Summary
Genredigeringsteknologier har gjort det muligt for forskere at generere zebrafiskmutanter til at undersøge genfunktionen med relativ lethed. Her giver vi en guide til at udføre parallelle embryo genotyping og kvantificering af in situ hybridisering signaler i zebrafisk. Denne upartiske tilgang giver større nøjagtighed i fænotypiske analyser baseret på in situ hybridisering.
Abstract
In situ hybridization (ISH) er en vigtig teknik, der gør det muligt for forskere at studere mRNA distribution in situ og har været en kritisk teknik i udviklingsmæssige biologi i årtier. Traditionelt, de fleste genekspression undersøgelser baseret på visuel evaluering af ISH signal, en metode, der er tilbøjelig til bias, især i tilfælde, hvor prøven identiteter er kendt på forhånd. Vi har tidligere rapporteret om en metode til at omgå denne bias og give en mere præcis kvantificering af ISH signaler. Her præsenterer vi en enkel vejledning til at anvende denne metode til at kvantificere ekspressionsniveauerne af gener af interesse for ISH-farvede embryoner og korrelere det med deres tilsvarende genotyper. Metoden er især nyttig til at kvantificere geografisk begrænsede genekspressionssignaler i prøver af blandede genotyper, og den giver et upartisk og nøjagtigt alternativ til de traditionelle visuelle scoringsmetoder.
Introduction
Indførelsen af genomredigeringsteknologier (ZFN, TALENs og senest CRISPR/Cas9) har ført til en massiv stigning i antallet af laboratorier rundt om i verden, der gør brug af disse systemer til at studere funktionen af specifikke gener in vivo. Især zebrafisk er modtagelige for genetisk manipulation , og mange mutanter er blevet genereret i de seneste1,2. For udviklingsmæssige biologer, en af de mest almindelige metoder til at vurdere de fænotypiske konsekvenser af genmutationer i embryonale udvikling er in situ hybridisering (ISH). I mangel af åbenlyse morfologiske defekter, der adskiller homozygote mutanter fra deres vilde type eller heterozygote søskende, er det vigtigt at kunne identificere forskellige genotyper korrekt.
Klassisk ISH bygger på kvalitative analyser af signalintensiteter for at drage konklusioner om lovgivningsmæssige interaktioner mellem genet af interesse og udvalgte markørgener. Selvom det er nyttigt, lider disse analyser af tekniske variationer og kan være forudindtaget af forskerens forventninger. Der blev således udviklet en metode til kvantificering af genekspression efter billeddannelse af ISH-farvede embryoner uden forudgående kendskab til den tilsvarende genotype. Dette blev efterfulgt af en effektiv DNA-ekstraktion og genoyping, der tillod os at kvantætt korrelere genotype med genekspression3. Mens genosoping af embryoner post ISH er blevet brugt før4,5, billedbaseret kvantificering af ISH mønstre har ikke været almindeligt anvendt bortset fra et par undersøgelser6,7. De mest populære alternativer er afhængige af visuel scoring eller optælling af ISH-farvede celler8,9,10, både tilbøjelige til dårlig reproducerbarhed og forsker bias. Denne metode er især nyttig til at undersøge ændringer i gener med udtryksmønstre, der er geografisk begrænsede, såsom runx1 eller gata2b, begge udtrykt i en begrænset delmængde af aortiske gulvceller kaldet hæmogeninentel11,12.
Her sigter vi mod at give en praktisk vejledning til gennemførelsen af kvantificeringen ved billedanalyse ved hjælp af Fiji13samt DNA-ekstraktions- og genoypingprotokollen. Dette er beregnet til visuelt at illustrere vores tidligere offentliggjorte metode3. Vores metode giver mulighed for en nøjagtig repræsentation af variationen i genekspression opdaget af ISH og en upartisk tildeling af genekspressionsniveauer til specifikke genotyper.
Protocol
Procedurer, der involverer forsøg med dyreforsøg, reguleres af loven om dyreforsøg (videnskabelige procedurer) af 1986 og er blevet godkendt af indenrigsministeriet og det lokale organ for dyrevelfærd og etisk gennemgang.
1. Billede ISH-farvede embryoner
- Forbered en glycerolopløsning (50%-80% i 1x PBS buffer) og bland for at homogenisere opløsningen (f.eks. lad den i en rulle i mindst 5 min). Denne løsning kan opbevares i månedsvis ved stuetemperatur.
- Efter in situ hybridisering14,15,16,17, overføre embryoner til glycerol opløsning med en 3 ml Pasteur pipette og lad det nøjes med mindst 5 min. Hvis billeddannelse embryoner ældre end 24 hpf (timer efter befrugtning), kan de bleget som beskrevet18.
- Forbered og mærk nok PCR-rør til at overføre ISH-farvede embryoner efter billeddannelse.
- Tilføj 100% glycerol til bunden af brønden i et glas depression dias med en 3 ml Pasteur pipette.
- Ved hjælp af en 3 ml Pasteur pipette, overføre en enkelt ISH-farvede embryo til glasset dias og orientsom kræves under et stereomikroskop udstyret med et digitalt kamera og bund og top belysning.
BEMÆRK: Brug gellæsserespidser til at placere embryonerne til billeddannelse, men andre værktøjer (f.eks. pincet, dissekeringnål) vil være lige så tilstrækkelige. - Brug det første embryon til at justere belysnings- og eksponeringstiden ved den ønskede forstørrelse. Brug disse betingelser for alle embryonerne i det samme eksperiment (dvs. hvis billeddannelse 40 embryoner fra en heterozygot mutant ikryds, skal du sørge for, at belysningen, eksponeringstiden og forstørrelsen er de samme for alle).
- Billede så mange embryoner som krævet. Mærk hvert billede med et entydigt tal. Efter billeddannelse overføres embryonet til et PCR-rør/plade mærket med samme nummer.
BEMÆRK: Billeder skal gemmes som TIF-filer, men andre formater er også tilstrækkelige.- Hvis det er nødvendigt, skal overskydende glycerol fjernes i PCR-rørene/pladerne.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan embryonerne opbevares i PCR-rørene i flere uger ved stuetemperatur.
- Hvis det er nødvendigt, skal overskydende glycerol fjernes i PCR-rørene/pladerne.
2. Uddrag DNA og genotype de ISH-farvede embryoner
BEMÆRK: Her skal du bruge en pålidelig og billig metode til at isolere genomisk DNA baseret på HoTSHOT-metoden19 med en DNA-ekstraktionseffektivitet på 95%-100%3.
- Når billedbilledet er fuldført, tilsættes 40-75 μL alkalisk lysisbuffer (f.eks. HoTSHOT) til hvert rør.
- Inkuber ved 95 °C i ca. 30 min. og afkøles rørene til 4 °C, før rørene tilføjes en lige stor neutraliseringsbuffer. En inkubation natten over ved 4 °C kan forbedre PCR's effektivitet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan det genomiske DNA anvendes til genoyping eller opbevares ved -20 °C, indtil det er påkrævet. - Genotypeprøver med en passende metode (f.eks. HRMA, RFLP)3,20,21 efter behov for at kunne mutationen af interesse.
- Bemærk den genotype, der svarer til hvert eksempel (f.eks. ved hjælp af en regnearkssoftware).
3. Kvantificer pixelintensiteten af ISH-farvede embryoner (billedanalyse ved hjælp af Fiji-software)
- For at kvantificere in situ-hybridiseringsintensiteten (ISH) skal du konvertere alle billeder til 8-bit gråtoneskala som beskrevet3. Hvis billederne blev gemt som . TIF-filer, skal du bruge en Fiji-makro til batchkonvertering3. Du kan også konvertere billeder i andre formater (f.eks. JPG) til . TIF ved hjælp af passende software og derefter konvertere til 8-bit gråtoneskala ved hjælp af Fiji. For nemheds skyld, her er den trin-for-trin procedure, der blev offentliggjort tidligere3, med nogle ændringer.
- Åbn billeder i Fiji, og inverter billedet med Rediger > Inverter. Skift derefter billedtypen til 8-bit (Billede > Tekst > 8-bit).
- Ved hjælp af værktøjet til valg af polygon skal du tegne interesseområdet manuelt på billedet omkring det område, der indeholder signalet.
- Tryk på t for at åbne ROI-lederen. Brug kommandoen Målforter afkastet til investeringsafkastet til at måle intensiteten af investeringsafkastet. Kopier middelværdien fra vinduet Resultater til en regnearkssoftware.
- Flyt den samme investeringsafkast, der sikrer samme størrelse og form som den oprindelige region, til en region af zebrafisken, der ikke indeholder farvning. Gentag trin 3.4 for at måle baggrunden.
- For at opnå ish-signalets gennemsnitlige pixelintensitet trækkes baggrundsområdets middelintensitetsværdi fra den farvede regions for hvert embryon.
- Tildel hver intensitetsværdi til en genotype (fra trin 2.3).
4. Analysere resultaterne med passende statistiske test
- Afbilde alle værdierne på ét Q-Q-plot for at identificere eventuelle afvigelser fra normal fordeling.
BEMÆRK: Normal distribution kan også verificeres med Kolmogorov-Smirnov testen eller Shapiro-Wilk testen. Men for store stikprøvestørrelser er der en høj risiko for falske positiver i disse tests. - Hvis der er stærke afvigelser fra normal fordeling, skal du transformere alle værdierne (ved hjælp af ln- eller sqrt-funktioner) for at sikre, at de normalt fordeles, før de fortsætter.
- Analyser forskellene mellem de værdier (om nødvendigt transformeret), der tildeles hver genotype (wt vs. heterozygote vs. mutant) med 2-tailed ANOVA med 95% konfidensniveauer, der tager højde for ligheden mellem varianser med en Levenes test og Welch-korrektion. For parvis sammenligninger mellem hvert par genotyper, skal du bruge Tukey's (lige varians) eller Games-Howell (ulige varians) post-hoc test.
- Hvis værdierne normalt ikke distribueres på trods af transformationen, skal du bruge en ikke-parametrisk test (Kruskall-Wallis) til at analysere forskellene mellem rangerede værdier og en post-hoc Dunns test af flere sammenligninger med Bonferroni-korrektion for parvis Sammenligninger.
- Afbilde de ikke-transformerede værdier (fra trin 3.6) som punktplots for den bedste repræsentation af resultaterne.
Representative Results
Her beskriver vi den praktiske anvendelse af rørledningen til billedkvantititation og embryogenotyping som offentliggjort andetsteds3. Arbejdsprocessen for metoden vises i figur 1. For at illustrere, hvordan denne metode skal anvendes, blev ISH udført for dnmt3bb.1 i 33 hpf-embryoner fra en runx1W84X/+22 incross ( Figur2). 130 embryoner blev afbildet ved hjælp af de samme belysningsbetingelser som beskrevet i protokollen og mærket dem med et unikt nummer. Efter billeddannelse blev hvert embryon overført til et PCR-rør til genoyping. På dette tidspunkt blev billedanalysen udført for at tilskrive en pixelintensitetsværdi til hvert billede. Genotypen blev derefter tildelt det tilsvarende billede, og pixelintensitetsværdierne grupperet efter deres genotype til statistisk analyse. Der blev påvist et fald i dnmt3bb.1-udtrykket i runx1W84X/W84X-mutanter (figur 2A,B)3i overensstemmelse med tidligere observationer5. Interessant, runx1W84X/ + heterozygous embryoner viste ingen signifikante forskelle i dnmt3bb.1 udtryk(Figur 2A,B)i forhold til sin vilde type søskende, hvilket tyder på, at en kopi af Runx1 er tilstrækkelig til at opretholde dnmt3bb.1 udtryk på passende niveauer.
Mange zebrafisk mutanter undlader at vise en embryonal fænotype, der ellers kan påvises ved hjælp af andre tab af funktion teknologier som morpholino oligonucleotider (MOs). Denne uoverensstemmelse kan tilskrives en række årsager, herunder off-target effekter, maternel protein kompensation, en hypomorfe allel23 eller den nyligt opdagede fænomen af genetisk erstatning24,25,26,27. I dette eksempel spurgte vi, om runx1 udtryk blev reduceret eller tabt i lmo4auob100 mutanter siden tidligere offentliggjorte data ved hjælp af en lmo4a MO foreslog, at runx1 er faldet i lmo4a morfer28. Her viste analysen ingen signifikante forskelle i runx1 ekspression mellem vildtype og lmo4auob100 homozygous mutanter3 (Figur 3A,B). Yderligere analyse foretaget af qPCR for enkelt embryoner viste, at der var et lille, men signifikant fald i runx1-ekspression i lmo4auob100 mutanter (figur 3C). Det er således muligt, at billedkvantificering muligvis ikke er i stand til at opdage små forskelle i udtryksniveauer. Alternativt er den manglende forskel mellem genotyper, som vi har opdaget, reel, og qPCR-eksperimenterne registrerer ændringer i runx1-udtryk i andre væv som telenchephalon, hvor både lmo4a og runx1 udtrykkes. Forskere bør altid kontrollere deres resultater med en uafhængig metode som qPCR, men ideelt berigende for væv af interesse ved flow cytometri, for eksempel.
I sjældne tilfælde, hvor ISH har høj baggrund(figur 3D),er pixelintensitetsværdien for dette område så høj, at subtraktion fra signalværdien giver et negativt tal, og i sådanne tilfælde vil disse embryoner blive udelukket fra analysen. Det er vores erfaring, at dette skete i omkring 0,4% af runx1-probedembryoner3, men kan variere mellem eksperimenter, sonder eller partier af reagenser. Selv om det kan være en begrænsning af metoden, den lave frekvens af høj baggrund er meget usandsynligt, at påvirke de samlede resultater.
For at teste effekten af at vælge forskellige områder til baggrundskorrektioner målte vi først pixelintensiteten af runx1 ISH-signalet i 28 hpf-embryoner ved hjælp af forskellige områder til baggrundskorrektioner (figur 4). Der blev udvalgt fire forskellige regioner: to i stammen (R1 og R2), en i blommeregionen (ubestaltede, men sandsynligvis akkumulerede baggrundsfarvning) og en mindre områdes terior til investeringsafkastet (R4, figur 4B). Måling af pixelintensiteten i disse regioner viste en forholdsvis stabil forskel i intensitet mellem investeringsafkast og begge baggrundsområder (figur 4C). R3 viste dog altid meget høje værdier (over dem i investeringsafkastet). Efter inversion og konvertering til 8-bit, æggeblomme regionen synes meget lyse og dermed ikke er egnet til brug som en baggrund korrektion. R2 var tættere på investeringsafkastet, men indeholdt nogle ISH signal, og ved hjælp af det til korrektion faldt den gennemsnitlige pixel intensitet sammenlignet med enten R1 (placeret yderligere dorsally, væk fra ISH signal) eller R4. Enten R1 eller R4 er således passende områder, der kan anvendes til baggrundskorrektion (selv om r4-området er mindre end R1's). Dernæst ønskede vi at sammenligne, hvordan brugen af R1 eller R4 påvirkede resultaterne, når vi sammenligner runx1-udtryk. Til dette, vi krydsede dll4+/- heterozygoter29 og analyseret runx1 udtryk i tilfældigt udvalgte vilde type og dll4-/-embryoner (Figur 4E). Selv om brugen af R1 eller R4 til baggrundskorrektion påvirkede de enkelte værdier, var de gennemsnitlige pixelintensiteter inden for samme genotype ikke væsentligt forskellige (figur 4E). Desuden giver sammenligningen af runx1-udtryk stadig tilsvarende middelintensitetsværdier mellem genotyper, der anvender henholdsvis R1- eller R4-områder som baggrundskorrektion (μR1=16,3 og μR4=18,2). Samlet set konkluderede vi, at selv om valget af baggrundsareal er vigtigt, de vigtigste kriterier er, at det ikke omfatter æggeblomme regioner (tilbøjelige til ophobning af baggrundsfarvning), og at det ikke bør indeholde nogen (specifik) farvning, der kan skævvride pixel intensitet værdier af baggrunden.
Figur 1: Arbejdsgang for den parallelle billedkvantificering skrantificering og genoyping protokol. Embryoner indsamlet fra et incross af fisk heterozygous for en mutant allel er undersøgt for det målte gen med en standard ISH protokol. Efter billeddannelse udvindes genomisk DNA ved hjælp af HotSHOT-protokollen ved at tilføje lysisbufferen direkte til fosteret i et 0,2 ml PCR-rør efterfulgt af en inkubation på 30 min ved 95 °C. Dette DNA anvendes til genoyping af embryonerne ved HJÆLP af PCR, PCR og begrænsningfragmentlængdepolymorfi (RFLP), KASP-analyser eller enhver anden passende metode. Parallelt hermed omvendtes billederne for hvert embryon og konverteres til 8-bit gråtoner. RoI'er af samme form og størrelse, der indeholder ISH-signalet (gul) og baggrunden (blå), vælges og måles manuelt. Målingerne, der er tildelt til tilsvarende genotyper, analyseres statistisk. Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billedkvantificering i runx1 mutanter afslører nedsat indhold af dnmt3bb.1 udtryk af ISH. (A) Eksempel billeder af ISH i 33 hpf vildtype (blå), runx1+/W84X (grøn) og runx1W84X/W84X (orange) embryoner, der viser dnmt3bb.1 udtryk i rygaorta. (B) Pixelintensitetsværdierne for dnmt3bb.1 mRNA i runx1W84X/W84Xembryoner (n=36) reduceres betydeligt sammenlignet med vilde typer (n=32) og heterozygoter (n=62) (ANOVA, p < 0,001). Variationskoefficienterne er henholdsvis 24 %, 22 % og 21 % for vilde typer, heterozygote og mutantgrupper. Blå, grønne og orange datapunkt svarer til eksempelbillederne fra panel A. Stængerne repræsenterer middelværdi ± s.d. ***p<0,001 (Games-Howell post-hoc test). Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Måling af runx1 ekspressionsniveauer af ISH i lmo4auob100mutanter. (A) Repræsentative billeder af ISH for runx1 i 28 hpf vild type (blå), heterozygous (grøn) og lmo4auob100/uob100 (orange) embryoner, der viser udtrykket i dorsal aorta. B) Kvantificering af runx1 mRNA-signalet opdaget af ISH, fra 28 hpf vildtype (n =15), heterozygous lmo4a+/- (het) (n =34) og lmo4auob100/uob100 mutant (n =18) embryoner fra en kobling viser ingen signifikant forskel i runx1 pixel intensitet blandt de forskellige genotyper (ANOVA,> p 0,6). Blå, grønne og orange datapunkt svarer til eksempelbillederne fra panel A. Stængerne repræsenterer gennemsnitlige ± s.d. (C) Boxplots med normaliserede runx1 mRNA-niveauer (2-ΔCt) i enkelt vild type (blå; n=12) og lmo4auob100/uob100 (mut, orange; n=12) embryoner, målt ved qRT-PCR, og som viser nedsat niveau af runx1 i mutanterne sammenlignet med vild type. *p < 0,05(t test). (D) Eksempel på et ISH-eksperiment på et 28 hkf embryo (plettet til runx1, gule pilespidser) viser høj baggrund. Figur tilpasset fra Dobrzycki et al.3Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Effekten af korrektion af baggrundsintensitet på måleresultaterne. (A) Repræsentativt billede af runx1 ISH farvning i en vild type embryo på 28 hpf. (B) Samme billede efter inversion og konvertering til 8-bit. Interesseregionen (ROI) er fremhævet i grøn, og fire forskellige områder, der anvendes til baggrundskorrektion (R1-R4), fremhæves med gult. (C) Målinger af rå pixelintensitet i alle områder, der er vist i punkt B. Bemærk, at intensiteten i R3 (æggeblomme) er konstant højere end det faktiske ISH-signal i investeringsafkastet (n=11). (D) Runx1 udtrykniveauer i INVESTERINGSAFI ved hjælp af R1, R2 og R4 baggrund områder. Områder til ROI-, R1-, R2- og R3~28500 pixel. R4~8500 pixel. Bemærk, at R3-baggrunden ikke blev brugt til denne sammenligning, da baggrundskorrektionen (ROI-R3) konsekvent gav negative værdier. E) Runx1 ekspressionsniveauer i vildtype og dll4-/- mutanter, der enten anvender R1 eller R4 til baggrundskorrektion (n=10 for hver prøve). Statistisk analyse i panel D og E blev udført ved hjælp af en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-test, forudsat at pixelintensitetsværdierne normalt ikke distribueres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Der bør tages et par faktorer i betragtning, når du bruger denne metode til at kvantificere genekspressionen. Billeddannelsesforholdene skal opretholdes under hele forsøget (f.eks. belysning, eksponeringstider og embryonpositionering) for at reducere variabiliteten mellem målingerne. Et kritisk punkt er at undgå overfarvning af prøverne, da forskelle i farvning mellem prøver kan maskeres. F.eks. kunne faldet i VegfA-udtrykket i mangel af Eto2 i Xenopus laevis-embryoner 30 kun påvises ved nøje at overvåge farvning over en 24 timers periode. Det er således god praksis empirisk at bestemme passende farvningsniveauer for hvert gen, der bedst repræsenterer dets udtryk, uden at nå mætning. Overstaining vil også kunstigt øge baggrundspixelintensiteten i de konverterede 8-bit gråtonebilleder og skævvride kvantificeringsresultaterne. I ekstreme tilfælde kan baggrundsniveauet i embryonale væv være højere end ISH-signalet i det valgte investeringsafkast, og disse prøver bør udelukkes fra analysen. Et lignende fænomen blev observeret, da vi testede egnetheden af den ufarvede æggeblomme til baggrundskorrektion (figur 4). Efter inversion og konvertering til 8-bit bliver de mørkere pixels i blommeregionen lysere end ISH-signalet i fosteret og gør baggrundskorrigerede værdier negative. Undgå således at bruge blommen til baggrundskorrektion. Måling af baggrundssignalet i pigmenterede områder i embryonet (f.eks. øjnene eller rygdelen af stammen fra 26/28 hpf og fremefter) vil ligeledes skævvride kvantificeringsresultaterne og bør også undgås. Der er protokoller til rådighed for blegning zebrafisk embryoner, enten før eller efter ISH18 og blegning embryoner ældre end 24 hpf før billeddannelse anbefales.
Da denne metode er afhængig af at måle pixelintensiteten i et defineret område mod en baggrundspixelintensitet i et tilsvarende ikke-plettet område, er det ikke hensigtsmæssigt at kvantificere allestedsnærværende eller næsten allestedsnærværende udtrykte gener, som det er. I stedet er den velegnet til måling af gener med en geografisk begrænset fordeling, hvor et område til måling af baggrundspixelintensitet let kan identificeres. Vores yderligere analyse tyder nu på, at brug af et mindre område (3-4x mindre) for baggrundskorrektion giver lignende resultater til at bruge et tilsvarende areal som for investeringsafkastet. Dette udvider anvendeligheden af metoden til gener udtrykt i bredere rumlige domæner (og kræver dermed større roi'er til intensitetsmålinger), så længe man kan anvende klart ubejdsede områder af fosteret til baggrundskorrektion.
Endelig foreslår vi, at genoyping udføres parallelt eller efter billedet skvantificering for at minimere eksperimentator bias. Beder en anden eksperimentator at gentage kvantitationen på anonymiserede prøver og sammenligne med det første sæt målinger vil også bidrage til at reducere eksperimentatorbias. Hvis de billeder, der skal kvantificeres, er fra en sammenligning mellem behandlinger, der ikke kræver genoyping (f.eks. vildtype vs. kemisk hæmmer eller vildtype vs. MO-knockdown), skal den eksperimentator, der udfører målingerne, blændes til identiteten af Prøve.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke personalet i Biomedical Services i Oxford og Birmingham for fremragende zebrafiskopdræt. TD blev finansieret af en Wellcome Trust Kromosom og Udviklingsmæssige Biologi ph.d.-stipendium (#WT102345/Z/13/Z). R.M. og M.K. blev finansieret af British Heart Foundation (BHF IBSR Fellowship FS/13/50/30436) og er taknemmelige for deres generøse støtte. R.M. anerkender støtte fra BHF Centre of Research Excellence (RE/13/1/30181), Oxford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) | StarLab | A1402-3700 | 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples |
| 3 mL Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4114 | |
| Cavity slides | Brand | BR475535-50EA | |
| Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) | Qimaging | ||
| Eppendorf Microloader tips | Eppendorf | 10289651 | the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol |
| Excel | Microsoft | ||
| F3000 Fiber Optic Cold Light Source | Photonic | ||
| Fiji | |||
| Glycerol | Sigma | G5516-1L | |
| Graphpad Prism 8.01 | GraphPad Software, Inc. | we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS) | |
| HotSHOT alkaline lysis buffer | 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12 | ||
| HotSHOT neutralization buffer | Tris HCl 40 mM, pH 5 | ||
| PBS (10X) pH 7.4 | Thermofisher | 70011044 | |
| Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) | Nikon | ||
| Thermocycler | Thermofisher |
References
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
- Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
- Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
- Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
- Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
- Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
- Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
- Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
- Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
- Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
- Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
- Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
- El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
- Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
- Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
- Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).
