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Developmental Biology

जेब्राफिश में सीटू संकरण धुंधला में जेनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन

Published: January 28, 2020 doi: 10.3791/59956
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3
1MRC Molecular Haematology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, John Radcliffe Hospital, University of Oxford, 2BHF Centre of Research Excellence, 3Institute of Cancer and Genomic Sciences, University of Birmingham
* These authors contributed equally

Summary

जीन संपादन प्रौद्योगिकियों ने शोधकर्ताओं को जेब्राफिश म्यूटेंट उत्पन्न करने में सक्षम बनाया है ताकि वे सापेक्ष आसानी से जीन कार्य की जांच कर सकें । यहां, हम जेब्राफिश में सीटू संकरण संकेतों में समानांतर भ्रूण जीनोनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन करने के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। यह निष्पक्ष दृष्टिकोण सीटू संकरण के आधार पर फेनोठेठ विश्लेषणों में अधिक सटीकता प्रदान करता है।

Abstract

सीटू संकरण (ईश) में एक महत्वपूर्ण तकनीक है जो शोधकर्ताओं को सीटू में एमआरएनए वितरण का अध्ययन करने में सक्षम बनाती है और दशकों से विकासात्मक जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तकनीक रही है। परंपरागत रूप से, अधिकांश जीन अभिव्यक्ति अध्ययनई ईश सिग्नल के दृश्य मूल्यांकन पर भरोसा करते थे, एक विधि जो पूर्वाग्रह से ग्रस्त होती है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां नमूना पहचान एक प्राथमिकताओं को जाना जाता है। हमने पहले इस पूर्वाग्रह को दरकिनार करने और ईश संकेतों का अधिक सटीक मात्रा प्रदान करने के लिए एक विधि पर रिपोर्ट की है। यहां, हम इस विधि को लागू करने के लिए ISH-दाग भ्रूण में ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल गाइड पेश करते हैं और सहसंबंधित है कि उनके इसी जीनोटाइप के साथ । विधि विशेष रूप से मिश्रित जीनोटाइप के नमूनों में स्थानिक रूप से प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति संकेतों की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी है और यह पारंपरिक दृश्य स्कोरिंग विधियों के लिए एक निष्पक्ष और सटीक विकल्प प्रदान करता है ।

Introduction

जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों (जेडएफएन, तालेनऔर हाल ही में, CRISPR/Cas9) की शुरूआत के कारण दुनिया भर की प्रयोगशालाओं की संख्या में भारी वृद्धि हुई है जो विवो में विशिष्ट जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए इन प्रणालियों का उपयोग करते हैं । विशेष रूप से जेब्राफिश आनुवंशिक हेरफेर के लिए उत्तरदायी हैं और हाल के दिनों में1,2में कई म्यूटेंट उत्पन्न हुए हैं । विकासजीवजीवियों के लिए, भ्रूण विकास में जीन म्यूटेशन के फेनोठेठ परिणामों का आकलन करने के लिए सबसे आम तरीकों में से एक सीटू संकरण (ईश) में है। स्पष्ट रूपात्मक दोषों के अभाव में जो अपने जंगली प्रकार या विषमताभाई से होमोज़िगौस म्यूटेंट को अलग करते हैं, विभिन्न जीनोटाइप को सही ढंग से सही ढंग से पहचानने में सक्षम होना आवश्यक है।

शास्त्रीय ISH ब्याज और चयनित मार्कर जीन के जीन के बीच नियामक बातचीत के बारे में निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए संकेत तीव्रता के गुणात्मक विश्लेषण पर निर्भर करता है । हालांकि उपयोगी, इन विश्लेषणों तकनीकी भिन्नता से पीड़ित है और शोधकर्ता अपेक्षाओं से पक्षपातपूर्ण हो सकता है । इस प्रकार, इसी जीनोटाइप के पूर्व ज्ञान के बिना, ईश-दाग भ्रूण इमेजिंग के बाद जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी। इसके बाद एक कुशल डीएनए निष्कर्षण और जीनोटाइपिंग की अनुमति दी गई जिससे हमें जीन अभिव्यक्ति 3 के साथ मात्रात्मक रूप से जीनोटाइप सहसंबंधित करनेकामौका मिला । जबकि ईश के बाद भ्रूण के जीनोटिपिंग का उपयोग4,5से पहले किया गया है, ईश पैटर्न की छवि आधारित मात्रा का उपयोग6,7अध्ययनों के अलावा व्यापक रूप से नहीं किया गया है । सबसे लोकप्रिय विकल्प दृश्य स्कोरिंग या ISH-दाग कोशिकाओं8,9,10की गिनती पर भरोसा करतेहैं,दोनों गरीब प्रजनन क्षमता और शोधकर्ता पूर्वाग्रह से ग्रस्त हैं । यह विधि विशेष रूप से अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ जीन में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो स्थानिक रूप से प्रतिबंधित हैं, जैसे कि रनक्स1 या गैटा2बी,दोनों ने हीमोजेनिक एंडोथेलियम11,12नामक महाधमनी मंजिल कोशिकाओं के प्रतिबंधित सबसेट में व्यक्त किया।

यहां, हमारा उद्देश्य फिजी13का उपयोग करके छवि विश्लेषण द्वारा क्वांटिफिकेशन के कार्यान्वयन के साथ-साथ डीएनए निष्कर्षण और जीनोनोटिंग प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के लिए एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रदान करना है। यह नेत्रहीन हमारे पहले प्रकाशित विधि3वर्णन करने के लिए होती है । हमारी विधि ईश द्वारा पता लगाए गए जीन अभिव्यक्ति में भिन्नता और विशिष्ट जीनोटाइप के लिए जीन अभिव्यक्ति के स्तर के निष्पक्ष असाइनमेंट का सटीक प्रतिनिधित्व करने की अनुमति देती है।

Protocol

पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1 9 86 द्वारा विनियमित किया जाता है और इसे गृह कार्यालय और स्थानीय पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा निकाय द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. छवि ISH दाग भ्रूण

  1. एक ग्लाइसेरोल समाधान (1x पीबीएस बफर में 50%-80%) तैयार करें और समाधान को समरूप करने के लिए मिलाएं (उदाहरण के लिए, कम से कम 5 मिन के लिए रोलर में छोड़ दें)। इस समाधान को कमरे के तापमान पर महीनों तक रखा जा सकता है।
  2. सीटू संकरण14,15,16,17में, भ्रूण को 3 एमएल पाश्चर पिपेट के साथ ग्लाइसेरोल समाधान में स्थानांतरित करें और कम से कम 5 मिन के लिए व्यवस्थित होने के लिए छोड़ दें। यदि 24 एचपीएफ (24 से अधिक उम्र के भ्रूण) की इमेजिंग की जाती है, तो उन्हें18वर्णित के रूप में ब्लीच किया जा सकता है।
    1. इमेजिंग के बाद ईश-दाग भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त पीसीआर ट्यूब तैयार करें और लेबल करें।
  3. 3 mL पाश्चर पिपेट के साथ एक ग्लास डिप्रेशन स्लाइड में अच्छी तरह से नीचे 100% ग्लाइसेरोल जोड़ें।
  4. एक 3 mL पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, एक डिजिटल कैमरा और नीचे और शीर्ष रोशनी से लैस एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत आवश्यक के रूप में ग्लास स्लाइड और ओरिएंट के लिए एक ISH-दाग भ्रूण हस्तांतरण ।
    नोट: इमेजिंग के लिए भ्रूण की स्थिति के लिए जेल लोडिंग पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, लेकिन अन्य उपकरण (जैसे, संदंश, विच्छेदन सुई) समान रूप से पर्याप्त होंगे।
  5. पहले भ्रूण का उपयोग करना, वांछित आवर्धन पर रोशनी और एक्सपोजर समय समायोजित करें। एक ही प्रयोग में भ्रूण के सभी के लिए इन शर्तों का प्रयोग करें (यानी, अगर एक विषमता उत्परिवर्ती इनक्रॉस से ४० भ्रूण इमेजिंग, सुनिश्चित करें कि रोशनी, जोखिम समय और आवर्धन सभी के लिए एक ही हैं) ।
  6. आवश्यकतानुसार कई भ्रूण ों की छवि। प्रत्येक छवि को एक अद्वितीय संख्या के साथ लेबल करें। इमेजिंग के बाद भ्रूण को उसी नंबर से लेबल की पीसीआर ट्यूब/प्लेट में ट्रांसफर कर दें।
    नोट: छवियों को TIF फ़ाइलों के रूप में सहेजा जाना चाहिए, लेकिन अन्य प्रारूप भी पर्याप्त हैं।
    1. जरूरत पड़ने पर पीसीआर ट्यूब/प्लेट में अतिरिक्त ग्लाइसेरोल हटा दें।
      नोट: इस बिंदु पर, भ्रूण कमरे के तापमान पर कई हफ्तों के लिए पीसीआर ट्यूबों में संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. डीएनए निकालें और ईश-दाग भ्रूण जीनोटाइप

नोट: यहां, 95%-100%3की डीएनए निष्कर्षण दक्षता के साथ HoTSHOT विधि19 के आधार पर जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और सस्ती विधि का उपयोग करें ।

  1. इमेजिंग पूरी होने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में क्षारीय लाइसिस बफर (जैसे, होटशॉट) के 40-75 माइक्रोन जोड़ें।
  2. लगभग 30 00 00 के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और बेअसर बफर की एक समान मात्रा जोड़ने से पहले ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रात ऊष्मायन पीसीआर दक्षता में सुधार हो सकता है।
    नोट: इस बिंदु पर, जीनोमिक डीएनए का उपयोग जीनोमिक डीएनए का उपयोग जीनोमिक डीएनए का उपयोग -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा किया जा सकता है या जब तक कि इसकी आवश्यकता न हो जाए।
  3. एक उपयुक्त विधि (जैसे, एचआरएमए, आरएफएलपी)3,20,21 के साथ जीनोटाइप नमूने ब्याज के उत्परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं।
  4. प्रत्येक नमूने के अनुरूप जीनोटाइप पर ध्यान दें (उदाहरण के लिए, स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके)।

3. ईश-दाग भ्रूण की पिक्सेल तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें (फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि विश्लेषण)

  1. सीटू संकरण (ISH) धुंधला संकेत तीव्रता में मात्रा निर्धारित करने के लिए, सभी छवियों को 8-बिट ग्रेस्केल में परिवर्तित करें जैसा कि3वर्णित है। यदि छवियों के रूप में सहेजा गया । TIF फ़ाइलें, बैच रूपांतरण3के लिए फिजी मैक्रो का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, छवियों को अन्य प्रारूपों (जैसे, में परिवर्तित करें। जेपीजी) करने के लिए । उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके TIF और फिर फिजी का उपयोग करके 8-बिट ग्रेस्केल में परिवर्तित करें। सुविधा के लिए, यहां कदम-दर-कदम प्रक्रिया है जो पहले3प्रकाशित की गई थी, कुछ परिवर्तनों के साथ।
  2. फिजी में खुली छवियां और संपादित और जीटी; इनवर्टके साथ छवि उलटा । फिर इमेज टाइप को 8-बिट(इमेज एंड जीटी; टाइप एंड जीटी; 8-बिट)में बदलें ।
  3. बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके, सिग्नल युक्त क्षेत्र के चारों ओर छवि पर मैन्युअल रूप से ब्याज क्षेत्र (आरओआई) आकर्षित करें।
  4. आरओआई प्रबंधक को खोलने के लिए टी दबाएं। आरओआई की तीव्रता को मापने के लिए आरओआई मैनेजर के उपाय कमांड का उपयोग करें। परिणाम खिड़की से एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए मतलब मूल्य कॉपी।
  5. एक ही आरओआई को स्थानांतरित करें, मूल क्षेत्र के समान आकार और आकार सुनिश्चित करें, जेब्राफिश के एक क्षेत्र में किसी भी धुंधला नहीं। पृष्ठभूमि को मापने के लिए चरण 3.4 दोहराएं।
  6. ईश सिग्नल के मतलब पिक्सेल तीव्रता को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक भ्रूण के लिए दाग क्षेत्र से पृष्ठभूमि क्षेत्र के औसत तीव्रता मूल्य घटाना ।
  7. प्रत्येक तीव्रता मूल्य को जीनोटाइप (चरण 2.3 से) में असाइन करें।

4. उचित सांख्यिकीय परीक्षणों के साथ परिणामों का विश्लेषण करें

  1. सामान्य वितरण से किसी भी विचलन की पहचान करने के लिए एक क्यू-क्यू प्लॉट पर सभी मूल्यों को प्लॉट करें।
    नोट: सामान्य वितरण कोलमोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण या शापिरो-विल्क परीक्षण के साथ भी सत्यापित किया जा सकता है। हालांकि, बड़े नमूना आकार के लिए इन परीक्षणों में झूठे सकारात्मक का एक उच्च जोखिम है।
  2. यदि सामान्य वितरण से मजबूत विचलन हैं, तो सभी मूल्यों (एलएन या वर्गर्ट कार्यों का उपयोग करके) को बदल दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे सामान्य रूप से आगे बढ़ने से पहले वितरित किए जाते हैं।
  3. मूल्यों के बीच मतभेदों का विश्लेषण (यदि आवश्यक हो तो बदल) प्रत्येक जीनोटाइप को सौंपा (wt बनाम विषमता बनाम उत्परिवर्ती) के साथ 2-पूंछ ANOVA ९५% विश्वास के स्तर के साथ, एक लेवेन परीक्षण और वेल्च सुधार के साथ विचरण की समानता के लिए लेखांकन । जीनोटाइप की प्रत्येक जोड़ी के बीच जोड़ीगत तुलना के लिए, तुकी (समान विचरण) या खेल-हॉवेल (असमान विचरण) पोस्ट-हॉक टेस्ट का उपयोग करें।
    1. यदि परिवर्तन के बावजूद मूल्यों को सामान्य रूप से वितरित नहीं किया जाता है, तो रैंक मूल्यों और एक के बाद के बीच मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए गैर-पैरामेट्रिक परीक्षण (Kruskall-Wallis) का उपयोग करें, जो पेयरवार के लिए बोनफेरोनी सुधार के साथ एक पोस्ट-हॉक डन की कई तुलना परीक्षण है तुलना.
  4. परिणामों के सर्वोत्तम प्रतिनिधित्व के लिए डॉट भूखंडों के रूप में अबदल मान (चरण 3.6 से) प्लॉट करें।

Representative Results

यहां, हम छवि मात्रा और भ्रूण genotyping के लिए पाइपलाइन के व्यावहारिक आवेदन का वर्णन के रूप में कहीं और प्रकाशित3। विधि के लिए कार्यप्रवाह चित्र 1में दिखाया गया है । इस विधि का उपयोग करने के तरीके को समझाने के लिए, ईश को 33 एचपीएफ भ्रूण में 33 एचपीएफ भ्रूण में एक runx1W84X/+22 इनक्रॉस(चित्रा 2)से dnmt3bb.1 के लिए किया गया था। 130 भ्रूण प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में एक ही रोशनी की स्थिति का उपयोग कर छवि और उन्हें एक अद्वितीय संख्या के साथ लेबलिंग किया गया. इमेजिंग के बाद, प्रत्येक भ्रूण को जीनोनोटिंग के लिए पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया था। इस बिंदु पर, छवि विश्लेषण प्रत्येक छवि के लिए एक पिक्सेल तीव्रता मूल्य विशेषता के लिए किया गया था । जीनोटाइप तो अपनी इसी छवि को सौंपा गया था और पिक्सेल तीव्रता सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अपने जीनोटाइप के अनुसार समूहीकृत मूल्यों । पिछले अवलोकनों 5 के साथ समझौते में runx1W84X/W84X म्यूटेंट(चित्रा 2ए, बी)3में dnmt3bb.1 अभिव्यक्ति में कमी का पता चला। दिलचस्प बात यह है कि runx1W84X/+ विषमता भ्रूण dnmt3bb.1 अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया(चित्रा 2ए, बी)अपने जंगली प्रकार के भाई बहन की तुलना में, सुझाव है कि Runx1 की एक प्रति उचित स्तर पर dnmt3bb.1 अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त है ।

कई जेब्राफिश म्यूटेंट एक भ्रूणीय फेनोटाइप दिखाने में विफल होते हैं जिसे अन्यथा मॉर्फोलिनो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एमओ) जैसी फ़ंक्शन प्रौद्योगिकियों के अन्य नुकसान का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। इस विसंगति को ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स, मातृ प्रोटीन मुआवजा, हाइपोमॉर्फिक एलील23 या आनुवंशिक क्षतिपूर्ति24,25,26,27की हाल ही में खोजी गई घटना सहित कई कारणों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है । इस उदाहरण में, हमने पूछा कि क्या एक lmo4a MO का उपयोग करके पहले प्रकाशित डेटा के बाद से lmo4auob100 म्यूटेंट में runx1 अभिव्यक्ति कम या खो गई थी, सुझाव दिया है कि runx1 lmo4a morphants28में कमी आई है । यहां, विश्लेषण जंगली प्रकार और lmo4auob100 homozygous म्यूटेंट3 (चित्रा 3ए, बी)के बीच runx1 अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर से पता चला । एकल भ्रूण क्यूपीसीआर द्वारा इसके विश्लेषण से पता चला है कि lmo4auob100 म्यूटेंट(चित्रा 3सी)में runx1 अभिव्यक्ति में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण कमी आई थी। इस प्रकार, यह संभव है कि छवि परिमाण अभिव्यक्ति के स्तर में छोटे मतभेदों का पता लगाने में सक्षम नहीं हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, हमारे द्वारा पता लगाए गए जीनोटाइप के बीच अंतर की कमी वास्तविक है और क्यूपीसीआर प्रयोग टेलीन्फेफलन जैसे अन्य ऊतकों में runx1 अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगा रहे हैं जहां एलएम4ए और रनक्स1 दोनों व्यक्त किए जाते हैं। शोधकर्ताओं को हमेशा क्यूपीसीआर जैसी स्वतंत्र विधि के साथ अपने परिणामों को सत्यापित करना चाहिए, लेकिन उदाहरण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा ब्याज के ऊतकों के लिए आदर्श रूप से समृद्ध होना चाहिए।

दुर्लभ उदाहरणों में जहां ईश उच्च पृष्ठभूमि है(चित्रा 3डी),इस क्षेत्र के पिक्सेल तीव्रता मूल्य इतना अधिक है कि संकेत मूल्य से घटाव एक नकारात्मक संख्या पैदा करता है और ऐसे उदाहरणों में उन भ्रूण ों को विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा । हमारे अनुभव में, यह runx1के बारे में ०.४% में हुई-भ्रूण3 की जांच की, लेकिन प्रयोगों, जांच या अभिकर्मकों के बैचों के बीच भिन्न हो सकते हैं । हालांकि यह विधि की एक सीमा हो सकती है, उच्च पृष्ठभूमि की कम आवृत्ति समग्र परिणामों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है।

पृष्ठभूमि सुधार के लिए विभिन्न क्षेत्रों का चयन करने के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने पृष्ठभूमि सुधार(चित्रा 4)के लिए विभिन्न क्षेत्रों का उपयोग करते हुए 28 एचपीएफ भ्रूण में रनक्स1 ईश सिग्नल की पिक्सेल तीव्रता को पहली बार मापा। चार विभिन्न क्षेत्रों का चयन किया गया: ट्रंक क्षेत्र में दो (R1, और R2), जर्दी क्षेत्र में एक (अनदाग, लेकिन पृष्ठभूमि धुंधला जमा होने की संभावना) और आरओआई (R4, चित्रा 4बी)के लिए एक छोटे क्षेत्र पूर्वकाल । इन क्षेत्रों में पिक्सेल तीव्रता को मापने आरओआई और या तो पृष्ठभूमि क्षेत्र(चित्रा 4सी)के बीच तीव्रता में अपेक्षाकृत स्थिर अंतर दिखाया गया । हालांकि, R3 हमेशा बहुत उच्च मूल्यों (आरओआई में उन लोगों के ऊपर) दिखाया । 8-बिट में उलटा और रूपांतरण के बाद, जर्दी क्षेत्र बहुत उज्ज्वल दिखाई देता है और इस प्रकार पृष्ठभूमि सुधार के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है। R2 आरओआई के करीब था, लेकिन कुछ ईश सिग्नल निहित था, और सुधार के लिए इसका उपयोग करने से या तो R1 (आगे dorsally स्थित है, ISH संकेत से दूर) या R4 के साथ तुलना में मतलब पिक्सेल तीव्रता में कमी आई । इस प्रकार, या तो R1 या R4 उपयुक्त क्षेत्र हैं जिनका उपयोग पृष्ठभूमि सुधार के लिए किया जा सकता है (R4 के क्षेत्र के बावजूद R1 की तुलना में छोटा होना)। इसके बाद, हमने तुलना करना चाहा कि रनक्स1 अभिव्यक्ति की तुलना करते समय R1 या R4 का उपयोग करने से परिणाम ों को कैसे प्रभावित किया गया। इसके लिए, हमने dll4+/-विषमताओं 29 को पार किया और बेतरतीब ढंग से चयनित जंगली प्रकार और dll4-/-भ्रूण(चित्रा 4ई)में runx1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया । हालांकि पृष्ठभूमि सुधार के लिए R1 या R4 का उपयोग कर व्यक्तिगत मूल्यों को प्रभावित किया, एक ही जीनोटाइप के भीतर मतलब पिक्सेल तीव्रता काफी अलग नहीं थे(चित्र4ई)। इसके अलावा, runx1 अभिव्यक्ति की तुलना अभी भी पृष्ठभूमि सुधार के रूप में या तो R1 या R4 क्षेत्रों का उपयोग कर जीनोटाइप के बीच समान मतलब तीव्रता मूल्यों की पैदावार (μR1=16.3 और μR4= 18.2, क्रमशः) । एक साथ लिया, हम निष्कर्ष निकाला है कि हालांकि पृष्ठभूमि क्षेत्र का चुनाव महत्वपूर्ण है, मुख्य मापदंड यह है कि यह जर्दी क्षेत्रों (पृष्ठभूमि धुंधला के संचय के लिए प्रवण) शामिल नहीं है और यह कि किसी भी (विशिष्ट) धुंधला है कि पृष्ठभूमि के पिक्सेल तीव्रता मूल्यों तिरछा हो सकता है शामिल नहीं होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: समानांतर छवि मात्रा और genotyping प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह । एक उत्परिवर्ती एलील के लिए मछली विषमता के एक इनक्रॉस से एकत्र भ्रूण एक मानक ISH प्रोटोकॉल के साथ मापा जीन के लिए जांच कर रहे हैं । इमेजिंग के बाद 02 एमएल पीसीआर ट्यूब में लिसिस बफर को सीधे भ्रूण में जोड़कर हॉटशॉट प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकाला जाता है, जिसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन का ऊष्मायन होता है। इस डीएनए का उपयोग पीसीआर, पीसीआर और प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी), केएसपी परखया या किसी अन्य उपयुक्त विधि द्वारा भ्रूण के जीनोटिपिंग के लिए किया जाता है। समानांतर में, प्रत्येक भ्रूण के लिए छवियों को उलटा और 8-बिट ग्रेस्केल में परिवर्तित किया जाता है। ईश सिग्नल (पीला) और पृष्ठभूमि (नीला) युक्त समान आकार और आकार के आरओआई को मैन्युअल रूप से चुना और मापा जाता है। इसी जीनोटाइप को सौंपे गए माप, सांख्यिकीय विश्लेषण किए जाते हैं। Dobrzycki एट अलसेअनुकूलित चित्रा 3कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आरunx1 म्यूटेंट में छवि quantitation ISH द्वारा dnmt3bb.1 अभिव्यक्ति के कम स्तर से पता चलता है । (क)३३ एचपीएफ जंगली प्रकार (नीला), runx1+/W84X (हरा) और runx1W84X/W84X (नारंगी) भ्रूण में ISH की उदाहरण छवियां, पृष्ठीय महाधमनी में dnmt3bb.1 अभिव्यक्ति दिखा । (ख) रनक्स1W84X/W84Xभ्रूण (एन = 36) में dnmt3bb.1 mRNA के पिक्सेल तीव्रता मूल्यों में जंगली प्रकार (एन = 32) और हेट्रोजोजिगोट्स (एन = 62) (एनोवा, पी एंड एलटी; 0.001) की तुलना में काफी कमी आई है। भिन्नता के गुणांक क्रमशः जंगली प्रकार, विषमयोजिगोट और उत्परिवर्ती समूहों के लिए 24%, 22% और 21% हैं। ब्लू, ग्रीन और ऑरेंज डेटा पॉइंट पैनल ए से उदाहरण छवियों के अनुरूप है। सलाखों का मतलब ± s.d. ***पी& 0.001 (खेल-Howell पोस्ट-हॉक टेस्ट) का प्रतिनिधित्व करते हैं । Dobrzycki एट अलसेअनुकूलित चित्रा 3कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: lmo4auob100म्यूटेंट में ISH द्वारा runx1 अभिव्यक्ति के स्तर को मापने। (क)28 एचपीएफ जंगली प्रकार (नीला), विषमजीवन (हरा) और lmo4auob100/uob100 (नारंगी) भ्रूण में runx1 के लिए ISH के प्रतिनिधि छवियों, पृष्ठीय महाधमनी में अभिव्यक्ति दिखा । (ख) रनक्स1 एमआरएनए सिग्नल का परिमाणीकरण, ईश द्वारा पता लगाया, 28 एचपीएफ जंगली प्रकार (एन = 15), हेट्रोजिगोस lmo4a+/-(हेट) (n=34) और lmo4auob100/uob100 म्यूटेंट (n= 18) भ्रूण से पता चला है कि विभिन्न जीनोटाइप (एनोवा,> पी 0.6) के बीच runx1 पिक्सेल तीव्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है । ब्लू, ग्रीन और ऑरेंज डेटा पॉइंट पैनल ए से उदाहरण छवियों के अनुरूप है। सलाखों का अर्थ ± एस.डी.(सी)बॉक्सप्लॉट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एकल जंगली प्रकार (नीला; एन = 12) और lmo4auob100/uob100 (म्यूट, नारंगी; एन = 12) भ्रूण में सामान्यीकृत runx1 mRNA स्तर (2-1Ct) प्रदर्शित करते हैं, जो क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मापा जाता है, जो जंगली प्रकार की तुलना में म्यूटेंट में रनक्स1 का स्तर कम दिखाता है । *पी एंड एलटी; 0.05(टी टेस्ट) । (घ)उच्च पृष्ठभूमि दिखाने वाले 28 एचपीएफ भ्रूण (रनक्स1,पीले तीरके के लिए दाग) पर एक ISH प्रयोग का उदाहरण। Dobrzycki एट अलसेअनुकूलित चित्रा 3कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माप परिणामों पर पृष्ठभूमि तीव्रता सुधार का प्रभाव। (A)28 एचपीएफ पर एक जंगली प्रकार के भ्रूण में runx1 ISH धुंधला की प्रतिनिधि छवि । (ख)उलटा और रूपांतरण के बाद एक ही छवि 8-बिट के लिए । ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को हरे रंग में हाइलाइट किया गया है और पृष्ठभूमि सुधार (R1-R4) के लिए उपयोग किए जाने वाले चार विभिन्न क्षेत्रों को पीले रंग में हाइलाइट किया जाता है। (ग)पैनल बी नोट में दिखाए गए सभी क्षेत्रों में कच्चे पिक्सेल तीव्रता माप आरओआई (एन = 11) में वास्तविक ईश सिग्नल की तुलना में लगातार अधिक है। (D)R1, R2 और R4 पृष्ठभूमि क्षेत्रों का उपयोग कर आरओआई में Runx1 अभिव्यक्ति का स्तर । आरओआई, आर 1, आर 2 और आर 3 ~ 28500 पिक्सल के लिए क्षेत्र; R4 ~ 8500 पिक्सल। ध्यान दें कि R3 पृष्ठभूमि पृष्ठभूमि सुधार (आरओआई-R3) के रूप में इस तुलना के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था लगातार नकारात्मक मूल्यों मिले । (ई)जंगली प्रकार में Runx1 अभिव्यक्ति का स्तर और dll4-/-पृष्ठभूमि सुधार के लिए R1 या R4 का उपयोग कर म्यूटेंट (प्रत्येक नमूने के लिए n =10) । पैनलों डी और ई में सांख्यिकीय विश्लेषण एक गैर-पैरामेट्रिक क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके किया गया था, यह मानते हुए कि पिक्सेल तीव्रता मूल्य सामान्य रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस विधि का उपयोग करते समय कुछ कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। इमेजिंग स्थितियों को मापन के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पूरे प्रयोग (उदाहरण के लिए रोशनी, एक्सपोजर समय और भ्रूण स्थिति) में बनाए रखा जाना चाहिए। एक महत्वपूर्ण बिंदु नमूनों के अधिक दाग से बचने के लिए है, के रूप में नमूनों के बीच धुंधला में मतभेद नकाबपोश हो सकता है । उदाहरण के लिए, Xenopus laevis भ्रूण30 में Eto2 की अनुपस्थिति में VegfA अभिव्यक्ति में कमी केवल ध्यान से एक 24 घंटे की अवधि में धुंधला निगरानी द्वारा पता लगाया जा सकता है । इस प्रकार, प्रत्येक जीन के लिए अनुभवजन्य रूप से पर्याप्त धुंधला स्तर निर्धारित करना अच्छा अभ्यास है जो संतृप्ति तक पहुंचने के बिना अपनी अभिव्यक्ति का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है। ओवरस्नेटिंग भी कृत्रिम रूप से परिवर्तित 8-बिट ग्रेस्केल छवियों में पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता में वृद्धि होगी और क्वांटेशन परिणामों को तिरछा कर देगा। चरम मामलों में, भ्रूण ऊतकों में पृष्ठभूमि का स्तर चयनित आरओआई में ईश सिग्नल से अधिक हो सकता है और इन नमूनों को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। ऐसी ही एक घटना देखी गई जब हमने पृष्ठभूमि सुधार(चित्रा 4)के लिए अनदाग जर्दी की उपयुक्तता का परीक्षण किया। उलटा और रूपांतरण के बाद 8-बिट जर्दी क्षेत्र में गहरे रंग के पिक्सल भ्रूण में ISH संकेत से उज्जवल हो जाते हैं और पृष्ठभूमि को नकारात्मक मूल्यों को सही करते हैं। इस प्रकार, पृष्ठभूमि सुधार के लिए जर्दी के उपयोग से बचें। भ्रूण में वर्णित क्षेत्रों में पृष्ठभूमि संकेत को मापने (जैसे, आंखें या 26/28 एचपीएफ के बाद से ट्रंक का पृष्ठीय हिस्सा) समान रूप से मात्राकरण परिणामों को तिरछा कर देगा और इससे भी बचा जाना चाहिए। वहां जेब्राफिश भ्रूण ब्लीचिंग के लिए उपलब्ध प्रोटोकॉल हैं, या तो पहले या ISH18 के बाद और विरंजन इमेजिंग से पहले 24 hpf से पुराने भ्रूण ब्लीचिंग की सिफारिश की है ।

क्योंकि यह विधि एक समकक्ष गैर-दाग क्षेत्र में पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता के खिलाफ एक परिभाषित क्षेत्र में पिक्सेल तीव्रता को मापने पर निर्भर करती है, यह सर्वव्यापी या निकट-सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए गए जीन की मात्रा के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके बजाय, यह अच्छी तरह से एक स्थानिक प्रतिबंधित वितरण के साथ जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए अनुकूल है, जहां पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए एक क्षेत्र आसानी से पहचाना जा सकता है । हमारे अतिरिक्त विश्लेषण से अब पता चलता है कि पृष्ठभूमि सुधार के लिए एक छोटे क्षेत्र (3-4x छोटे) का उपयोग करआरओआई के समकक्ष क्षेत्र का उपयोग करने के समान परिणाम देता है। यह व्यापक स्थानिक डोमेन में व्यक्त जीन के लिए विधि की प्रयोज्यता का विस्तार करता है (और इस प्रकार तीव्रता माप के लिए बड़े ROIs की आवश्यकता होती है), जब तक कोई पृष्ठभूमि सुधार के लिए भ्रूण के स्पष्ट रूप से अनदाग क्षेत्रों का उपयोग कर सकता है।

अंत में, हमारा सुझाव है कि प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने के लिए समानांतर या छवि परिमाण के बाद जीनोटिपिंग किया जाए। एक दूसरे प्रयोगकर्ता से अनाम नमूनों पर मात्रा दोहराने और माप के पहले सेट के साथ तुलना करने के लिए पूछना भी प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करने में मदद करेगा । यदि मात्रा निर्धारित की जाने वाली छवियां उन उपचारों के बीच तुलना से हैं जिन्हें जेनोटाइपिंग (जैसे, जंगली प्रकार बनाम रासायनिक अवरोधक या जंगली प्रकार बनाम एमओ नॉकडाउन) की आवश्यकता नहीं होती है, तो माप न करने वाले प्रयोगकर्ता को पहचान के लिए अंधा किया जाना चाहिए नमूना.

Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम ऑक्सफोर्ड और बर्मिंघम में बायोमेडिकल सर्विसेज में कर्मचारियों को उत्कृष्ट जेब्राफिश पालन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । टी.डी. एक वेलकम ट्रस्ट क्रोमोसोम और विकासात्मक जीव विज्ञान पीएचडी छात्रवृत्ति (#WT102345/जेड/13/जेड) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । आरएम और एमके को ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन (बीएचएफ IBSR फैलोशिप एफएस/13/50/30436) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और वे अपने उदार समर्थन के लिए आभारी हैं । आर.एम. बीएचएफ सेंटर ऑफ रिसर्च एक्सीलेंस (आरई/13/1/30181), ऑक्सफोर्ड से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes (8-strips with lids) StarLab A1402-3700 96-well plates are equally appropriate for sample handling but beware of cross contamination between samples
3 mL Pasteur pipettes Alpha Laboratories LW4114
Cavity slides Brand BR475535-50EA
Digital Camera (Qimaging Micropublisher 5.0) Qimaging
Eppendorf Microloader tips Eppendorf 10289651 the tips are used to orient the embryos for imaging in glycerol
Excel Microsoft
F3000 Fiber Optic Cold Light Source Photonic
Fiji
Glycerol Sigma G5516-1L
Graphpad Prism 8.01 GraphPad Software, Inc. we prefer to use Graphpad, but other statistics software packages are also suitable (e.g. SigmaPlot or SPSS)
HotSHOT alkaline lysis buffer 25 mM NaOH, 0.2 mM disodium EDTA, pH 12
HotSHOT neutralization buffer Tris HCl 40 mM, pH 5
PBS (10X) pH 7.4 Thermofisher 70011044
Stereomicroscope with illumination stand (Nikon SMZ800N) Nikon
Thermocycler Thermofisher

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References

  1. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  2. Varshney, G. K., et al. CRISPRz: a database of zebrafish validated sgRNAs. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D822-D826 (2016).
  3. Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Bonkhofer, F., Patient, R., Monteiro, R. An optimised pipeline for parallel image-based quantification of gene expression and genotyping after in situ hybridisation. Biology Open. 7 (4), bio031096 (2018).
  4. Bresciani, E., et al. CBFbeta and RUNX1 are required at 2 different steps during the development of hematopoietic stem cells in zebrafish. Blood. 124 (1), 70-78 (2014).
  5. Gore, A. V., et al. Epigenetic regulation of hematopoiesis by DNA methylation. Elife. 5, e11813 (2016).
  6. Fan, Y., et al. Tissue-Specific Gain of RTK Signalling Uncovers Selective Cell Vulnerability during Embryogenesis. PLoS Genetics. 11 (9), e1005533 (2015).
  7. Wen, B., et al. GATA5 SUMOylation is indispensable for zebrafish cardiac development. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (7), 1691-1701 (2017).
  8. Espin-Palazon, R., et al. Proinflammatory signaling regulates hematopoietic stem cell emergence. Cell. 159 (5), 1070-1085 (2014).
  9. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Developmental Biology. 311 (2), 623-635 (2007).
  10. Genthe, J. R., Clements, W. K. R-spondin 1 is required for specification of hematopoietic stem cells through Wnt16 and Vegfa signaling pathways. Development. 144 (4), 590-600 (2017).
  11. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  12. Butko, E., et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 142 (6), 1050-1061 (2015).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Lleras Forero, L., et al. Segmentation of the zebrafish axial skeleton relies on notochord sheath cells and not on the segmentation clock. Elife. 7, (2018).
  15. Jowett, T., Yan, Y. L. Double fluorescent in situ hybridization to zebrafish embryos. Trends in Genetics. 12 (10), 387-389 (1996).
  16. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  17. Narayanan, R., Oates, A. C. Detection of mRNA by Whole Mount in situ Hybridization and DNA Extraction for Genotyping of Zebrafish Embryos. Bio-protocol. , e3193 (2019).
  18. Monteiro, R., Pouget, C., Patient, R. The gata1/pu.1 lineage fate paradigm varies between blood populations and is modulated by tif1gamma. EMBO JOURNAL. 30 (6), 1093-1103 (2011).
  19. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  20. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  21. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
  22. Jin, H., et al. Definitive hematopoietic stem/progenitor cells manifest distinct differentiation output in the zebrafish VDA and PBI. Developement. 136 (4), 647-654 (2009).
  23. Stainier, D. Y. R., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), e1007000 (2017).
  24. El-Brolosy, M. A., Stainier, D. Y. R. Genetic compensation: A phenomenon in search of mechanisms. PLoS Genetics. 13 (7), e1006780 (2017).
  25. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  26. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  27. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  28. Meier, N., et al. Novel binding partners of Ldb1 are required for haematopoietic development. Development. 133 (24), 4913-4923 (2006).
  29. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  30. Leung, A., et al. Uncoupling VEGFA functions in arteriogenesis and hematopoietic stem cell specification. Developmental Cell. 24 (2), 144-158 (2013).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 155 गेनोटिपिंग सीटू संकरण जेब्राफिश म्यूटेंट पूर्वाग्रह छवि परिमाणीकरण में
जेब्राफिश में सीटू संकरण धुंधला में जेनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन
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Dobrzycki, T., Krecsmarik, M., Monteiro, R. Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish. J. Vis. Exp. (155), e59956, doi:10.3791/59956 (2020).

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