viele Laboratorien bereiten Kometenasssay-Dias aus frischem Gewebe vor; Dies kann jedoch logistisch eine Herausforderung darstellen, wenn diaginen von mehreren Gewebetypen pro Tier in einer Studie mit einer großen Anzahl von Tieren vorbereitet werden. Darüber hinaus stellt dies ein Problem dar, wenn die Vorbereitung und Analyse von Dias in einem entfernten Labor erfolgen soll, was den Versand von Proben erforderlich macht. Zum Beispiel umfasst das U.S. National Toxicology Program den Kometentest als Bestandteil seines genetischen toxikologischen Testprogramms (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) und nimmt den Assay manchmal in 28 oder 90-Tage-Studien zur Toxizität bei wiederholter Totdosis auf; dies erfordert die Entnahme von Gewebe durch das Labor im Leben und die Übertragung von Proben in ein anderes Labor zur Analyse. Um dies zu erreichen, werden Gewebeteile gehackt und/oder Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes abgekratzt und Zellsuspensionen werden eingefroren und in einem Gefrierschrank für die nachfolgende Verbringung und Lagerung durch das empfangende Labor bis zur Analyse7gelagert. Die ordnungsgemäße Handhabung von Proben ist entscheidend für die Beschaffung hochwertiger Daten mit gefrorenem Gewebe; Reproduzierbare Manipulation von Gewebeproben während Nekropsien, die von ständig wechselndem Personal durchgeführt werden, ist jedoch schwer zu kontrollieren, insbesondere in Labors, die nicht routinemäßig Gewebe für den Kometentest ernten. Die Auffrischung des Nekropsiepersonals oder die Nutzung einer mobilen Einheit, die von erfahrenem Laborpersonal besetzt ist, um frische oder gefrorene Gewebeproben zu sammeln, ist oft zu kostspielig, nicht durchführbar oder einfach unterbewertet.
Um eine konsistente Generierung hochwertiger Gewebeproben für die Übertragung an einen entfernten Ort für kometenassatoume Analysen zu gewährleisten, wurde der Nutzen einer veröffentlichten Methode6 der Gewebekonservierung aus eingefrorenen Flash-Gewebewürfeln untersucht. Bei dieser Methode werden gefrorene Gewebewürfel in eine Gewebeminkvorrichtung aus Edelstahl(Abbildung 1) geladen, die in ein Mikrozentrifugenrohr mit Kaltpuffer gelegt wird. Der Gewebewürfel wird dann durch ein kleines Messnetz am Ende des Geräts geschoben. Das wiederholte Zwingen der Gewebesuspension durch das Netzsieb in beide Richtungen führt zu einer relativ gleichmäßigen einzelzelligen Suspension. Proben, die mit dieser Methode hergestellt wurden, verglichen in der Qualität sowohl mit frischen als auch gefrorenen Gewebeproben, die durch Hacken hergestellt wurden. Als zusätzlichen Vorteil, im Gegensatz zu Hackfleischproben, Gewebewürfel können gefroren für längere Zeit gelagert werden und dennoch qualitativ hochwertige Ergebnisse in der Kometen-Assay liefern.
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Protocol
Gewebe wurden während der Durchführung von Studien in AAALAC-akkreditierten Einrichtungen in NTP-Vertragslaboratorien gemäß den Vorschriften für gute Laborpraxis (21 CFR Part 58) und den von der Institutionellen Tierhaltung genehmigten Tierverwendungsprotokollen geerntet. Care and Use Committee (IACUC) in jedem Labor.
1. Gewebeernte und -verarbeitung
HINWEIS: Es ist sinnvoll, doppelte Probenröhrchen (z. B. Leber) zuzubereiten oder etwa die Hälfte einer Probe in ein anderes Speicherröhrchen (z. B. Zwölffingerdarm, Magen) zu übertragen, um bei Bedarf eine erneute Analyse zu ermöglichen. Um die potenzielle Variabilität von Probe zu Probe für Gewebe des Darmtraktes zu minimieren, wird empfohlen, für jedes Tier die gleiche Geweberegion relativ zum Magen zu beproben und eine Probe zu teilen, um doppelte Proben zu erzeugen. Kunststoffzange werden für die Übertragung von klebrigen Geweben wie Gehirn empfohlen. Optional können gehackte, abgekratzte oder homogenisierte Gewebepräparate gefiltert werden, um homogene einzellige Suspensionen zu erzielen, indem ein 40 m großes Zellsieb verwendet wird, das an einem konischen Rohr befestigt ist.
- Entfernen Sie alle angeschlossenen Verbindungsgewebe, Organe und Schmutz von Organen von Interesse. Unmittelbar nach der Entfernung das Organ kräftig in einem mittelgroßen Wägeboot mit einer kalten, frisch zubereiteten Hacklösung (Mg++, Ca++ und phenolrot-frei Hankes Balanced Salt Solution, 10% v/v DMSO und 20 mM EDTA pH 7.5) kräftig schwenken, um Restblut und Schmutz zu entfernen.
- Übertragen Sie jedes Organ auf ein anderes sauberes Wägeboot, das eine ausreichende Kaltschnittlösung enthält, um das Gewebe bis zur Weiterenverarbeitung auf Eis unter Wasser zu halten.
- Entfernen Sie einen Abschnitt jedes organischen Interesses und legen Sie ihn in eine Einbettkassette. Fix in 10% neutral gepuffertes Formalin, Trimmund und Paraffin einbetten nach den Standardverfahren des Labors für eine mögliche zukünftige histopathologische Bewertung.
- Für die Leber einen 5 mm Längsschnitt des linken Lappens schneiden und vorsichtig in 7 ml Kaltschnittlösung schwenken. Den Gewebestreifen in ein sauberes mittelgroßes Wägeboot mit einer Kaltschnittlösung von 7 ml legen und auf Eis halten, bis er weiterverarbeitet werden kann (Schritt 1.8 oder 1.11).
- Für das Zwölffingerdarm einen 10 mm Anteil des Zwölffingerdarms proximal in den Magen schneiden. Mit einer 21–25 G Nadel, spülen, um Schmutz und Bakterien zu entfernen.
- Nadel in ein Ende des Zwölffingerdarms geben und mit 1 ml Kaltschnittlösung bündig einspülen.
- Spülen Sie die andere Richtung, indem Sie das Zwölffingerdarm umdrehen und sich mit weiteren 1 ml Hacklösung wiederholen. Entsorgen Sie die Nadel.
- Das Zwölffingerdarm aufschneiden und in einer Zerkleinerungslösung von 7 ml abspülen, bevor man es in ein mittelgroßes Wägeboot mit einer sauberen Hacklösung von 7 ml legt; bis zur weiterverarbeitung auf Eis bleiben (Schritt 1.8 oder 1.11).
- Für das Gehirn kann es nützlich sein, zuerst das Gehirn in zwei Hemisphären zu teilen; eine Hemisphäre kann für eine mögliche Histopathologie gespeichert werden (siehe Schritt 1.2).
- Sezieren Sie die Hirnregion(n) von Interesse und schwenken Sie sanft in 7 ml Kaltschnittlösung.
- Gewebe auf ein sauberes mittelgroßes Wägeboot mit einer Kaltschnittlösung von 7 ml übertragen und auf Eis halten, bis es weiterverarbeitet werden kann (Schritt 1.8 oder 1.11; beachten Sie, dass kleine Regionen wie Kleinhirn und Hippocampus keine weitere Beschneidung erfordern).
- Für den Magen
- Entfernen und entsorgen Sie den Vordermagen. Den Drüsenmagen aufschneiden und mit einem kalten Hackpuffer in einem mittelgroßen Wägeboot von Lebensmitteln frei waschen.
- Entfernen Sie einen 5 mm Streifen Drüsenmagen proximal zum Zwölffingerdarm zur Fixierung für eine mögliche histopathologische Bewertung (siehe Schritt 1.2).
- Den restlichen Magen in einen kalten Hackpuffer von 7 ml in ein mittelgroßes Wägeboot geben und 15–30 min auf Eis bebrüten.
HINWEIS: Dieser Inkubationsschritt ist möglicherweise nicht erforderlich. Dieser Schritt wurde in das JaCVAM-Validierungsprotokoll aufgenommen, wird aber in der OECD-Testrichtlinie8,9nicht erwähnt. - Übertragen Sie den Magen auf ein sauberes Stück Paraffin (oder Petrischale oder Wiegenboot) und kratzen Sie das Oberflächenepithel zwei oder mehr Mal mit einem Skalpellblatt oder einem Polytetrafluorethen (PTFE) Schaber vorsichtig, um Schmutz zu entfernen. Die Magenschleimhaut mit Zangen aufnehmen und mit 1 ml Kaltschnittpuffer mit einer Pipette abspülen. Übertragen Sie das Magengewebe auf eine saubere Oberfläche oder Schale.
- Das Magenepithel 4-5-mal (ggf. mehr) in Derinzlösung (typischerweise 250 l/Maus oder 500-1.000 l/Ratte) mit der Rückseite eines Skalpellmessers oder PTFE-Schabers vorsichtig mit der Rückseite eines Skalpellmessers oder PTFE-Schabers zerkleinern, um die Zellen freizusetzen. Optional spülen Sie Gewebe mit einem ungefähr gleichen Volumen von Hacklösung, um mehr Zellen zu erholen. Sammeln Sie die Hacklösung, die freigesetzte Zellen enthält, mit einer Pipette und übertragen Sie sie auf Eis in ein Mikrozentrifugenrohr.
- Zum Zerschneiden von Gewebeproben einen 3–4 mm Abschnitt des Leber- oder Hirngewebes oder 5 mm Zwölffingerdarm schneiden und in ein beschriftetes 1,5 oder 2,0 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml Kaltzerlegungslösung übertragen. Schnell Hackfleisch (ca. 30 s) mit Schneidschere, bis fein dispergiert, während die Probe kalt. Das Beispiel sollte leicht bewölkt aussehen; es ist jedoch üblich, dass einige Stücke bleiben, die sich an der Unterseite des Rohres absetzen.
- Um das Gewebe frisch zu verwenden, pflegen Sie Rohre mit Hackfleisch oder zerkratzten Epithelzellen auf Eis; verwenden Sie das Gewebe, um Kometenrutschen innerhalb von etwa 1 h der Ernte vorzubereiten (in Abschnitt 2 beschrieben).
- Zum Einfrieren der Gewebeproben, unmittelbar nach dem Hacken oder Sammeln von abgekratzten Epithelzellen
- Sichern Sie den Rohrdeckel und tropfen Sie Rohr in einem Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff; Rohre können für die Dauer der Nekropsie in flüssigem Stickstoff gehalten werden ( 3 h).
- Holen Sie Rohre mit einer Pfanne und legen Sie auf Trockeneis zu sortieren. Rohre auf Trockeneis und Lagerbox in einem Gefrierschrank von -80 °C in eine Gefrierbox überführen.
- Zur Herstellung von gefrorenen Gewebewürfeln mehrere kleine Gewebestücke (Durchmesser 4 mm und 6 mm Länge) schneiden; Abbildung 1).
- Legen Sie sie einzeln direkt in ein mittelgroßes Wägeboot oder ein anderes geeignetes Gefäß mit flüssigem Stickstoff.
- Warten Sie einige Sekunden, bis die Stücke vollständig einfrieren und übertragen Sie einzelne gefrorene Gewebewürfel in ein beschriftetes Mikrozentrifugenrohr oder Kryotube, das auf Trockeneis aufbewahrt wird; lassen Sie die Teile während des Gefriervorgangs nicht verklumpen.
- Rohre auf Trockeneis und Lagerbox in einem Gefrierschrank von -80 °C in eine Gefrierbox überführen.
2. Folienvorbereitung
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Für gehacktes/geschlresttes Gewebe
- Rohren mit frischem Gewebe auf nassem Eis pflegen.
- Legen Sie Rohre aus gefrorenem Gewebe in ein Raumtemperatur-Wasserbad, bis die Proben vollständig aufgetaut sind, während Sie sicherstellen, dass sie kalt gehalten werden. Übertragen Sie die Rohre sofort auf Eis.
- Unmittelbar vor dem Zurückziehen der Zellen für die Übertragung auf Agarose (Schritt 2.3), mischen Sie jede Zellsuspension sanft; bei nicht gefilterten Proben große Stücke an der Unterseite des Rohres absetzen lassen. Halten Sie alle Rohre auf Eis, bis die Dias für alle Proben vorbereitet wurden.
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Für würfelförmiges Gewebe
- Rohre mit Gewebewürfeln aus dem 80 °C-Gefrierschrank holen und auf Trockeneis bis zur Gleitvorbereitung pflegen.
- Aliquot 1 ml Handelsmedium (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) oder Mincing-Lösung in ein markiertes 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr für jede Probe und auf Eis wartend.
- Arbeiten Sie schnell, um das Auftauen des Gewebes zu vermeiden, legen Sie einen Würfel aus Gewebe in das offene Ende eines Raumtemperatur-Gewebezerschneidegeräts (Abbildung 1). Mehrere Gewebestücke können verwendet werden; bei Bedarf kann das gefrorene Gewebe mit einem kalten Mörtel und Stößel in kleinere Stücke geschnitten oder geknackt werden, um die Würfelgröße zu reduzieren, um in das Gerät zu passen.
- Legen Sie schnell einen größenangepassten Spritzenkolben in das Gerät ein, um das Gewebe an das Netzende zu schieben, das dann in das Mikrozentrifugenrohr mit Kaltzerkleinerungslösung gelegt werden sollte; vermeiden Sie, dass die Flüssigkeit das Rohr überläuft. Tauchen Sie das Netzende des Geräts für ca. 5-10 s in die Kaltschnittlösung ein, damit das Gewebe vollständig auftauen kann.
- Drücken Sie den Kolben vollständig, bis Zellen durch die Netzporen extrudieren. Ziehen Sie dann den Kolben ca. 2,5 cm nach oben und drücken Sie wieder vollständig nach unten; wiederholen Sie den Vorgang mehrmals, bis die Hacklösung trüb wird.
- Bei Bedarf kann die Probe konzentriert werden, um die Zelldichte durch gekühlte Zentrifugation für 5 min bei 1100 U/min und Entfernung eines Teils des Überstandes zu erhöhen.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle Proben mit einem sauberen Gewebe-Mincing-Gerät für jede Probe.
- Übertragen Sie 50 l Zellsuspension in ein Rohr, das 450 l 0,5 % Niedrigschmelzpunkt-Agarose bei 37 °C enthält.
HINWEIS: Die Mengen können angepasst werden, aber die Menge an Agarose sollte 1 % betragen. - Vorbereiten und Bewerten von Folien wie zuvor beschrieben10,11.
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Representative Results
Studie 1
Leber wurde aus zwei Kohorten von männlichen Sprague Dawley Ratten geerntet, die 4 Tage lang Maisöl verabreichten, gestaffelt um eine Woche. Die Dias wurden aus frisch gehacktem Gewebe, gefrorenem Hackfleisch und gefrorenem Würfelgewebe hergestellt, das in Merchants Medium oder Der Hacklösung mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde. Gefrorenegewebe, die von Tieren aus der ersten Kohorte gewonnen wurden, wurden nach der Tiefkühllagerung für 3,5 Monate bewertet. Gefrorenegewebe, die von Tieren aus der zweiten Kohorte gewonnen wurden, wurden nach der Lagerung von 6 Monaten bewertet. Kometen, die die charakteristische "Igel"-Morphologie aufweisen, die auf stark geschädigte Zellen hindeuten (von unsicherer Ätiologie, die Zytotoxizität oder mechanische Belastung umfassen kann), wurden nicht in die Bewertung von % Schwanz-DNA einbezogen; der Prozentsatz der Igel, der ausschließlich bei der visuellen Kontrolle der Morphologie identifiziert wurde, wurde gemäß OECD TG 4899separat tabellarisch dargestellt. Die durchschnittlichen % Schwanz-DNA-Ergebnisse für die Tiere in den beiden Kohorten (basierend auf der Bewertung von 100 Zellen/Tier) sind in Abbildung 2Azusammengefasst. Alle Methoden, bei der gefrorenes Gewebe verwendet wurde, ergaben Werte, die höher, wenn auch nicht immer statistisch anders waren, als frisches Gewebe. Angesichts der Tatsache, dass die empfohlene Obergrenze für % schwanz-DNA in frischer Rattenleber 6%9beträgt, zeigen diese Ergebnisse, dass jede dieser Methoden gut für die Bewertung von gefrorenem Gewebe funktionieren kann. Mincing-Lösung mindestens ebenso gut wie Merchant Sermedium; Da letzteres zeitaufwändiger zu bereiten ist, wurde für nachfolgende Studien eine Hacklösung ausgewählt. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede bei den Schäden im Gewebe der zweiten Tierkohorte, die vor der Verarbeitung 6 Monate lang gefroren gelagert worden war, im Vergleich zu den Geweben aus der ersten Kohorte, die nach 3,5 Monaten Lagerung verarbeitet wurden. Insgesamt haben die % der Igel mit der % Schwanz-DNA gleichgerechnet, obwohl die % der Igel in den gefrorenen Geweben im Verhältnis zu frischem Gewebe variabler waren als für % der Schwanz-DNA (Abbildung 2B). Die Werte für diese Endpunkte im frischen Gewebe bilden eine Ausgangsbasis, anhand deren die durch die Gefriermethoden artefakt eingeführte DNA-Schädigung gemessen werden kann.
Studie 2
Weiblichen B6C3F1-Mäusen wurde drei Tage lang normaler Kochchen oder das Mutagene, Ethylmethansulfonat (EMS) bei 200 mg/kg/Tag in normaler Kochsaline verabreicht. Gewebe wurde 3 h nach der letzten Dosis Verabreichung geerntet und frisch im Kometentest verarbeitet. Zusätzliches Gewebe wurde eingefroren, nachdem es in Hacklösung gehackt oder als Würfel gesammelt wurde. Gewürfelte Proben wurden anschließend mit dem Siebgerät unmittelbar vor der Herstellung von Kometenrutschen in Hacklösung verarbeitet. Unter der Prämisse, dass Zellen, die die Igelmorphologie aufweisen, Zellen am hohen Ende des Kontinuums chemisch induzierter DNA-Schäden darstellen, wurden Igel, die durch die Bildgebungssoftware verserbar sind, in die automatisierte Bewertung von % Schwanz-DNA einbezogen. Die % der DNA-Ergebnisse (basierend auf der Bewertung von 150 Zellen/Tier) sind in Abbildung 3zusammengefasst. Lebergewebe, das als Würfel eingefroren und anschließend mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde, lieferte Ergebnisse, die denen für frisch gehacktes Gewebe sehr ähnlich waren. Die DNA-Werte des % waren für das gefrorene Hackfleisch etwas höher, aber die Ausgangswerte für das gefrorene Hackfleisch lagen unter 6 %, wie in der OECD-Testrichtlinie für den Kometentest9für frische Rattenleber empfohlen. In Gewebeproben, die mit allen drei Methoden verarbeitet wurden, wurde eine statistisch signifikante Zunahme der EMS-induzierten DNA-Schäden gemessen.
Studie 3
Teile des Lebergewebes, die von weiblichen B6C3F1-Mäusen in einer 90-tägigen Toxizitätsstudie einer Von einem entfernten Labor durchgeführten Testchemikalie gesammelt wurden, wurden gehackt oder in Würfel geschnitten, geblitzt und über Nacht auf Trockeneis zur Analyse in dieses Labor verschifft. Minced Tissue wurde nach 2 Monaten Tiefkühllagerung analysiert (Abbildung 4). Zellen, die bei der visuellen Untersuchung als Igel erschienen, aber durch die Bildgebungssoftware verschreibbar waren, wurden in die % Schwanz-DNA-Messungen einbezogen (150 Zellen bewertet/Tier). Die Anzahl der Igel (ob verschreibbar oder nicht versenkbar), die ausschließlich bei der visuellen Untersuchung der Morphologie in insgesamt 150 Zellen/Tier identifiziert wurden, wurde separat tabellarisch dargestellt, um Informationen über die Häufigkeit dieser stark geschädigten Zellen zu liefern. Insgesamt war die DNA-Schädigung (gemessen als % der Schwanz-DNA) in gefrorenem Hackfleisch in allen Dosisgruppen mit erheblicher Variabilität von Tieren bis Zusteiner, auch in der Fahrzeugkontrollgruppe, hoch. Die Ergebnisse der Schwanz-DNA % korrelierten mit % Igeln (die ausschließlich auf der Grundlage der Morphologie identifiziert wurden), was darauf hindeutet, dass Igel wesentlich zu dem hohen Grad an DNA-Schäden beitrugen, der in diesen Proben beobachtet wurde. Basierend auf dem hohen Hintergrundniveau der IM Hackfleisch gemessenen DNA-Schäden wurde gefrorenes Würfelgewebe nach 22 Monaten Lagerung analysiert (Abbildung 4). Sowohl DIE DNA-Schäden als auch % der Igel waren im blitzgefrorenen Würfelgewebe, das parallel zu den Hackfleischproben hergestellt worden war, sehr gering. So waren die stark geschädigten Zellen, die von der Igelmorphologie in den Hackfleischproben reflektiert wurden, eindeutig nicht das Ergebnis eines biologischen Prozesses, sondern wurden wahrscheinlich durch mechanische Störungen und/oder Gewebeerwärmung während des Hackvorgangs vor dem Blitzeinfrieren eingeführt; diese Daten wurden als unzuverlässig angesehen. Glücklicherweise lieferte die Analyse von gefrorenem Würfelgewebe ein klares Ergebnis, nämlich das Fehlen einer DNA-Schadensreaktion in der Leber weiblicher Mäuse nach drei Monaten Exposition gegenüber der Testchemikalie. Die Ergebnisse dieser Fallstudie veranschaulichen das Risiko, das mit der Herstellung von Hackfleisch durch ein relativ unerfahrenes Labor verbunden ist, und zeigen den Nutzen der Methode des gefrorenen Würfelgewebes, um dieses Problem zu umgehen.
Abbildung 1: Gewebeminkvorrichtung und Kolben zur Herstellung einer einzelzelligen Suspension aus gefrorenem Gewebe. Das Prototypgerät (4,5 mm Innendurchmesser, 0,4 mm Maschenöffnung) wurde freundlicherweise von Dr. Gunnar Brunborg (NorGenotech, Oslo, Norwegen) zur Verfügung gestellt. Das Panel auf der rechten Seite ist ein Beispiel für einen entsprechend großen Gewebewürfel für die Verwendung mit dem Gerät. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Vergleich der DNA-Schäden, die in frischen und gefrorenen gehackten und homogenisierten Mausleberproben gemessen werden. Die Leber wurde aus zwei gestaffelten Kohorten (n = 5/Gruppe/Kohorte) männlicher Sprague Dawley-Ratten geerntet, die 4 Tage lang Maisöl verabreichten. Die Dias wurden aus frisch gehacktem Gewebe, gefrorenem Hackfleisch und gefrorenem Würfelgewebe hergestellt, das in Merchants Medium oder Der Hacklösung mit dem Gewebezerkleinerungsgerät verarbeitet wurde. Gefrorenes Gewebe wurde nach nekropsie für die Kohorten 1 bzw. 2 analysiert. Kometen, die als Igel auf der Grundlage der Morphologie klassifiziert wurden, wurden nicht in die Bewertung von % Schwanz-DNA einbezogen. (A) Kohorte bedeuten % Schwanz-DNA-Ergebnisse. (B) Kohortendurchschnitt % Igelergebnisse. Fehlerbalken spiegeln die Standardabweichung wider. Statistische Analysen wurden durchgeführt, um gefrorenegewebe mit frischem Gewebe für jede Kohorte zu vergleichen und die Ergebnisse zwischen den beiden Kohorten für jede Gewebevorbereitungsmethode zu vergleichen. *Statistisch unterschiedlich(p < 0,05) von frischem Hackfleisch innerhalb derselben Kohorte mit dem t-Test des Schülers; #statistically unterschiedlich (p < 0,05) von frischem Hackfleisch innerhalb derselben Kohorte unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests für nicht normal verteilte Daten; • statistischer Unterschied(p < 0,05) zwischen Kohorten, die den t-Test des Schülers verwenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich von DNA-Schäden, die durch EMS im Lebergewebe induziert werden, das durch verschiedene Verfahren verarbeitet wird. Durchschnittliche % Schwanz-DNA für weibliche B6C3F1-Mäuse verabreicht Fahrzeug oder 200 mg/kg/Tag EMS für drei Tage (n = 5/Gruppe). Die Lebern wurden 3 h nach der letzten Dosis Verabreichung geerntet und frisch im Kometentest verarbeitet. Zusätzliches Lebergewebe wurde eingefroren, nachdem es in Hacklösung gehackt oder als Würfel gesammelt wurde; Gewürfelproben wurden unmittelbar vor der Herstellung von Kometenrutschen mit der Gewebeminkvorrichtung homogenisiert. Um sicherzustellen, dass Zellen am hohen Ende des Kontinuums von EMS-induzierten DNA-Schäden nicht von der Analyse ausgeschlossen wurden, wurden Kometen aufgenommen, die bei der visuellen Untersuchung die morphologische Beschreibung von Igeln zu erfüllen schienen, sich aber durch die Bildgebungssoftware als verwertbar erwiesen. Fehlerbalken spiegeln die Standardabweichung wider. Ein T-Test eines Schülers wurde verwendet, um die Menge der DNA-Schäden bei Tieren, die EMS ausgesetzt waren, mit der in der Fahrzeugkontrolltierhaltung für jede Probenvorbereitungsmethode zu vergleichen. *Statistisch signifikanter Anstieg bei p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Fallstudie, die den Nutzen der Tiefkühlwürfelmethode und qualitativ hochwertige Daten nach längerer Lagerung aufzeigt. Teile des Lebergewebes, die von weiblichen B6C3F1-Mäusen gesammelt wurden, die 90 Tage lang verschiedenen Konzentrationen einer Prüfchemikalie ausgesetzt waren (n = 5/Gruppe), wurden gehackt oder in Würfel geschnitten und im Labor im Leben eingefroren und anschließend zur Analyse an dieses Labor geliefert. Hackfleisch wurde nach 2 Monaten Lagerung analysiert; Aufgrund der schlechten Qualität der Daten wurde gefrorenes Würfelgewebe nach 22 Monaten Lagerung analysiert. Um sicherzustellen, dass Zellen am hohen Ende des Kontinuums chemisch induzierter DNA-Schäden nicht von der Analyse ausgeschlossen wurden, wurden Daten von scorable zellen, die bei der visuellen Untersuchung als Igel erschienen, einbezogen. (A) Gruppe bedeuten % Schwanz-DNA-Ergebnisse. Im Vergleich zu Hackfleisch wurden hochwertige Ergebnisse aus gefrorenem Würfelgewebe gewonnen, auch nach längerer Lagerung. (B) Gruppendurchschnitt % Igelergebnisse. Schlechte Zerkleinerungstechnik zeigt sich an den umfangreichen nicht-biologischen DNA-Schäden, die als Igelkometen in den Hackfleischproben beobachtet wurden. Fehlerbalken spiegeln die Standardabweichung wider. Eine ANOVA mit Dunnett-Test wurde verwendet, um eine positive Reaktion auf die Prüfchemikalie für jede Probenvorbereitungsmethode zu bewerten. Für beide Methoden wurden keine statistisch signifikanten(p < 0,05) Dosisgruppen nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Grundlegende DNA-Schäden, die in gefrorenen Hirngeweben der Ratte gemessen werden. Kometen-Assay-Ergebnisse werden für gefrorenes hackfleischendes oder gewürfeltes Gewebe bereitgestellt, das mehrere verschiedene Regionen des Gehirns von männlichen und weiblichen Sprague Dawley Ratten darstellt. Die Daten (die durch das Einschließen von verätzbaren Igelkometen generiert wurden) wurden in mehreren Studien gesammelt; n = Gesamtzahl der für jede Probenvorbereitungsmethode bewerteten Hirngewebe. Fehlerbalken spiegeln die Standardabweichung wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wie bereits gezeigt7,12,13, richtig behandelt Flash gefrorenes Hackfleisch liefert gute Ergebnisse in der Kometen-Assay. Tatsächlich liegen die in unserem Labor hergestellten Basiswerte für gefrorene gehackte Ratten- und Mausleber in der Regel bei 6 %, wie in der OECD-Testrichtlinie9 für frisch gehackte Leberproben von Ratten empfohlen. Gute Ergebnisse wurden von mehreren Laboratorien mit einer Vielzahl von Gewebetypen erzielt, die gehackt und gefroren gelagert wurden; ebenso wurden blitzgefrorene Epithelzellen, die von Organen im Magen-Darm-Trakt abgekratzt wurden, erfolgreich im Kometentest7,12,13,14verwendet. Gefrorenes hackendes/geschlerstes Gewebe scheint mindestens mehrere Monate relativ stabil zu sein. Die Methode, bei der die Homogenisierung von Flash-Gefrierwürfeln der Leber mit einer ursprünglich von Jackson et al.6beschriebenen Gewebezerkleinerungsvorrichtung verwendet wird, führt zu ergebnissen, dass der Kometentest zumindest vergleichbar und in der Regel besser ist (d. h. niedrigere Ausgangswerte an DNA-Schäden) als die für gefrorene Hackleber. Diese Methode gilt auch für andere Gewebetypen6; nach unserer Erfahrung wurden in ähnlicher Weise hervorragende Ergebnisse mit gefrorenem Würfelzwölffingerum (Daten nicht gezeigt) und Hirngewebe(Abbildung 5) erzielt. Die Siebvorrichtung kann jedoch nicht für eine Homogenisierung aller Gewebetypen zugänglich sein. In einer Pilotstudie fanden wir heraus, dass muskeles Herzgewebe nicht ohne weiteres durch das Siebgerät erzwungen werden konnte, was zu einer schlechten Zellerholung führte; stattdessen das Gewebe unmittelbar nach dem Auftauen zu zerkleinern, ergaben Zellsuspensionen mit Baseline % Schwanz-DNA-Werten, die mit denen vergleichbar sind, die vor dem Einfrieren des Blitzes gehackt wurden (Daten nicht dargestellt). Insbesondere, wenn während der Nekropsie richtig behandelt (d.h. kalt und feucht gehalten; als Einzelstücke eingefroren blinken doniert und nicht teilweise auftauen darf), hat flashgefrorenes Würfelgewebe auch nach etwa zwei Jahren Gefrierlagerung sehr geringe Basis-DNA-Schäden verursacht(Abbildung 4).
Die Verwendung von gefrorenen Zellsuspensionen oder würfelförmigem Gewebe im Kometentest bietet mehrere Vorteile gegenüber frischem Gewebe, einschließlich: 1) Erleichterung der gleichzeitigen Sammlung mehrerer Gewebetypen für die Kometenanalyse; 2) Erleichterung der Gewebeentnahme in einem Labor im Leben und Überführung von Proben in ein anderes Labor zur Analyse; 3) Bequemlichkeit, um eine Entscheidung zu verschieben, um ein bestimmtes Gewebe für Monate zu analysieren. Obwohl die Homogenisierung des gefrorenen Gewebes zum Zeitpunkt der Folienvorbereitung umständlicher ist als das Hacken von frischem Gewebe zum Zeitpunkt der Ernte, bietet die Verwendung von gefrorenem Würfelgewebe mehrere zusätzliche Vorteile, darunter: 1) keine Anforderung für Personal, das im Kometentest geschult ist (z. B. mobile Einheit) oder spezielle Vorräte/Reagenzien bei Nekropsie; 2) weniger Möglichkeiten für technische Fehler (z. B. Probenerwärmung; unzureichende Freisetzung von Zellen; suboptimale Gewebestichprobengröße) während der Nekropsie; 3) minimale Möglichkeit, mechanische DNA-Schäden während der Probenverarbeitung einzuführen (z. B. Hackscherung); und 4) geringe Basis-DNA-Schäden, auch nach längerer Lagerung.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde durch das Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) im Auftrag HHSN273201300009C; Die darin enthaltenen Erklärungen, Stellungnahmen oder Schlussfolgerungen stellen jedoch nicht notwendigerweise die Aussagen, Meinungen oder Schlussfolgerungen von NIEHS, NIH oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.
Acknowledgments
Die Autoren sind Lincoln Martin und Kelley Owens für die fachkundige technische Hilfe bei der Vorbereitung und Bewertung von Kometenrutschen und Dr. Carol Swartz für die Durchführung statistischer Analysen dankbar. Die Autoren würdigen auch die unterstützenden Beiträge von Mitgliedern der Programme Genetic Toxicology, Investigative Toxicology, and Necropsy an der ILS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Dental Wax Sheets | Electron Microscopy Sciences | 72670 | |
| Dissecting (Mincing) Micro Scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Low Melting Point Agarose | Lonza | 50081 | |
| Microfuge Tubes (1.7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Neutral Buffered Formalin | Leica | 600 | |
| Scalpel Blades | Miltex | 4-110 | |
| Syringe Plunger (1 mL) | Fisher Scientific or Vitality Medical | 14-826-88; 8881901014 | Becton Dickinson or Monoject tuberculin syringe |
| Tissue Mincing Device | NorGenoTech (Oslo, Norway) | None | Small variability in diameter observed which can affect snuggness of plunger. |
| Tweezers, plastic | Trade Winds Direct | DF8088N | Reinforced nylon, nonsterile, blunt tip, autoclavable; tradewindsdirect.com |
| Weigh Boats | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
References
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