Summary
وقد مكنت تقنيات تحرير الجينات الباحثين من توليد طفرات حمار وحشي للتحقيق في وظيفة الجينات بسهولة نسبية. هنا، نقدم دليلا ً لإجراء الجينة المتوازية للجنين والقياس الكمي لإشارات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي. ويوفر هذا النهج غير المتحيز دقة أكبر في التحليلات الظاهرية القائمة على التهجين في الموقع.
Abstract
التهجين في الموقع (ISH) هو تقنية هامة تمكن الباحثين من دراسة توزيع مرنا في الموقع وكانت تقنية حاسمة في علم الأحياء التنموي لعقود. تقليدياً، اعتمدت معظم دراسات التعبير الجيني على التقييم البصري لإشارة ISH، وهي طريقة عرضة للتحيز، لا سيما في الحالات التي تكون فيها هويات العينة معروفة مسبقاً. لقد سبق لنا أن أبلغنا عن طريقة للتحايل على هذا التحيز وتوفير كمية أكثر دقة لإشارات ISH. هنا، نقدم دليلبسيط لتطبيق هذه الطريقة لتحديد مستويات التعبير من الجينات ذات الاهتمام في الأجنة الملطخة بـ ISH وربط ذلك مع الأنماط الجينية المقابلة لها. وهذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لقياس إشارات التعبير الجيني المقيدة مكانياً في عينات من الأنماط الجينية المختلطة، كما أنها توفر بديلاً غير متحيز ودقيقاً لأساليب التهديف البصرية التقليدية.
Introduction
وقد أدى إدخال تكنولوجيات تحرير الجينوم (ZFN، TALENs ومؤخرا، CRISPR/Cas9) إلى زيادة هائلة في عدد المختبرات في جميع أنحاء العالم التي تستخدم هذه النظم لدراسة وظيفة جينات محددة في الجسم الحي. حمار وحشي على وجه الخصوص قابلة للتلاعب الجيني وقد تم إنشاء العديد من المسوخ في الماضي القريب1،2. بالنسبة لعلماء الأحياء التطوري، فإن إحدى الطرق الأكثر شيوعًا لتقييم العواقب الظاهرية للطفرات الجينية في التطور الجنيني هي التهجين في الموقع (ISH). في غياب عيوب مورفولوجية واضحة تفصل المسوخ المتجانسة عن نوعها البري أو الأشقاء المتغايرين ، فمن الضروري أن تكون قادرًا على تحديد الأنماط الجينية المختلفة بشكل صحيح بدقة.
تعتمد الـ ISH الكلاسيكية على التحليلات النوعية لكثافة الإشارة لاستخلاص استنتاجات حول التفاعلات التنظيمية بين جين الاهتمام وجينات العلامات المختارة. وعلى الرغم من أن هذه التحليلات مفيدة، فإن هذه التحليلات تعاني من الاختلاف التقني وقد تكون متحيزة من قبل توقعات الباحثين. وهكذا، تم تطوير طريقة لقياس التعبير الجيني بعد تصوير الأجنة الملطخة بـ ISH، دون معرفة مسبقة بالنمط الجيني المقابل. وأعقب ذلك استخراج الحمض النووي الفعال والجينية التي سمحت لنا لربط كميا النمط الجيني مع التعبير الجيني3. في حين أن الجينوجية من الأجنة بعد ISH قد استخدمت قبل4،5، صورة على أساس القياس الكمي من أنماط ISH لم تستخدم على نطاق واسع وبصرف النظر عن اثنين من الدراسات6،7. البدائل الأكثر شعبية تعتمد على تسجيل البصرية أو عد الخلايا الملطخة ISH8،9،10، على حد سواء عرضة لضعف الاستنساخ وتحيز الباحث. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة التغيرات في الجينات ذات أنماط التعبير المقيدة مكانًا ، مثل runx1 أو gata2b، وكلاهما يعبر عنه في مجموعة فرعية مقيدة من خلايا الأرضية الأبهرية تسمى بطانة الأيفيجينية11،12.
هنا ، ونحن نهدف إلى توفير دليل عملي لتنفيذ القياس الكمي عن طريق تحليل الصور باستخدام فيجي13، فضلا عن استخراج الحمض النووي وبروتوكول الجينوبة. والمقصود من هذا هو توضيح بصريا لدينا طريقة نشرت سابقا3. تسمح طريقتنا بتمثيل دقيق للاختلاف في التعبير الجيني الذي تم اكتشافه بواسطة ISH وتعيين غير متحيز لمستويات التعبير الجيني لأنماط جينية محددة.
Protocol
وينظم الإجراءات المتعلقة بالحيوانات قانون (الإجراءات العلمية) للحيوانات لعام 1986، وقد وافقت عليها وزارة الداخلية والهيئة المحلية لرعاية الحيوان والمراجعة الأخلاقية.
1. صورة الأجنة الملطخة بـ ISH
- إعداد محلول الجلسرين (50٪ -80٪ في 1x PBS العازلة) ومزيج لتجانس الحل (على سبيل المثال، وترك في الأسطوانة لمدة 5 دقيقة على الأقل). يمكن الاحتفاظ بهذا الحل لعدة أشهر في درجة حرارة الغرفة.
- بعد التهجين في الموقع14،15،16،17، نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين مع ماصة 3 مل باستور وترك لتسوية لمدة 5 دقيقة على الأقل. إذا كان تصوير الأجنة أكبر من 24 hpf (ساعات بعد الإخصاب)، ويمكن تبييضها كما هو موضح18.
- إعداد وتسمية ما يكفي من أنابيب PCR لنقل الأجنة الملطخة بـ ISH بعد التصوير.
- إضافة 100% الجلسرين إلى الجزء السفلي من البئر في شريحة الاكتئاب الزجاج مع ماصة باستور 3 مل.
- باستخدام ماصة بسترة بسترة 3 مل، قم بنقل جنين واحد ملطخ بـ ISH إلى الشريحة الزجاجية وتوجيهه كما هو مطلوب تحت مجهر يجهّز بكاميرا رقمية وإضاءة أسفل وأعلى.
ملاحظة: استخدم نصائح تحميل الجل لوضع الأجنة للتصوير، ولكن الأدوات الأخرى (على سبيل المثال، ملقط، تشريح إبرة) ستكون كافية بنفس القدر. - باستخدام الجنين الأول، ضبط وقت الإضاءة والتعرض في التكبير المطلوب. استخدم هذه الشروط لجميع الأجنة في نفس التجربة (أي إذا كان تصوير 40 جنينًا من تقاطع متحول هيتيروزيغوس ، فتأكد من أن الإضاءة ووقت التعرض والتكبير هي نفسها للجميع).
- صورة العديد من الأجنة كما هو مطلوب. تسمية كل صورة برقم فريد. بعد التصوير، قم بنقل الجنين إلى أنبوب PCR/لوحة تحمل نفس الرقم.
ملاحظة: يجب حفظ الصور كملفات TIF، ولكن التنسيقات الأخرى كافية أيضاً.- إذا لزم الأمر، قم بإزالة الجلسرين الزائد في أنابيب PCR/plates.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين الأجنة في أنابيب PCR لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة.
- إذا لزم الأمر، قم بإزالة الجلسرين الزائد في أنابيب PCR/plates.
2. استخراج الحمض النووي والنمط الجيني للأجنة الملطخة بـ ISH
ملاحظة: هنا، استخدم طريقة موثوقة وغير مكلفة لعزل الحمض النووي الجينومي على أساس طريقة HoTSHOT19 مع كفاءة استخراج الحمض النووي من 95٪ -100٪3.
- بعد اكتمال التصوير، أضف 40-75 ميكرولتر من عازل الانطول القلوي (على سبيل المثال، HoTSHOT) إلى كل أنبوب.
- احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا وتبريد الأنابيب إلى 4 درجة مئوية قبل إضافة حجم متساو من العازلة التحييد. حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية قد يحسن كفاءة PCR.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن استخدام الحمض النووي الجينومي للكتابة الجينية أو تخزينها عند -20 درجة مئوية حتى يكون مطلوباً. - عينات النمط الجيني مع طريقة مناسبة (على سبيل المثال، HRMA، RFLP)3،20،21 كما هو مطلوب لطفرة الفائدة.
- لاحظ النمط الجيني المطابق لكل عينة (على سبيل المثال، باستخدام برنامج جدول بيانات).
3. قياس كثافة بكسل من الأجنة الملطخة ISH (تحليل الصور باستخدام برامج فيجي)
- لقياس التهجين في الموقع (ISH) شدة إشارة تلطيخ، تحويل جميع الصور إلى تدرج رمادي 8 بت كما هو موضح3. إذا تم حفظ الصور كـ . TIF الملفات، واستخدام الماكرو فيجي لتحويل دفعة3. بدلاً من ذلك، قم بتحويل الصور بتنسيقات أخرى (على سبيل المثال، . JPG) إلى . TIF باستخدام البرامج المناسبة ومن ثم تحويلها إلى تدرج رمادي 8 بت باستخدام فيجي. للراحة ، وهنا هو الإجراء خطوة بخطوة التي نشرت سابقا3، مع بعض التعديلات.
- فتح الصور في فيجي وعكس الصورة مع تحرير > عكس. ثم تغيير نوع الصورة إلى 8 بت(صورة > نوع > 8 بت).
- باستخدام أداة اختيار المضلع، ارسم منطقة الاهتمام يدويًا على الصورة حول المنطقة التي تحتوي على الإشارة.
- اضغط على t لفتح مدير عائد الاستثمار. استخدم أمر قياس مدير عائد الاستثمار لقياس شدة عائد الاستثمار. نسخ القيمة الوسطى من إطار النتائج إلى برنامج جدول بيانات.
- نقل نفس العائد على الاستثمار، وضمان نفس الحجم والشكل مثل المنطقة الأصلية، إلى منطقة من حمار وحشي لا تحتوي على أي تلطيخ. كرر الخطوة 3.4 لقياس الخلفية.
- للحصول على متوسط كثافة البكسل لإشارة ISH، اطرح متوسط قيمة الكثافة لمنطقة الخلفية من المنطقة الملطخة لكل جنين.
- تعيين كل قيمة كثافة إلى نمط جيني (من الخطوة 2.3).
4. تحليل النتائج مع الاختبارات الإحصائية المناسبة
- رسم كافة القيم على مؤامرة Q-Q واحد لتحديد أي انحرافات عن التوزيع العادي.
ملاحظة: يمكن أيضًا التحقق من التوزيع العادي باستخدام اختبار كولموجوروف-سميرنوف أو اختبار شابيرو-ويلك. ومع ذلك، لأحجام عينة كبيرة هناك خطر كبير من ايجابيات كاذبة في هذه الاختبارات. - إذا كانت هناك انحرافات قوية عن التوزيع العادي، قم بتحويل كافة القيم (باستخدام الدالات ln أو sqrt) للتأكد من توزيعها عادة قبل المتابعة.
- تحليل الاختلافات بين القيم (تحويلها إذا لزم الأمر) المخصصة لكل نمط جيني (wt مقابل heterozygote مقابل متحولة) مع ANOVA 2 الذيل مع مستويات الثقة 95٪، والمحاسبة على المساواة في التباينات مع اختبار ليفين وتصحيح ويلش. بالنسبة للمقارنات الثنائية بين كل زوج من الأنماط الجينية، استخدم اختبار Tukey (التباينات المتساوية) أو Games-Howell (التباينات غير المتكافئة) بعد الولادة.
- إذا لم يتم توزيع القيم عادة على الرغم من التحويل، استخدم اختبار غير بارامتري (Kruskall-Wallis) لتحليل الاختلافات بين القيم المصنفة واختبار مقارنات متعددة لـ Dunn بعد مخصص مع تصحيح Bonferroni للاقتران مقارنات.
- رسم القيم غير المحولة (من الخطوة 3.6) كمخططات نقطة للحصول على أفضل تمثيل للنتائج.
Representative Results
هنا ، ونحن نصف التطبيق العملي لخط الأنابيب لكمية الصورة والجنين الجينية كما نشرت في مكان آخر3. يظهر سير العمل للأسلوب في الشكل 1. لتوضيح كيفية استخدام هذه الطريقة، تم تنفيذ ISH لdnmt3bb.1 في 33 الأجنة hPF من runx1W84X/+22 incross(الشكل 2). تم تصميم 130 جنينًا باستخدام نفس ظروف الإضاءة المفصلة في البروتوكول ووضع علامة عليها برقم فريد. بعد التصوير، تم نقل كل جنين إلى أنبوب PCR للكتابة الجينية. عند هذه النقطة، تم إجراء تحليل الصورة لإسناد قيمة كثافة بكسل إلى كل صورة. ثم تم تعيين النمط الجيني إلى صورته المقابلة وقيم كثافة البكسل المجمعة وفقًا للنمط الجيني للتحليل الإحصائي. تم الكشف عن انخفاض في التعبير dnmt3bb.1 في runx1W84X/W84X المسوخ(الشكل 2A, B)3, بالاتفاق مع الملاحظات السابقة5. ومن المثير للاهتمام، runx1W84X/+ الأجنة heterozygous لم تظهر أي اختلافات كبيرة في التعبير dnmt3bb.1 (الشكل 2A، B)بالمقارنة مع الأشقاء نوع البرية، مما يشير إلى أن نسخة واحدة من Runx1 كافية للحفاظ على التعبير dnmt3bb.1 في المستويات المناسبة.
تفشل العديد من طفرات حمار وحشي لإظهار النمط الظاهري الجنينية التي يمكن أن يتم الكشف عنها باستخدام غيرها من فقدان التكنولوجيات وظيفة مثل القلة المورفيلينو (MOs). ويمكن أن يعزى هذا التباين إلى عدد من الأسباب بما في ذلك الآثار خارج الهدف، وتعويض البروتين الأمومي، أليل23 أو ظاهرة اكتشافمؤخرا من التعويض الوراثي24،25،26،27. في هذا المثال ، سألنا عما إذا كان تم تقليل تعبير runx1 أو فقده في المسوخ lmo4auob100 منذ البيانات المنشورة سابقًا باستخدام lmo4a MO اقترح أن يتم تقليل runx1 في lmo4a morphants28. هنا ، كشف التحليل عن عدم وجود اختلافات كبيرة في التعبير runx1 بين نوع البرية وlmo4auob100 المسوخ homozygous3 (الشكل 3A ،B). مزيد من التحليل من قبل QPCR الجنين واحد أظهرت أن هناك انخفاضا صغيرا ولكن كبيرا في التعبير runx1 في lmo4auob100 المسوخ(الشكل 3C). وبالتالي، فمن الممكن أن كمية الصورة قد لا تكون قادرة على الكشف عن الاختلافات الصغيرة في مستويات التعبير. بدلا من ذلك، عدم وجود فرق بين الأنماط الجينية التي اكتشفناها هو حقيقي وتجارب qPCR هي الكشف عن التغيرات في التعبير runx1 في الأنسجة الأخرى مثل telenchephalon حيث يتم التعبير عن كل من lmo4a و runx1. يجب على الباحثين التحقق دائمًا من نتائجهم باستخدام طريقة مستقلة مثل qPCR ، ولكن من الناحية المثالية إثراء الأنسجة ذات الاهتمام عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على سبيل المثال.
في حالات نادرة حيث ISH لديه خلفية عالية(الشكل 3D)، تكون قيمة كثافة البكسل في هذه المنطقة عالية جدًا لدرجة أن الطرح من قيمة الإشارة ينتج رقمًا سالبًا وفي مثل هذه الحالات سيتم استبعاد هذه الأجنة من التحليل. في تجربتنا، حدث هذا في حوالي 0.4٪ من الأجنة السبر1-التحقيق3 ولكن قد تختلف بين التجارب، تحقيقات أو دفعات من الكواشف. على الرغم من أن ذلك قد يكون قيدًا على الطريقة ، فإن التردد المنخفض للخلفية العالية من غير المرجح جدًا أن يؤثر على النتائج الإجمالية.
لاختبار تأثير اختيار مناطق مختلفة لتصحيح اتّهاس الخلفية، قمنا أولاً بقياس كثافة البكسل لإشارة الـ runx1 ISH في 28 جنيناً من نوع hpf، وذلك باستخدام مناطق مختلفة لإجراء تصحيحات خلفية(الشكل 4). تم اختيار أربع مناطق مختلفة: اثنتان في منطقة الجذع (R1، و R2)، وواحدة في منطقة الصفار (غير ملطخة، ولكن من المرجح أن تتراكم تلطيخ الخلفية) ومنطقة أصغر الأمامي إلى عائد الاستثمار (R4، الشكل 4B). وأظهر قياس كثافة البكسل في هذه المناطق فرقاً مستقراً نسبياً في الكثافة بين عائد الاستثمار ومنطقة أي من مناطق الخلفية(الشكل 4C). ومع ذلك ، R3 أظهرت دائما قيم عالية جدا (فوق تلك الموجودة في العائد على الاستثمار). بعد الانعكاس والتحويل إلى 8 بت ، تبدو منطقة الصفار مشرقة للغاية وبالتالي ليست مناسبة للاستخدام كتصحيح للخلفية. R2 كان أقرب إلى العائد على الاستثمار ولكن يحتوي على بعض إشارة ISH، واستخدامه للتصحيح انخفض متوسط كثافة بكسل بالمقارنة مع إما R1 (تقع أبعد من الظهر، بعيدا عن إشارة ISH) أو R4. وبالتالي، فإن R1 أو R4 هما مجالان مناسبان يمكن استخدامهما لتصحيح الخلفية (على الرغم من أن مساحة R4 أصغر من مساحة R1). بعد ذلك ، أردنا أن نقارن كيف يؤثر استخدام R1 أو R4 على النتائج عند مقارنة تعبير runx1. لهذا، ونحن في تقاطع dll4+/- heterozygotes29 وتحليل التعبير runx1 في نوع البرية المختارة عشوائيا وdll4-/-الأجنة(الشكل 4E). على الرغم من أن استخدام R1 أو R4 لتصحيح الخلفية يؤثر على القيم الفردية، فإن متوسط كثافة البكسل داخل نفس النمط الجيني لم يكن مختلفًا بشكل ملحوظ(الشكل 4E). وعلاوة على ذلك، فإن مقارنة تعبير runx1 لا تزال تسفر عن قيم كثافة متوسط مماثلة بين الأنماط الجينية باستخدام مناطق R1 أو R4 كتصحيح للخلفية (μR1= 16.3 وμR4= 18.2 ، على التوالي). إذا ما جمعنا معاً، فقد خلصنا إلى أنه على الرغم من أهمية اختيار منطقة الخلفية، إلا أن المعايير الرئيسية هي أنه لا يشمل مناطق الصفار (المعرضة لتراكم تلطيخ الخلفية) وأنه لا ينبغي أن يحتوي على أي تلطيخ (محدد) قد يشوه قيم كثافة البكسل للخلفية.
الشكل 1: سير العمل في بروتوكول كمية الصورة المتوازية والجينية. يتم فحص الأجنة التي تم جمعها من تقاطع من الأسماك heterozygous لأليل متحولة للجين المقاس مع بروتوكول ISH قياسي. بعد التصوير ، يتم استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام بروتوكول HotSHOT عن طريق إضافة حاجز الانفص اللايس مباشرة إلى الجنين في أنبوب PCR 0.2 مل ، تليها حضانة 30 دقيقة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية. يستخدم هذا الحمض النووي للكتابة الجينية للأجنة عن طريق PCR، PCR وتقييد طول جزء تعدد الأشكال (RFLP)، واختبارات KASP أو أي طريقة مناسبة أخرى. وبالتوازي مع ذلك، يتم عكس الصور لكل جنين وتحويلها إلى مقياس رمادي 8 بت. يتم اختيار وقياس ROIs ذات الشكل والحجم المتماثلين المتطابقين الذي يحتوي على إشارة ISH (الأصفر) والخلفية (الزرقاء). يتم تحليل القياسات، المخصصة للأنماط الجينية المقابلة، إحصائياً. الرقم مقتبس من Dobrzycki وآخرون.3الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كمية الصورة في runx1 المسوخ يكشف عن انخفاض مستويات التعبير dnmt3bb.1 بواسطة ISH. (أ)مثال صور لـ ISH في 33 hpf نوع البرية (الأزرق), runx1+/W84X (الأخضر) وrunx1W84X/W84X (البرتقال) الأجنة, تظهر dnmt3bb.1 التعبير في أورتا الظهرية. (ب)قيم كثافة البكسل من dnmt3bb.1 مرنا في الأجنة runx1W84X/W84X(n = 36) انخفضت بشكل ملحوظ بالمقارنة مع الأنواع البرية (ن = 32) وheterozygotes (n = 62) (ANOVA، p < 0.001). معاملات الاختلاف هي 24٪ ، 22٪ و 21٪ لنوع البرية، heterozygote ومجموعات متحولة، على التوالي. تتوافق نقطة البيانات الزرقاء والخضراء والبرتقالية مع الصور المثال من اللوحة A. تمثل القضبان يعني ± s.d. ***p<0.001 (ألعاب-هاويل اختبار ما بعد مخصص). الرقم مقتبس من Dobrzycki وآخرون.3الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس مستويات التعبير runx1 بواسطة ISH في lmo4auob100المسوخ. (أ)صور تمثيلية لـ ISH لـ runx1 في 28 hpf نوع البرية (الأزرق)، heterozygous (الأخضر) وlmo4auob100/uob100 (البرتقالي) الأجنة، والتي تبين التعبير في أورتا الظهرية. (ب)القياس الكمي لإشارة runx1 مرنا، تم الكشف عن طريق ISH، من 28 hpf نوع البرية (ن = 15)، heterozygous lmo4a+/- (het) (n=34) وlmo4auob100/uob100 متحولة (ن = 18) الأجنة من مخلب واحد يظهر أي فرق كبير في كثافة البكسل runx1 بين الأنماط الجينية المختلفة (ANOVA،> p 0.6). تتوافق نقطة البيانات الزرقاء والخضراء والبرتقالية مع الصور المثال من اللوحة A. تمثل القضبان المتوسط ± s.d.(C)Boxplots عرض مستويات runx1 مرنا (2-ΟCt)في نوع واحد البرية (الأزرق؛ ن = 12) وlmo4auob100/uob100 (mut, orange; n= 12) الأجنة، تقاس qRT-PCR، مما يدل على انخفاض مستويات runx1 في المسوخ مقارنة بنوع البرية. *ص < 0.05(ر اختبار). (د)مثال على تجربة ISH على جنين 28 hpf (ملطخة لrunx1، رؤوس الأسهم الصفراء) تظهر خلفية عالية. الرقم مقتبس من Dobrzycki وآخرون.3الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أثر تصحيح كثافة الخلفية على نتائج القياس. (أ)صورة تمثيلية لتلطيخ runx1 ISH في جنين من النوع البري عند 28 hpf. (ب)نفس الصورة بعد الانعكاس والتحويل إلى 8 بت. يتم تمييز منطقة الاهتمام (ROI) باللون الأخضر ويتم تمييز أربع مناطق مختلفة تستخدم لتصحيح الخلفية (R1-R4) باللون الأصفر. (C)قياسات كثافة البكسل الخام في جميع المناطق الموضحة في اللوحة B. لاحظ أن الكثافة في R3 (yolk) أعلى باستمرار من إشارة ISH الفعلية في عائد الاستثمار (n = 11). (D)مستويات التعبير Runx1 في العائد على الاستثمار باستخدام مناطق الخلفية R1 و R2 و R4. مناطق لعائد الاستثمار، R1، R2 و R3 ~ 28500 بكسل؛ R4 ~ 8500 بكسل. لاحظ أن خلفية R3 لم يتم استخدامها لهذه المقارنة حيث أن تصحيح الخلفية (ROI-R3) ينتج باستمرار عن قيم سالبة. (E) Runx1 مستويات التعبير في نوع البرية وdll4-/- المسوخ باستخدام إما R1 أو R4 لتصحيح الخلفية (ن = 10 لكل عينة). تم إجراء التحليل الإحصائي في اللوحتين D و E باستخدام اختبار Kruskal-Wallis غير المكافئ، على افتراض أن قيم كثافة البكسل لا يتم توزيعها عادة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وينبغي النظر في عدد قليل من العوامل عند استخدام هذه الطريقة لقياس التعبير الجيني. يجب الحفاظ على ظروف التصوير طوال التجربة (على سبيل المثال الإضاءة وأوقات التعرض وتحديد موضع الجنين) للحد من التباين بين القياسات. نقطة حرجة هي تجنب تلطيخ العينات ، حيث قد تكون الاختلافات في تلطيخ بين العينات ملثمين. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن انخفاض في التعبير VegfA في غياب Eto2 في أجنة زينوبوس laevis 30 فقط عن طريق مراقبة تلطيخ بعناية على مدى فترة 24 ساعة. وبالتالي، فمن الممارسات الجيدة لتحديد تجريبي مستويات تلطيخ كافية لكل جين التي تمثل التعبير على أفضل وجه، دون الوصول إلى التشبع. كما سيؤدي التلطيخ المفرط إلى زيادة كثافة بكسل الخلفية بشكل مصطنع في الصور الرمادية المحولة 8 بت وانحراف نتائج الكمية. في الحالات القصوى، قد يكون مستوى الخلفية في الأنسجة الجنينية أعلى من إشارة ISH في عائد الاستثمار المحدد ويجب استبعاد هذه العينات من التحليل. ولوحظت ظاهرة مماثلة عندما اختبرنا مدى ملاءمة صفار غير ملطخ لتصحيح الخلفية(الشكل 4). بعد الانعكاس والتحويل إلى 8 بت تصبح البيكسلات الداكنة في منطقة الصفار أكثر إشراقًا من إشارة ISH في الجنين وتجعل القيم المصححة في الخلفية سلبية. وبالتالي، تجنب استخدام صفار لتصحيح الخلفية. قياس إشارة الخلفية في المناطق المصطبغة في الجنين (على سبيل المثال، العينين أو الجزء الظهري من الجذع من 26/28 hpf فصاعدا) سوف يؤدي بنفس القدر إلى انحراف نتائج الكمية وينبغي أيضا تجنبها. هناك بروتوكولات متاحة لتبييض أجنة حمار وحشي، إما قبل أو بعد ISH18 وتبييض الأجنة الأكبر من 24 hpf قبل الموصى به التصوير.
لأن هذه الطريقة تعتمد على قياس كثافة بكسل في منطقة محددة على كثافة بكسل الخلفية في منطقة غير ملطخة مكافئة، فإنه ليس من المناسب لكمية الجينات في كل مكان أو ما يقرب من كل مكان كما هو. بدلاً من ذلك، فإنه مناسب تماماً لقياس التعبير عن الجينات مع توزيع مقيد مكانياً حيث يمكن تحديد منطقة لقياس كثافة بكسل الخلفية بسهولة. يشير تحليلنا الإضافي الآن إلى أن استخدام مساحة أصغر (3-4x أصغر) لتصحيح الخلفية يؤدي إلى نتائج مماثلة لاستخدام مساحة مكافئة لمساحة عائد الاستثمار. وهذا يوسع نطاق انطباق الطريقة على الجينات المعرب عنها في مجالات مكانية أوسع (وبالتالي تتطلب المزيد أكبر من ROل قياسات الكثافة)، طالما يمكن للمرء أن يستخدم مناطق غير ملطخة بوضوح من الجنين لتصحيح الخلفية.
وأخيراً، نقترح أن يتم تنفيذ الجينوبة بالتوازي أو بعد كمية الصورة لتقليل التحيز المجرب. كما أن الطلب من مجرب ثانٍ لتكرار الكمية على عينات مجهولة الهوية ومقارنتها بالمجموعة الأولى من القياسات سيساعد أيضًا في تقليل تحيز المجرب. إذا كانت الصور التي سيتم قياسها كمياً هي من مقارنة بين العلاجات التي لا تتطلب الجينوغرافيا (على سبيل المثال، النوع البري مقابل المثبط الكيميائي أو النوع البري مقابل الضربة القاضية MO)، يجب أن يعمي المجرب الذي يقوم بالقياسات عن هوية عينه.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر الموظفين في الخدمات الطبية الحيوية في أكسفورد وبرمنغهام لتربية حمار وحشي ممتازة. تم تمويل T.D. من قبل منحة دكتوراه في علم الأحياء التطوري ويلكوم الاستئماني (#WT102345/Z/13/Z). تم تمويل R.M. و M.K. من قبل مؤسسة القلب البريطانية (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) وهما ممتنان لدعمهما السخي. تقر ر. م. بالدعم المقدم من مركز التميز البحثي في البوسنة والهرسك (RE/13/1/30181)، أكسفورد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
